JPS59155761A - ステロイドホルモングルクロン酸化合物測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一解にステロイドホルモングルクロン酸化合物
の定量測定法に関する。特に本発明は酵素に共有結合し
たステロイドホルモングルクロン酸化合物よシ成るトレ
イサーを用いて特定ステロイドホルモングルクロン酸化
合物を定量する新規の免疫学的試験法に関する。

ステロイドホルモンは通常コレステロールから合成され
たホルモンであυ、組織の副腎皮質、午丸、卵巣、胎盤
および黄体によって分泌される。定義によって上記ステ
ロイドホルモンは痕跡量で生理学的に有効である。ニュ
ーヨーク州ニューヨーク市、アカデミツクプレスのＩｎ
ｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｏ　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ　（３版、１９７１．３５８ページ）
を参照さねわけそこに種々のを椎動物のステロイドホル
モンの生理学的効果が表１に示すとおり記載されている
。

表　　■ Ｎａ＋保持 代謝作用ニ ブドウ糖新生 プロテステロン　　卵巣（黄体〕　　子宮粘膜（分泌相
〕の増殖 エストラジオール　卵巣（小胞）　　子宮粘膜（発情期
）の増殖 テストステロン　　ヤ丸（間質細　　生殖管の付属腺及
び胞）　　　　　　２次性特性の維持 ５− ステロイドホルモンの不活性化は肝腓の代謝作用又は尿
への排泄作用によってえられる。（上記の２６０．３６
１〜３６３ページ、カールソン）　人の内刃性ステロイ
ドは主として水溶性結合物として尿中に排泄されること
が知られている。ケリーのＪ、　５ｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　　６．２７７（，１９７５）の“ステロ
イド結合物の放射線免疫試験”を参照されたい。プレグ
ナン系（プロゲステロン〕誘導体は殆んど例外々く水溶
性グルクロン仕合物（プレグナンジオールグルクロン酸
化合物〕として排泄され、卵胞ホルモンの主排泄形もグ
ルクロン醇化合物（エストリオールグルクロン酸化合物
、エストリオールグルクロン酸化合物およびエステロン
グルクロン酸化合物、上記ケリーの２７７ページ）であ
る。

ステロイドホルモンによって引出されたｉ要な生理学的
効果は、このホルモンとそのグルクロン酸化合物誘導体
６一 の検出定量法への実質的研究を促進したのである。シェ
フコートの“更に広帥涛ステロイド免疫試験使用への進
歩″（Ｊ、　５ｔｅｒｏｉｄ　］（ｉｏｃｈｅｍ、　　
１１．１０５１〜１０５５（１，９７９））を参照され
たい。

ステロイドホルモンの内因性濃度とその生理学的効果の
間の研究された相互関係の一つけ月経サイクルにおける
いわゆる女性ホルモン（卵胞ホルモンとプロゲステロン
）の役割である。一般に卵胞ホルモンの最大排泄は女ケ
トの月経サイクルのほぼ中間でおとり捷たリューテアル
（１ｅｕｔｅａｌ　）相中にプレグナンジオール（プロ
ゲステロンの代謝産物）生成が多くカリ第２卵胞、ホル
モンビークがおこる。ブラウンらの報告“月経サイクル
中の卵胞ホルモン、プレグナンジオールおよびゴナドト
ロピンの尿排泄”（Ｊ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ。

１７．４０１（１，９５８））を参照されたい。最近の
るＪ１究によってエストラジオールグルクロン酸化合物
濃度沖１定が女性排卵日の便第１１カ指示を与えオたプ
レグナンジオールグルクロソ酸什合物濃度増加は排卵の
証拠を与えるととが示唆されている。スタンチックらの
報告“月経期中の尿卵胞ホルモンおよびプレグナンジオ
ールグルクロン酸化合物の直接放射線免疫試験”（Ａｍ
ｅｒ、　Ｊ、　ｏｆ　０ｂａｔｅｒｉｃｓａｎｄ　Ｇｙ
ｎｅｃｏｌｏｇｙ、　　１３７．４４３（ｔ９ｓｏ））
を参照されたい。女性の不妊症治療も尿および抑漿のエ
ストラジオールｆｐＩ！￥と血清プロゲステロン濃度を
監親してできる。

