JPH01109262A - 免疫測定用抗体及びそれを用いる免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫測定用抗体及びそれを用いる免疫測定法、
更に詳しくは体液中のエストロゲンホルモン及びその代
謝産物を同時に測定するための免疫測定用抗体及びそれ
を用いる免疫測定法に関するものである。

〔従来の技術〕

エストロゲンホルモントハ卵胞ホルモンであるエストロ
ン（以下Ｅ１と略す）、エストラジオール（以下Ｂ２と
略す）、及びエストリオール（以下Ｅ３と略す）の総称
である。これらは主として女性の卵胞で産生され、体液
中、％に血中及び尿中のエストロゲン及びその代謝産物
を測定することは、女性の卵巣機能、ｊｌＫ卵胞発育の
状１１Ｉ″を知るために意識があり、ｔた排卵に先だっ
てその体液中の量が増加することから、排卵期の予測に
も有効であり、不妊症治療のための有用な指標と言われ
ている。エストロゲンの測定は、かつてはコーパー反応
（Ｋｏｂｅｒｒｅ−ａｃｔｉｏｎ）を利用した比色法ま
たは蛍光法で測定されていたが、最近では、抗原抗体反
応を利用した免疫測定法が用いられている。

抗原抗体反応を利用した免疫学的測定は、１９５９年パ
ーソン（Ｂｅｒｓｏｎ、）とヤ、０−　（Ｙａｌｏｗ）
Ｋよって開発されたラジオイムノアッセイ法に始まり、
その後エンザイムイムノアッセイ法や、ラテックス凝集
阻止法等様々な測定法が開発されてきた。これらの方法
は、目的とする抗原に対する抗体の高い！！ｌ１ＪＩ性
と、その高い測定感度の九めに、臨床検査の分！で幅広
く利用されている。体液中のエストロゲンも上記の２ジ
オイムノアツセイやラテックス凝集阻止反応といった免
疫測定法によりて測定され、産婦人科の領域で有用な卵
巣機能や胎児機能の指標として利用されている。

エストロゲンに限らず、一般に免疫測定法においては、
用いる抗体のＩＦ＃異性が大きな意味を持りている。つ
ｔり抗体の特異性が低い場合には、−抗体が非特異的に
目的とする被測定物質以外の物質とも反応してしまうた
めに測定値の信頼性が損なわれてしまう。そこで抗体の
特異性を向上させるために、様々な試みが行われてきた
。高分子物質の免疫測定法におけるモノクローナル抗体
の利用がその代表的な例である。エストロゲンのような
分子量の小さい物質は、ハプテンと呼ばれ、その１１免
疫用動物に免疫しても、生体内では、異物として認識さ
れず、抗体紘産生されないので、免疫用担体と呼ばれる
免疫用動物とは興なる動物から得た高分子物質とハプテ
ンの誘導体とを化学的に結合させることによって得たい
わゆる合成多価抗原を免疫用動物に免疫し、抗体を得て
いる。この免疫用担体とハゲテンとの結合方法及び、結
合位置によって、得られる抗体の特異性は大きく異なっ
てくる危めに１個々のハプテン抗原について様々な検討
が試みられている。その結果、例えば特公昭６２−２３
８２１号公報に記載されている抗エストラジオールー１
７βグルクロナイド抗体のような分子構造のわずかな違
いを認識するＩＦ＃異性の高い抗体の作製が可能となっ
た。その様な被測定物質に対する高い特異性を有する抗
体を用いた免疫測定法は、目的とする被測定物質の生体
内における動態を把握する上から極めて有効な手段とな
っている。このような免疫測定法の具体例を挙げると、
例えばエストロゲンホルモンの代置産物の一種で乃るエ
ストリオール−１６α−グルクロナイド（以下Ｅ５−１
６Ｇと略す）は、胎児の副腎で合成されたデヒドロエピ
アノドロステロンから４１？興的に産生されるエストリ
オールが代謝され妊婦尿中に排泄されたものであるが、
この物質を特異性の高い抗体を用いた免疫測定法で測定
することにより、由来が異なるが、構造の似たエストロ
ンやエストラジオールの代謝産物に影響されない結果が
得られ、周産期における胎児発育の指標として利用され
ている。