ブラックらの報告゛ゴツトトロピンによる排卵欠如治療
監視用の尿と抽漿のステロイド測定評価・・”　（Ｊ　
、　０ｂｓｔｅｔ。

Ｇｙｎｅｃ、　Ｂｒｊｔｉｓｅｈ　Ｃｏｍｍｏｕｗｅａ
ｌｔｈ、　！Ｌ１，６６７（１９７４））を参照された
い。

血清中のステロイドホルモンおよび尿試料中のステロイ
ドホルモングルクロン酸化合物を定量するため移々の試
験法が従来使用されている。高級を椎動物を使って研究
が行われているが、（ゼーガーらの報告“馬ｍＷ中のプ
ロゲステロンの酵素免疫試験（ＥＩＡ）”（Ｊ。Ｉｍｍ
ｕｎ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ、　　２８．２１１　（１９７９））、
多くの試験は人のステロイドホルモン又はそのグルクロ
ン酸化合物誘導体の定量に向けられている。ステロイド
ホルモンは人の体液中にリットル当りピコモル（柚清エ
ストラジオール、月経期の早期リューテアル相）からリ
ットル当り１００ミクロモル程度（妊娠末期の尿エスト
リオール）の濃度範囲である。ヴアンウイーマンらの°
ステロイドの酵素免疫試験二司能性と落し穴’（Ｊ、　
５ｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　１１．１４７（１
９７９））を参照されたい。高濃度で存在するステロイ
ドホルモン測定に低感度の生物検査又は化学試験が使用
できるが、この様々試験は多くの用途に対する心壁な感
度が不足している。

放射線免疫試験法の発達はリットル当υピコモル範囲の
９− 感度をもつ試験法を与えている。代表的放射線免疫試験
はステロイド含有試別に一定１°の放射線札付きステロ
イドホルモンを添加した移一定量のヌテロイド抗体を加
え次いで抗体と結合した又は非結合の放射線札付きステ
ロイドホルモンの放射能を測定するのである。上記ヴア
ンウイーマンの１４７ページを参照されたい。

血清ステロイドホルモンの放射線免疫試験は患者の反復
静脈穿刺を要するり患者が静脈穿刺をいやがる上に馴れ
た医師は一般に採血を要求する。〔ジートンらの゛パン
グラディシュ婦人の月経期監視のための唾液プロゲステ
ロン試験の使用”（Ｃ１ｉｎ、Ｃｈｅｍ、、７８９：　
１０８３（１９７９））を参照されたい。〕 尿ステロイドホルモン誹度測定に向けられる放射線免疫
試験も開発されている。上記ケリーの２７７〜２８１ペ
ージ；スタンチックらの１月経期の尿卵胞ホルモンとプ
レ１０− グナンジオールグルクロン酸化合物の直接放射線免疫試
験（ＡｍＪ、０ｂｓｔｅｔ、　Ｇｙｎｅｃｏｌ、、　　
１３７．４４３〜４５０（１９８０））を参照されたい
。測定されたステロイドホルモングリクロン酸化合物は
直接（グリクロン酸化合物誘導体の遊離ステロイドホル
モンへの加水分Ｍカしに〕エストロングルクロン酸化合
物、エストラジオール−３−グルクロン酸化合物、エス
トラジオール−１７β−グルクロン酸化合物、エストリ
オール−３−グルクロン酸化合物、ニストリオ−Ａ−１
６α−グルクロン酸化合物、およびプレグナンジオール
３α−グルクロン酸化合物がある。上記スタンチックら
の４４３〜４４４ページ参照。尿試料の放射線免疫試験
によるステロイドホルモングルクロン酸化合物測定は採
血を不要にする。

重賛な問題は特殊装置のある実験室、特殊熟練職員、高
価な放射能測定装置、ある同位元素の短かい半減期、廃
棄問題およびラツカル（１ａｃａｌ）法律による可能々
督可問題の必要を含む放射線札付き化合物使用と関連し
ている。ヴアンウイーマンの上記１４７ページを参照さ
れたい。また放射線免疫試験を完了するに重要外時間が
必要である。