エストロゲンはまた、前述し次通り女性の卵胞でも産生
される。その中でも生物活性は、Ｂ２が最も強（Ｆ８Ｈ
（卵胞刺激ホルモン）、ＬＨ（黄体形成ホルモン）分泌
調節に関与しており、Ｅｌは、生体内で可逆的にＢ２１
１Ｃ変化する。Ｂ３は、Ｅｌ、Ｂ２の代謝物と考えられ
ている。そしてこれらエストロゲンは血中で遊離型及び
抱合体として存在しておシ、尿中には全て抱合体となっ
て排泄される。抱合体には様々な種類が存在している。

つまシＢ１にはＥｌ−３−グルクロナイド（以下Ｇと略
す。）、Ｂ１−１−サルフェート（以下Ｓと略す）があ
る。Ｂ２にはＢ２−３０．Ｂ２−１７βＧ、Ｂ２−５８
ＸＥ２−１７８゜Ｂ２−５８−１７Ｇなどがある。Ｂ５
にはＢ　Ｓ　−Ｓ　Ｇ。

Ｅ３−ｔ　６αＧ、Ｅ３−５８．Ｅ３−１６αＳ％Ｅ５
−５８−１６αＧ、８５−３Ｇ−１６αＳなどがある。

これらの代謝産物のうちの主なものＫついては、免疫測
定法によって測定され〔例えばジャーナル　オブ　ステ
ロイド　バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　８
ｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　Ｖｏｌ、
　１７．　ｐ、　６９５−７０２、　（１９８２）参照
〕、個々の代謝産物が性周期においてどのような動態を
示すかが、明らかになってきた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

前述したエストロゲンホルモン三種、及ヒソの多様な代
謝産物の代謝動態には大きな個人差がある。従って性周
期におけるエストロゲンの測定の場合は、これらのホル
モン及びその代置産物のうちのひとつを測定してその結
果から生体内でのエストロゲン動態を判断しようとする
のは困難な場合がある。つまり何種類かの主たる代謝産
物を測定することによってはじめて生体内でのエストロ
ゲンの動態が総合的に把握可能となるわけである。

しかして、エストロゲンホルモンはその抱合体において
ステロイドのフェナントレン骨格に対してかなシ大きな
グルクロン酸または硫酸が結合しているために、それに
対する抗体は他のステロイドとの交差反応性を有する可
能性があシ、エストロゲンホルモンのＩ＃異的な測定は
非常に囃しく、従来の単一抗体くよる免疫測定法を用い
次場合には生体内におけるエストロゲンの動態を容易に
正確に把握することはできなかつ九〇 本発明は上記従来技術における問題点を解決するための
ものでアリ、その目的とするところは体液中の二種以上
のエストロゲンホルモン及びその代謝産物を同時に簡便
迅速に定性及び／または定量することができる免疫測定
用抗体及びそれを用いる免疫測定法を提供することにあ
る。

〔問題点を解決するための手段〕

すなわち本発明の体液中の複数のエストロゲンホルモン
及びその代謝産物を同時に測定するための免疫測定用抗
体は、エストロン又はその抱合体に対する抗体、エスト
ラジオール又はその抱合体に対する抗体、エストリオー
ル又はその抱合体に対する抗体の中から選ばれた二種類
以上の抗体を固相に固定化してなることを特徴とする。

本発明の免疫測定用抗体の好ましい実施態様としては以
下の抗体が挙げられる。

（１）　　抱合体がグルクロン酸抱合体、硫酸抱合体、
及びグルクロン酸と硫酸の複合抱合体であることを特徴
とする免疫測定用抗体。

（１：）　　固相が高分子重合体粒子であることを特徴
とする免疫測定用抗体。

（ｔｉｔ）　　各々の抗体を対応する抗原による測定感
度が互いに等しくなる比率で固相に固定化してなること
を特徴とする免疫測定用Ｍ　１４゜また、本発明の免疫
測定法は、エストロン又はその抱合体に対する抗体、エ
ストラジオール又はその抱合体に対する抗体、エストリ
オール又はその抱合体に対する抗体の中から選ばれ次二
種類以上の抗体を固相に固定化してなる免疫測定用抗体
と、対応する標識化抗原もしくは合成多価抗原とを用い
て、体液中の複数のエストロゲンホルモン及びその代謝
産物を同時に測定することを特徴とする。

本発明の免疫測定法の好ましい実施態様としては以下の
方法が挙げられる。

ＧＶ）　　抱合体がグルクロン酸抱合体、硫酸抱合体、
及びグルクロン酸と硫酸の複合抱合体であることを特徴
とする免疫測定法。

（曽　固相が高分子重合体粒子であることを特徴とする
免疫測定法。

（ＶＤ　　各々の抗体を対応する抗原による測定感度が
互いに等しくなる比率で固相に固定化してなることを特
徴とする免疫測定法。

６／′ｉＩｌ榎識化抗原の標識化が酵素、放射性物質、
蛍光物質まｔは発光物質によりなされることを特徴とす
る免疫測定法。

先に述べた従来技術の問題点を解決する次めに１本発明
者は、目的とするエストロゲン及び、その代謝物に対す
る特異性の高い抗体を二種類以上同時に用いることを検
討した。以下に詳しく述べる通シラテックス凝集反応に
おいては、抗体結合ラテックス粒子に結合させる抗体の
種類を従来の一種類から二種類以上とした。それに伴っ
て凝集用抗原の種類を抗体と同種類用意して反応させる
ことによシ、生体内におけるエストロゲン動態の推定を
より確実にすることが可能となった。また、標識化抗原
を用いた免疫測定法においては、固相に固定化する抗体
の種類を従来の一種類から二種類以上とし、同時に反応
系に用いる標識化抗原の種類も抗体と同種類用意するこ
と１ｔｃｘｖ、ラテックス凝集阻止反応と同様に生体内
におけるエストロゲン動態の推定をより確実にすること
が可能となった。

用いる抗体の種類は二種類以上であればよく、その種類
は問わないが、あまり種類が多いと測定感度のコントロ
ールが困難となるので、自ずから、その種類は限定され
てくる。すなわち、目的に合り九代謝物同志を組み合わ
せることが良好な結果につながりでくる。例えば、Ｅｌ
−３０、Ｐｉｌ−ｓ８を用いた場合は、Ｅｌの尿中代謝
　。

産物全てが測定されるので、生体中でのＥｌの動態が把
握できるし、量的に多数を占めるＥ５−１６０Ｓ１１−
４０．　Ｅ２−３Ｇを組み合わせるとほとんどの尿中エ
ストロゲン−グルクロナイドが測定されるととくなる。

一般に抗体の抗原に対する親和性（アフィニティー）と
、γグロブリン中の特異的抗体量（タイター）は、抗体
の作製に用いる免疫用抗原や、免疫する動物の種類、及
びその個体、あるいは免疫期間によって大きく異なって
くる。

そこで別種の抗体を同時に反応系に用いた場合は、４１
？に抗体の７フイニテイーとタイターによる測定感度の
差が現れてくる。従って本発明において定量性をもたせ
るためＫは、個々の被測定物質に対する測定感度を一定
Ｋ１１ｍ節する必要性が要求されるが、本発明者は反応
系中の個々の抗体と抗原の量比のバランスをとることに
よりこの点を解消し次。

また本発明の本来の目的が、生体中におけるエストロゲ
ン動態全体を同時に把握しようということであることか
ら定性的測定法に応用することもできる。先に述べた通
り、エストロゲン三種のうち生物活性はＥ２が最も高い
ことが一般に知られている。その重要な代謝産物である
エストラジオール−１７β−グリクロナイドは、全エス
トロゲン代謝産物の中では比較的排泄量が少ないもので
ある。この様な排泄量は少ないが、相対的な臨床的意義
はより重要である代謝産物については、相対的な測定感
度を上げることにより、４！に女性の性周期の排卵の前
後における微妙なエストロゲン動態の把握が可能となる
。以下に各免疫測定法への本発明の具体的な応用例を示
す。

ｔ　凝集阻止反応への応用 凝集阻止反応とは、高分子重合体粒子に物理吸着あるい
は化学的結合によって被測定物質に対する抗体を結合さ
せた抗体結合粒子と、被結合物質を高分子担体（以下担
体と略す）Ｋ化学的に結合させた凝集用多価抗原とが抗
原抗体反応によって凝集し、凝集塊を形成する反応を、
検体中の被測定物質が抗体結合粒子と抗原抗体反応を起
こすことＫよシ阻止する反応である。