最近報告されたステロイドホルモングリクロン酸化合物
の”迅速”放射線免疫試験は放射能測定法前に２．５時
間の培養時間が必要であった。シャツテロンらの“婦人
のりューテアル作用評価のための早朝尿試料中のプレグ
ナンジオール濃度の放射線免疫試験”（Ｆｅｒｔｉｌｉ
ｔｙ　ａｎｄ　５ｔｅｒｉｌｉｔｙ。

３７．３６１〜３６３（１９８２））を参照されたい。

他の迅速試験は実際の定量試験をする前にステロイドホ
ルモングルクロン酸化合物を遊離ステロイドホルモンに
加水分解のため熱酸で尿試料を処理する必要がある。メ
トカーフの１尿中のプロゲステロン代謝産物の迅速ガス
クロマトグラフ試験’（Ｃｌ１ｎ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、、　　６．３０７〜３０８（１，９７３））を参照さ
れたい。

放射線免疫試験に固有の多くの問題を避けるため非同位
元素ステロイドホルモン免疫試験の使用が提案されてい
る。ステロイドホルモンの非同位元素ｙ験にはステロイ
ドホルモンの測定か螢光団、バクテリオファージ、補酵
素および酵素の生物学的又は化学的活性測定より成る様
々札付き配位子試験がある。上記ヴアンウイーンの１４
７ページを参照されたい。徒者の方法を用いる試験は普
通酵素−労役試験又は酵素と結合した免疫試験といい、
次のステロイドホルモン：卵胞ホルモン、プロゲステロ
ン、テストロンおよびコルチゾールについて報告されて
いる。

最近発達したステロイドホルモンの酵素免疫試験はこれ
らの放射線免疫試験と同等又は殆んど同等の感度を示す
。

ヌマザワらの“エストラジオールのピコグラム程度の酵
素免疫試験″’（ＦＦ、ＢＳ　　Ｌｅｔｔｅｒ、　　７
９．３９６〜３９７１３− （１９７７））およびボッシュらの”妊娠面漿又は血清
中の全卵胞ホルモンの酵素免疫試験″’（Ｃｌ１ｎ、　
Ｃｈｉｍ、　Ａｅｔａ、。

８９．５９〜６３（１９７８））を参、明されたい。チ
ャツタ−トン、Ｊｒ、、ロバートＴ、の“婦人のりュテ
アル作用評価のための片朝尿試料中のプレグナンジオー
ル濃度の放射線免疫試験’（Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　ａｎ
ｄ　５ｔｅｒｉｌｉｔｙ、　３７（３）３６１〜３６６
（１９８２））を参照されたい。これらの試験は一般に
抗体と結合した酵素札付きのステロイドホルモンと結合
していない酵素札付きのステロイドホルモンの両方が酵
素的に活性でありかつ測定前に分離されねば力らぬとい
う点で異成分から成る酵素免疫試験といわれる。

普通の酵素免疫試験は酵素札付きステロイドホルモンを
ステロイドホルモン含有試料と混合し混合物をアンチス
テロイドホルモン抗体と培養しかつ分離後抗体と結合し
た又は結合してい々い酵素札付きステロイドホルモンを
１４− 測定することより成る。酵素札付きステロイドホルモン
とステロイドホルモンは有効抗体結合位置について互い
に競い合う。試料中にあるステロイドホルモン郊°けし
たがって抗体に結合した酵素札付きステロイドホルモン
の１−に比例する。士官？ヴアンウイーマンの１４７ペ
ージを参照されたい。ステロイドホルモンに結合し酵素
免疫試験に使わわる酵素にはせいようわさびベルオキシ
ターゼ、β−Ｄ−ガラクトシターゼ、グルコアミラーゼ
、アルカリ性ホスファターゼ、グルコース−６−ホスフ
ァターゼ、およびマレイトデヒドロジエナーゼがある。

（上記ヴアンウイーマンの１４８ページ参照〕。

報告されたステロイドホルモン酵素−免疫試験法は放射
線免疫試験法に関連した多くの問題を防ぐが、すべてそ
のステロイドホルモン含有試料として薄情試料（Ｊｌ’
ｌｌ液又は妊娠血漿〕を用いる。多くの血液又は妊娠血
漿試料をえるための同市の問題には熟練医師と上書上の
可能力患者抵抗が必要である。