一般に高分子重合体粒子には、ポリスチレンラテックス
粒子が用いられる。抗原結合粒子と凝集用多価抗原との
凝集を検体中の被測定物質が阻止する度合は、検体中の
被測定物質の量に比例することから、検体中の被測定物
質の量を測定することが可能となる。本測定法は、すで
に尿中エストリオール−１６−グルクロナイドの測定用
キットなどに用いられている公知の測定法である。本発
明者は上記高分子重合体粒子に結合させる抗体の種類を
従来の一種類から、測定対象として選択した被測定物質
に対する複数の種類にするととＫよシマルチ抗体結合高
分子重合体粒子を作製した。このマルチ抗体結合高分子
重合体粒子と凝集反応を起こすために（１）高分子担体
−分子に１目的とする被測定エストロゲンまたはエスト
ロゲン抱合体一種類を結合させ次モノ凝集用合成多価抗
原を抗体結合高分子重合体に結合させた抗体の種類に応
じてそれぞれ用意するか、または （２）高分子担体−分子に目的とする複数のエストロゲ
ンまたは、エストロゲン抱合体を同時に結合させ次マル
チ凝集用合成多価抗原を用意した。

第１図はマルチ抗体結合高分子重合体粒子とモノ凝集用
抗原複数種との反応を用いた測定の原理を示す。図のａ
、ｂ、ｃは目的とする被測定物質に対する三種の抗体で
あシ、これらは高分子重合体粒子りに結合しである。ａ
’、ｂ’、ｃ’はそれぞれ抗体ａ、ｂ、ＣＫ対応し穴被
測定物質で、担体ＥＫ結合し、それぞれ担体Ｅと共にモ
ノ凝集用抗原を形成している。これらの間で抗原抗体反
応を起こすと抗体ａは被測定物質ａ′と反応し、同様に
抗体すは被測定物質ｄ１抗体ＣＦｉ被測定物質Ｃ′と反
応し、凝集塊を形成する。この反応系に検体中の被測定
物質ａ′、ビ、ｄが存在する場合その濃度に応じて、被
測定物質は、マルチ抗体結合高分子重合体粒子上の対応
する抗体と反応するため、凝集用抗原との凝Ｓは阻止さ
れる。その凝集の程度は検体中の被測定物質ａ／。

ｂ／、ｃ／　の総和に比例するために検体中の被測定物
質ｆ、　Ｗ、　ｃ’の総量を一度に測定する仁とが可能
となり九。

第２図はマルチ抗体結合高分子重合体粒子とマルチ凝集
用抗原複数種との反応を用いた測定の原理を示す。担体
ＥＫは、被測定物質ａ’、　ｂ’；ピが結合されており
、全体でマルチ凝集用抗原を形成している。このマルチ
凝集用抗原とマルチ抗体結合高分子重合体粒子との間で
抗原抗体反応を起こすと抗体ａｌｔ被測定物質ａ′と反
応し、同様に抗体すは被測定物質ｂ′、抗体Ｃは被測定
物質Ｃ′と反応し、凝集塊を形成する。この反応系に検
体中の被測定物質ａ／　、　ｂ／　、　　ｃ／が存在す
る場合その濃度に応じて、被測定物質は、マルチ抗体結
合高分子重合体粒子上の対応する抗体と反応するため、
凝集用抗原との凝集は阻止される。その凝集の程度は検
体中の被測定物質ａ／。

ｂ′、Ｃ′の総和に比例するために検体中の被測定物質
ａ’、　ｂ’、　ｃ’　　の総量を一度に測定すること
が可能となった。

２　標識化抗原を用い几イムノアッセイへの応用 被測定物質に酵素、放射性物質、蛍光物質、ま危は発光
物質などを化学的に結合さぜることに工って標識化した
抗原を用いる免疫測定法は、それぞれエンザイムイムノ
アッセイ、ラジオイムノアッセイ、フルオロイムノアッ
セイ、およびルミネッセンスイムノアッセイと呼ばれ、
免疫測定法としては極めて一般的な測定法である。

これら標識化抗原と検体中の被測定物質とは、固相に固
定化式れ危抗体との間で競合反応を起こすが、固相上に
固定化された抗体にトラップされた標識化抗原０と固相
上の抗体が検体中の被測定物質と反応したために結合し
なかった遊離標識化抗原［Ｆ］とをＢ／Ｆ分層によって
分けｔ後、Ｂの量を酵素で標識化されている場合には、
酵素による基質の発色の度合や、基質の蛍光強度あるい
は発光の度合で測定し、検体中の被測定物質の量を求め
る方法である。また放射性物質でＷ４１！ｌ！１化され
ている場合には、放射線量から、蛍光物質で標識化され
ている場合には、蛍光強度から、発光物質で標識されて
いる場合には、発光強度から被測定物質の量を求める。