尿のステロイドホルモングルクロン酔イｈ合物測定のた
めの酵素免疫試験法開発に対し従来なされた処は少々い
。

これは一部には適当外酵紫札付きステロイドホルモング
ルクロン酸化合物製造法がなかったことによるであろう
。

せいようわさびペルオキシダーゼ札付きグルクロン酸化
合物の様なある酵素で札をつけたステロイドホルモング
ルクロン酸化合物は一般に液状で貯蔵され半減期が減少
し汚染問題を増す。他の酵素はステロイドホルモングル
クロン酸化合物に共有結合した場合その酵素活性の著し
い減少を示すθルジャオウスキーらの１エストリオール
−１６α−グルクロンＭ化合物、エストロン−３−グル
クロン酸化合物およびプレグナンジオール−３α−グル
クロン酸化合物の４種酵素への結合の異なる結合法の影
響”（Ｊ、　ＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｃｍ、、１４．
８６１．８６３〜８６５（１９８１））を参照されたい
。又は他の酵素はそれを仙のホルモンに結合するに強力
非共原子価結合を使う場合その酵素活性の著しい減少を
示す。グエスドンらの“免疫酵素法におけるアヴイジン
ービオチン相互作用の使用”（Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｅｈｅ
ｍ。

Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、　　２２．１１３１ページ（１９
７９））を参照されたい。

したがって長期にわたりステロイドホルモングルクロン
酸化合物測定のための酵素免疫試験法が要望されていた
のである。

本発明は試料中の望むステロイドホルモングルクロン酸
化合物の迅速高感度の新規定量測定法を提供するもので
ある。

本発明は試料中のステロイドホルモングルクロン酸化合
物測定法に関する。その方法は試料を酵素に共有結合し
１７− ている測定される特定ステロイドホルモングルクロン酸
化合物を含むトレーサーの既知量と処理し、試料とトレ
ーサーを既知量のアンチステロイドホルモン抗体と処理
して抗体と結合したステロイドホルモングルクロン酸化
合物、抗体と結合したトレーサー、非結合ステロイドホ
ルモングルクロン酸化合物および非結合トレーサーより
成る試験混合物を生成し、試験混合物から非結合トレー
サー又は抗体と結合したトレーサーを分離しかつ存在す
る分離した抗体結合トレーサー又は非結合トレーサーの
量を試料中にあるステロイドホルモングルクロン酸化合
物の尺度として測定することより成るのである。

本発明の好ましい実施態様により尿試料中のステロイド
ホルモングルクロン酸化合物ｆｌｉ！　　（１）試料を
アルカリ性ホスファターゼに共有結合している測定され
るステロイドホルモングルクロン酸化合物に対応する配
位子を含むトレーサーの１８− 既知量−と混合し、（２）試料にトレーサーを加乏る前
に又は添加と同時に試料に適当外表面活性剤を加乏、（
３）試料とトレーサーに既知量のアンチステロイドホル
モングルクロン酸化合物抗体を加えて抗体と結合したス
テロイドホルモングルクロン酸化合物、抗体と結合した
トレーサー、非結合ステロイドホルモングルクロン酸化
合物および非結合トレーサーより成る試験混合物を生成
し、かつ（４）試験混合物中の抗体結合ステロイドホル
モングルクロン酸化合物と抗体結合トレーサーを沈澱さ
せ非結合トレーサーと非結合ステロイドホルモングルク
ロン酸化合物を含む上澄液の既知量をアルカリ性ホスフ
ァターゼ基質含有溶液に加えることによって非結合トレ
ーサーの酵素活性を測定するのでちる。

本発明の方法に使われるトレーサーとアンチステロイド
ホルモングルクロン酸化合物抗体の量は従来の１方法に
よって容易に確かめられる。トレーサーの量はアンチス
テロイドホルモングルクロン酸化合物抗体量と等しいか
又はそれ以上でかければ々らかい。仲片トレーサー量は
アンチステロイドホルモングルクロン酸化合物抗体量以
上であることが好オし、い。

本発明の好脣しい方法はアルカリ性ホスファターゼ酵素
に共有結合したプレグナンジオールグルクロン酸化合物
、エストラジオールグルクロン酸化合物、エストリオー
ルグルクロン酸化合物、又はエストロングルクロン酸化
合物より成るトレーサーを使用する。本発明はまたアル
カリ性ホスファクーゼ以外の酵素を上記ステロイドホル
モングルクロン酸化合物に共有結合させた４１ステロイ
ド　ホルモングルクロン酸化合物の定ｆｆ［Ｉｌ！定法
をも包含する。

本発明の他の好ましい実施態様にねプレグナンジオール
グルクロン酸化合物の測定がある。プレグナンジオール
グルクロン酸化合物はプレグナンジオール、プロゲステ
ロンの代謝産物およびグルクロン酸の酵素的結合生成物
である。プレグナンジオールは尿中にすげやく排泄され
るので、静脈穿刺せずに血清中のプロゲステロン濃度推
定機構を力える。プレグナンジオールグルクロン酸化合
物は酵素と結合していてもい々くてもプレグナンジオー
ルグルクロン酸化合吟特定の抗匍清に結合する。したが
って溶液中の酵素札付き又は札なしいづわかのプレグナ
ンジオール　グルクロン酸化合物濃度は抗体への相対結
合量を決定する。

尿試料又は標準液からのプレグナンジオールグルクロン
酸化合物（未知〕が酵素−札付きプレグナンジオールグ
ルクロン酸化合物とアンチプレグナンジオールグルクロ
ン酸化合物抗体より成るトレーサーと平衡させた場合ア
ンチプレグナンジオールグルクロン酸化合物抗体に結合
したトレーサーｉけ尿試料又は標準液中にある未知量と
相関−２１＝ するであろう。トレーサーに結合している抗体を非結合
トレーサーから分離し非結合トレーサーを測定して試料
又は標準液中のプレグナンジオールグルクロン酸化合物
濃度を決定できる。試料又は標準液中のプレグナンジオ
ールグルクロン酸化合物−（未知〕は抗体混合物から分
離後の上澄液中の非結合トレーサー量に比例する。

本発明の方法は通常尿中に認められるリットル当り１〜
４０ミクロモルの範囲のプレグナンジオールグルクロン
酸化合物濃度の測定に効果がある。また本発明の方法は
１時間以内にすることができる。

本発明の方法の感度をあけるためアンチステロイドホル
モングルクロン酸化合物抗体を添加する前に試料にその
中の遊離ステロイドホルモンクルクロン酸化合物量を最
大としうる表面活性剤を添加するとよい。適当する表面
活性剤には例えばアルキルポリエーテル硫醪塩類（即ち
２２− トリトンＳ−３０１、トリトン−Ｘ−１５１、トリトン
Ｘ−１，ＯＯ）、アルキル硫酸ナトリウム（即ちドデシ
ル硫酸ナトリウム）、熾４級アミンおよびアンモニウム
塩（即ちドテシルトリメチルアンモニウムブロマイド）
、コレステロール様′ｒｉｇ（即ちデオキシコール酸う
、ジオクチルスルホン酸ナトリウム（トリトンＧＲ−７
Ｍ）等がある。本発明の方法の表面活性剤としてポリア
リール砧酸地を用いると１よい。表面活性剤としてはト
リトンＸ−３０１を用いることが序も好ましい。

上述のとおシ抗体結合トレーサー又は非結合トレーサー
のいづわかの酵素的活性は試料中のステロイドホルモン
グルクロン酸化合物の尺度として測定できる。酵素的活
性測定前に測定する抗体結合トレーサー又は非結合トレ
ーサーを試験混合物から分離しておく必要がある。抗体
結合トレーサー又は非結合トレーサーの分離法はこの分
野の普通の１技術によって容易に確かめられ、例えば試
験溶液の抗体と結合した成分の免疫沈澱法、固相分離法
等がある。試験漣、合物中の抗体結合トレーサーと抗体
結合ステロイドホルモングルクロン酸化合物を沈澱させ
るにアンチステロイドホルモングルクロゾ酸化合物抗体
に特有の抗体を用いたＶ／残留試験混合物上澄液中の非
結合トレーサーの酵素的活性を測定するとよい。分離し
た抗体結合トレーサー又は非結合トレーサーの酵素的活
性は普通の方法、例えば酵素札に特有外基質を用いる比
色分析法の様な普通の方法を用いて測定できる。