いずれも公知の測定法である。従来固相に固定化する抗
体は一種類であったが、本発明者は、エストロゲン及び
エストロゲン抱合体に対する複数の°抗体を固相上に固
定化したマルチ抗体固定化固相と、その種類に対応した
標識化抗原を用意し、固相上で反応させることによシ、
同時に複数の種類の被測定物質量を求めることが可能と
なった。

〔実施例〕

以下の実施例において本発明を更に詳細に説明する。な
シ、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例ｔ Ｅｌ−ｓＧとＢ３−ｔ　６Ｇと１２−１７Ｇとのラテッ
クス凝集阻止反応を用いた測定 （１）抗体結合ラテックス懸濁液の調製家兎に免疫して
得た抗Ｂ１−５Ｇウサギ抗血清と抗Ｂ３−１６Ｇウサギ
抗血清と抗１２−ｔ７Ｇウサギ抗血清中のｒグロブリン
成分を４０％飽和硫酸アンモニウム溶液により塩析させ
、８０００回転２０分間の遠心分離によって沈澱物を得
る。この沈澱物をα１５Ｍ塩化ナトリウム含有（１０２
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，２Ｋ溶解し、同じ緩衝液に対し
七− て２４時間透析後、２８０ｎｍにおける吸光度よって調
製し、それぞれ１％の抗Ｅ１−３０−ｒグロブリン溶液
、抗Ｂ５−１６Ｇγグロブリン溶液、及び抗Ｂ２−１７
Ｇｙグロブリン溶液を得た。この３種のｒグロブリン溶
液を混合し、ＬＩＬ２Ｍアンモニウム緩衝液ｐＨａ２　
（以下アンモニウム緩衝液と略す）で希釈し、１０％の
ポリスチレンラテックス粒子懸濁液（粒径Ｑ、１（１９
ミクロン、ダウ・ケミカル族）を加え、３７℃１時間イ
ンキエペートする。冷却後１％Ｂ８Ａ含有［Ｌ２Ｍアン
モニウム緩衝液ｐＨ＆２　Ｋ懸濁させ、α１％抗体結合
ラテックス懸濁液を得た。

（２）　　凝集用合成多価抗原溶液の調製Ｅ１−５Ｇ（
シグマ製）を、ジャーナル　オブステロイド　バイオケ
ミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　８ｔｅｒｏｉｄ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　Ｖｏｌ、　３　、　ｐ、
　２７５−２８８、　（１９７２）　Ｋ記載された方法
でウサギ血清アルブミン（以下Ｒ８Ａと略す、シグマ製
）と化学的に結合させた合成多価抗原であるＥｔ−３０
−Ｒ８Ａの凍結乾燥品を用意した。ま九Ｂ５−１６Ｇ。

及びＢ２−１７Ｇ（共にシグマ製）をジャーナルオプ　
ファーマシェーチカル　ダイナミクス（Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　ｄｙｎａｍｉ
ｃｓ　）ｖｏｌ、　１　、　ｐ５５−６１　、　（１９
７８）に記載された方法でＲ８Ａと化学的に結合させた
合成多価抗原であるＢ３−１６０−Ｒ８Ａ、　Ｂ２−１
７０−Ｒ８Ａの凍結乾燥品を用意した。各々の凍結乾燥
品をアンモニウム緩衝液に溶解し、それぞれ終濃度５μ
ｇ／−となるよう混合した。

（３）　　標準液の調製 Ｅｌ−３０，Ｂ３−１１６Ｇ、及びＢ２−１７Ｇを７ン
モニウム緩衝液で１μｇ／ｄ　Ｋ溶解し、同じ緩衝液で
倍々希釈し、標準希釈系列を作製し友。