試料中にあるステロイドホルモングルクロン酸化合物ａ
ｌｌ定はトレーサー、ステロイドホルモングルクロン酸
化合物、アンチステロイドホルモン抗体およびアルカリ
性ホスファターゼ基質の既知量を用いる試験系を使用し
てつくられた標準曲線に対し試験混合物の酵素的活性を
比較して行々うことができる。

次の実施例は更に本発明を例証するに役立つであろうが
、貞童においても帥門においても本発明を限定するもの
では々い。

実施例　１ 本発明の方法実施に当り次の試薬を使用したニトリトン
Ｘ−３０１を含む０．１Ｍ炭酸堪緩衝液（ｐＨ９）中に
山羊アンチプレグナンジオールグルクロン酸化合物が懸
濁しているプレグナンジオールグルクロゾ酸化合物抗体
溶液；実施例■又け■の方法により製造され蛋白質、１
チ乳糖およびＯ，：ｌアジ化す）　ＩＪウムと共に炭酸
ｔＵ１衝液中に懸濁しているアルカリ性ホスファターゼ
酵素に共有結合しているプレグナンジオールグルクロン
酸化合物を含むプレグナンジオールグルクロン酸化合物
トレーサー溶液；ｎ製グルクロン酸化合物の適当量を０
，１チアジ化ナトリウム含２５− 有木炭でストリップした男性尿と混合して収隼した０１
１０．２０．３０および４０μＭのプレグナンジオール
グルクロン酸イビ合物標準液；モルガンとラザロウのＤ
ｉａｂｅｔｅｓ。

１２．１１５〜１２６　（１，９６３）に記載のとおり
製造した通常山羊血清／豚アンチボウト抗抑清よシ成る
ＤＡＰＳ（ダブル抗体沈降素懸濁液〕；アボツ）　　Ａ
−Ｇｅｎｔ　　アルカリ性ホスファターゼ試薬：１０ｍ
Ｍシスティンより成る冷却用液；および非試験尿対朋。

上君己試薬はすべて乾燥状態でえられ、試験実施直前水
で望む量につくることができる。尿は通常家庭又は事務
所で採取できる。ステロイドは尿中で２〜３日間安定で
あるが、試験は採取後力るべく速かに折力うべきである
０次の実施例は尿試料中のプレグナンジオールグルクロ
ン酸化合物の定量試験法を記述している。

２６一 実施例　■ 実施例■の試薬を次の工稈順序で使用した：尿試料、標
準液又は尿対朋の２５μｔを培養管の２１゛セツトに加
えた。

別の管に水２５μｔを加えて白試験培養管をつくった。

白試験培養管を除く各培養管に１００μｔのプレグナン
ジオールグルクロン酸化合物トレーサー液を加え、白試
験管には１００μｔの水を加えた。培養管全部（白試験
管を含む）に一定＃（１００μｔ）のプレグナンジオー
ルグルクロン酸化合物抗体液を加え台管を回転して試料
を十分混合した。次いで管に蓋をし３７℃で１０分間培
養し台管に２００μｔのＤＡＰを加えた。全試料を再び
十分回転混合し３７℃で１０分間培養した。培養後全管
を１０００Ｘｆで１０分間遠心分離した。台管の上澄液
から１００μｔの試料をとり出し、台管の底のベレット
を妨け々い様に注意して札付き反応管中にピペットで入
れた。各反応管に１００μｔのアボツ）　Ａ−Ｇｅｎｔ
アルカリ性ホスファターゼ試薬を加乏試刺をよく混合し
室温で１５分培養した。次いで各反応管に冷却用−ｇｌ
ｌ、　５　ｍｌを加えた徒ρ−ニトロフェノールの適当
波長における試料の吸光ル゛を分量光度計上で読みプレ
グナンジオールグルクロン酸化合物標準液を用いてつく
った標準曲線と比較した。

実施例　１１ 本ｙＩＦｉ明の方法の仙、の実施態様は兎アンチープレ
グナンジオールグルクロン酸化合物抗体と山羊−アンチ
ー兎抗体（免疫ＤＡＰＳ）の懸濁液よ４成る免疫沈澱剤
を使用する。