（４）測定感度の調製 全自動免疫化学分析装置ＬＡ−２０００（ＡＩＣ。

アルファチック製）金用い、ＬＡ−２０００の第一試薬
として抗体結合ラテックス懸濁液３００μ１１サンプル
としてＥｔ−ｓＧ、Ｂｓ−ｔ　６Ｇ及びＢ２−１７Ｇの
標準希釈系列８０μ１１第二試薬として凝集用多価抗原
溶液２００μ！を用い、抗体結合ラテックス粉子と凝集
用多価抗原との凝集をＥｌ−ＫＧ、Ｂ３−１６Ｇ、及び
Ｂ２−１７Ｇが阻止する反応を光学的にとらえた。抗Ｂ
１−５Ｇ抗体、抗Ｂ３−１６Ｇ抗 め、抗体結合ラテックス粒子に結合させる三種類の抗体
の混合比を変え之懸濁液を何種類か用意し、ラテックス
凝集阻止反応におけるＥｌ−３ＧＫよる阻止の度合、Ｅ
ｓ−ｔ６Ｇによる阻止の度合、及びＢ２−１　７Ｇによ
る阻止の度合が一致するよう検討した。その結呆抗Ｂ１
ー３Ｇ／抗Ｅ５ー１６Ｇ抗体／抗Ｅ２−１７Ｇ抗体＝：
　４　４／４　２１５８とした場合にほぼ一致した凝集
阻止が起こることが分かった。

（５）　　実際の測定例 前述した比率で抗体を混合した抗体結合ラテックス懸濁
液を用い、ＬＡ−２０００で、正常性周期を有する女性
尿を検体として測定した。その結果を抗Ｅｓー１６Ｇ抗
体結合ラテックスとＢ３−１　６Ｏ−Ｒ８Ａとの凝集阻
止反応による結果と比較した。同時に尿中ＬＨ（黄体形
成ホルモン）をハイゴナビス（商品名，持田製薬製）で
測定し、ＬＨがピークに達した日を排卵日とした。第３
図に示した様にＢ３−１６Ｇだけでの測定結果では、排
卵日に尿中１３−１６Ｇはピークに達するのに対して本
発明による反応系では、排卵の２日前から値が上昇し始
めた。この結果はＥｌ−ｘＧ及びＢ２−１７Ｇが排卵日
よシも早めに上昇することを示しておｊｊ）、Ｂ３−１
６Ｇだけでは分からないエストロゲンの動態がよシはつ
きりすることが分かる。

実施例２ Ｅｌ−３０，Ｂ２−３０．Ｂ３−１６Ｇの同時測定ラテ
ックス粒子に抗Ｅ１−５Ｇ抗体、抗Ｂ２−５Ｇ抗体、抗
Ｂ３−１６Ｇ抗 抗体結合ラテックス粒子懸濁液を用意する。凝集用抗原
溶液としてＥｌ−ｓＧ−Ｒ８Ａ，Ｂ２−５０−Ｒ８Ａ，
　Ｅ　５　−　１　６　０−Ｒ８Ａを溶解混合したアン
モニウム緩衝液溶液を用意し次。実施例ｔと同様に全自
動免疫化学分析装置ＬＡ−２０００を用いて正常性周期
を有する女性尿を測定したところ、排卵期においてエス
トロゲン代謝産物の濃度は、Ｅｌ−３Ｇだけの測定では
、６２ｎｇ／ｌｌｊでありｆｔ．のが、王者合わせて２
８１ｎｇ／ｍｊ検出され、ＬＡ−２０００によるエスト
ロゲン代謝産物の検出感度の上昇につながる結果が得ら
れた。

実施例＆ ＢＩＡへの応用 Ｂ２−１　７Ｇ　２．０　ｗｇを試験管Ｋ　ト夛、シｌ
　チに＊ルムアミドｃＬ２ｄを加えて溶解し、水冷下、
攪拌しながらトリーｎ−ブチルアミン１０μ１１インブ
チルクロロフオルメート５μｌを加え、３０分間攪拌を
綬ける。ベルオキシターゼ（以下ＰＯＤと略−７ｍ１５
ｕ／ｑ）１０ｍ１９を蒸留水１１１Ｌｌに溶解し、氷冷
したものに前述した活性化し７２Ｂ２−１７Ｇのジメチ
ルフォルムアミド溶液を滴下し、０１Ｎ−　ＮａＯＨで
ｐＨ８前後に保ちながら４時間氷冷下攪拌を続ける。反
応終了後セファデックス０−２５によるゲル濾過により
未反応Ｅ２−１７Ｇを除失し、Ｂ２−１７０−ＰＯＤ結
合体を得る。同様な方法でＢ　２　−　ｓ　Ｇ−ＰＯＤ
結合体を用意する。

ポリスチレンボール（明相製　粒径６．　８　ｗａｓ　
）に抗Ｂ２−１７Ｇ抗 し結合させ友抗１２−１　７Ｇ抗体、抗Ｂ２−３Ｇ抗試
験管に抗Ｂ２−１７Ｇ抗 リン酸緩衝液ｐＨ７．２　（以下ＰＢと略す）で１００
倍に希釈したサンプル４００μｌｉ添加し、３７℃３０
分間イン中エペートする。生理食塩水で２回洗浄した後
、Ｂ２−ｔ７Ｇ−ＰＯＤ結合体とＢ２−３Ｇ−ＰＯＤ結
合体をＰＢに溶解し、混合した酵素標識抗体液を４００
μｌ添加し、３７℃３０分間インキュベニトする。生理
食塩水で３回洗浄した後、酵素基質液としてＯ−フェニ
レンジアミンを用時ＰＢで溶解したもの４００μｌを添
加し３７℃２０分間反応させた後、ｔ２Ｎ−硫酸２　−
ｄを添加し、ａ９２ｎｍＫおける吸光度から尿検体中の
Ｂ２−１　７０と１２−４Ｇの濃度が求められる。

〔発明の効果〕

上述の如く本発明の免疫測定用抗体は、エストロン又は
その抱合体に対する抗体、エストラジオール又はその抱
合体に対する抗体、エストリオール又はその抱合体に対
する抗体の中から選ばれ九二種類以上の抗体を固相に固
定化してなるため、体液中のエストロゲンホルモン及び
その代謝産物の二種以上を同時に定性及び／または定量
することができ、女性の卵巣機能の状Ｓを知るために有
効であり、また排卵期を従来よりも正確に予測すること
ができるので不妊症治療などの医療分野で有用である。

また、本発明の免疫測定法は上記組成の免疫測定用抗体
と、対応する標識化抗原もしくは合成多価抗原とを用い
る究め、簡便迅速な測定が可能であり、更に要求に応じ
て種々の変法を用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の免疫測定用抗体とモノ凝集用抗原複数
種とを用いた本発明の免疫測定法の測定原理の説明図、 第２図は本発明の免疫測定用抗体とマルチ凝集用抗原複
数種とを用いた本発明の免疫測定法の測定原理の説明図
、 第３図は女性尿中の黄体形成ホルモン濃度の排卵日前後
の変化量を示すグラフである。 図中、 Ｄ・・・高分子重合体粒子　　Ｅ・・・担体ａ，　ｂ，
　ｃ・・・抗体　　ａ’，　ｔ／，　（’・・・被測定
物質特許出願人　　　栄研化学株式会社 代理人　弁理士　　萼　優　美（ほか２名）第１図 第３図 −１２−１０−８−６−４−２０＋２　　＋４　　＋５
　　＋３　＋１０＋１２＼ ｔ４卜ＱＰ日　　　　　　　　　　　日枚手続補正書 昭和６２年１１　月２５日 ２、発明の名称免疫測定用抗体及びそれを用いる免疫側
定法 ３、補正する者 事件との関係　特許出願人 ５、補正命令の日付 「自発」 ７、補正の内容 （１）明細書第３頁第６行の「意識」を「意義」と補正
する。 （２）同第２６頁第１３行の「女性尿中の黄体形成ホル
モン濃度」を「実施例１の（５）で得られた女性尿中の
エストロゲングルクロン酸抱合体濃度」と補正する。 （３）図面の第３図を別紙のとおり補正する。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）エストロン又はその抱合体に対する抗体、エスト
   ラジオール又はその抱合体に対する抗体、エストリオー
   ル又はその抱合体に対する抗体の中から選ばれた二種類
   以上の抗体を固相に固定化してなることを特徴とする体
   液中の複数のエストロゲンホルモン及びその代謝産物を
   同時に測定するための免疫測定用抗体。
2. （２）固相が高分子重合体粒子であることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の免疫測定用抗体。
3. （３）エストロン又はその抱合体に対する抗体、エスト
   ラジオール又はその抱合体に対する抗体、エストリオー
   ル又はその抱合体に対する抗体の中から選ばれた二種類
   以上の抗体を固相に固定化してなる免疫測定用抗体と、
   対応する標識化抗原もしくは合成多価抗原とを用いて、
   体液中の複数のエストロゲンホルモン及びその代謝産物
   を同時に測定することを特徴とする免疫測定法。
4. （４）固相が高分子重合体粒子であることを特徴とする
   特許請求の範囲第３項記載の免疫測定法。
5. （５）標識化抗原の標識化が酵素、放射性物質、蛍光物
   質または発光物質によりなされることを特徴とする特許
   請求の範囲第３項記載の免疫測定法。