この懸濁液は実施例■の山羊−アンチー兎／通常兎Ｉｇ
Ｇ（ＤＡＰＳ）懸濁液製造に用いた方法と同様の方法に
よって製造した。世しアルカリ性ホスファターゼ札付き
プレクナンジオールグルクロン酸化合物トレーサーの結
合は種々の抗体稀釈度で辿１定した。アンチプレグナン
ジオールグルクロン竺仕合物沈降素は本発明の方法に次
の方法によって使用［７た：２５μｔの尿試料、標準液
又は尿対照を培養管の２重セットに加えた。別の繁養管
に水２５７１１を入れて白試験培養管とした。白ｖ、ｒ
を含む全培養管に１００μｔのアンチプレグナンジオー
ルグルクロン酸化合物免疫ＤＡＰＳ沈降素懸濁液を加え
台管を回転して試料を十分か合した。次いで管をおおい
３７℃で１０分間培養した後１０００Ｘｒで１０分間遠
心分離した。各管上澄液から試料１００μｔをとり注意
して各管底のペレットを妨げない様札付き反応管中に込
れた。各反応管に１００μｔのＡ−Ｇｅｎｔアルカリ性
ホスファターゼ試薬を加え試料を十分混合し字混で１５
分培養した。次いで台管に冷却用液１．５−を加え十分
重合した。Ｐ−二トロフェノールに対する適当波長にお
いて試料の吸光度を分光光度計で読みプレグナンジオー
ルグルクロン酸化合物の標準液を用いてつくった２９− 梗準曲紳と比較しまた。

本発明の方法に使用したトレーサーは次の方法によって
製造できる：プレグナンジオールグルクロン酸化合物を
ジメチルホルムアミド中１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド地所塩の存在におい
てＮ−ヒドロキシスクシニミドと混合してプレグナンジ
オールグルクロン酔化合物のＮ−ヒドロキシスクシニミ
ドエステルをつくった。このエステルをグルクロン酸化
合物対アルカリ性ホスファターゼのモル比約５００　：
　１乃至約１００：１、好オしくは２００　：　１乃至
１００：１において適当緩衝液中のアルカリ性ホスファ
ターゼと反応させた。

アルカリ性ホスファターゼで札付けられたプレグナンジ
オールグルクロン酸化合物生成物はゲルクロマトグラフ
法又は透析法によって精製した。上記方法におけるプレ
グナンジオールグルクロン酸化合物の代りに例えばエス
トラ３０− ジオールグルクロン醇化合物、エストリオールグルクロ
ン酸化合物又はエステロングルクロン酸化合物の様な他
のグルクロン酸化合物を用いて仙のアルカリ性ホスファ
ターゼ札付きグルクロン酸化合物を製造できる。

次の実施例は更に本発明の方法に便第１１な特殊トレー
サー製造を示すに役立つであろう。

実施例　■ プレグナンジオールグルクロン酸化合物１００■、（２
００μＭ）、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド３０■（２６
０μＭ）、１−ヒドロキシベンズトリアゾール水化物０
．Ｃｖ　（０，７５ｐＭ　）およびＮ、Ｎ’−ジシクロ
へキシルカルボジイミド５７■（２７６μＭ）の混合物
を５℃の乾燥ジメチルホルマミド１−中で１時間攪拌し
室温で１８時間放置し濾過しＰ液を減圧蒸発して残漬を
えた。残漬を乾燥アセトンにとかしエーテルで沈澱させ
沈澱を沢過抽集し乾燥してプレグナンジオールグルクロ
ゾ醇活性エステルを白色粉末としてえた。この３．２ｇ
ｉを２００μｔの乾燥ジメチルホルマミドにとかしえた
液の少量を５０μｔの精製アルカリ性ホスファターゼと
活性エステル対アルカリ性ホスファターゼのモル比１２
０：１．１４５：１、および１６５：１となる様混合し
４℃で１８時時間表うして粗生成物をえた。粗生成物を
ゲル沢過ミニカラム上で精製してアルカリ性ホスファタ
ーゼ−札付きプレグナンジオールグルクロン醇化合物ト
レイサーをえた０実施例　■ プレグナンジオールグルクロン酸化合物２５．０１Ｎ！
（５０μＭ）、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド８．５■（
７４μＭ）、および１−エチＡ−３（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミドｔｉｍ塩８１５■（４５μ
Ｍ）を１−の乾燥ジメチルホルマミド中で２４時間攪拌
しプレグナンジオールグルクロン酔化合物活性エステル
溶液をえた。精製アルカリ性ホスファターゼ４００　ｐ
ｉとプレグナンジオール　グルクロン酸仕合物活性エス
テル対アルカリ性ホスファターゼモル比４９０　：　１
と々る様々量の活性エステル溶液とを反応させてえた粗
生成物を２５ミニカラム上で精製し、０．１Ｍりん酸ナ
トリウム、０．１　ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ１２および０．１％
デオキシコール酸を含む緩衝液（ｐｉ（７，０）２Ｘ５
００ｍ／に対し透析してアルカリ性ホスファターゼ−札
付きプレグナンジオールグルクロン酸化合物トレーサー
をえた。

実施例　■ １ｍｌの乾燥ジメチルホルムアミド中にエストラジオー
ルグルクロン酸ナトリウム塩２０■（４２μＭ〕、Ｎ−
ヒドロキシスクシニミド６１！ｑ（５２μＭ）、および
１−エチル−３（３−ジメチルアミンプロピル）カルボ
ジイミド塩酸ｔｉ８ｗｉ（４２μＭ）の混合物を４時間
攪拌してエストラジ３３− オールグルクロンｉ仕合物活性エステルをメ−た０この
エストラジオールグルクロン酸化合物活性エステルを活
性エステル対アルカリ性ホスファターゼモル比６０：１
．１２０：１．１−８０　：　１．２４０：１．３００
：１および３６０：１とカる柳４０　ｐＬの精製アルカ
リ性ホスファターゼと反応させ粗生成物をえた。粗生成
物をミニカラム上で精製してアルカリ性ホスファターゼ
−札付きエストラジオールグルクロン酸化合物トレーサ
ーをえた。

本発明を特定修正法について記述したが、本発明の真意
と範囲を逸脱し々い限り種々の類似法、変更法および修
正法ができるとと―明白であるから、それらは本発明を
限定するとＭ釈されるべきではないしこの類似実施態様
も本発明の特許請求範囲に包含されるものと考えられる
のである。

３４−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）　　尿試料を、酵素に共有結合している測定
   すべきステロイドホルモングルクロン酸化合物を含むト
   レーサーの既知量と混合し、 （ｂｌ　　Ｋ料オｘぴトレーサーを既知量のアンチステ
   ロイドホルモン抗体と処理して抗体と結合したステロイ
   ドホルモングルクロン酸化合物、抗体と結合したトレー
   サー、非結合ステロイドホルモングルクロン酸化合物お
   よび非結合トレーサーより成る試験混合物を生成し、（
   ｃ）　　試験混合物から非結合トレーサー又は抗体と結
   合したトレーサーを分離し、かつ （ｄ）　　分離した抗体と結合したトレーサー又は非結
   合トレーサーの存在量を試料中のステロイドホルモング
   ルクロン酸化合物の尺度として測定する ととを４ＬＩＦｇ！ｌとする尿試料中のステロイドホル
   モングルクロン酸化合物の測定法。 ２、トレーサーがアルカリ性ホスファターゼに共有結合
   している測定すべき特定ステロイドホルモングルクロン
   酸化合物より成る特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、測定すべきステロイドホルモングルクロン酸化合物
   がプレグナンジオールグルクロン酸化合物エストラジオ
   ールグルクロン酸化合物、エストラトリオールグルクロ
   酸化合物およびエストロングルクロン酸化合物より成る
   群から選ばれたものである肴許請求の範囲第２項に記載
   の方法。 ４、更に工程（ｂ）の前に又は（ｂ）と同時に上記試料
   を表面活性剤と処理する工程を含む特許請求の範囲第２
   項に記載の方法０ ５　工程（ｃ）が上記アンチステロイドホルモン抗体に
   対する抗体を用いて抗体と結合したトレーサーおよび抗
   体と結合したステロイドホルモングルクロン酸化合物を
   沈澱させる工程を含む特許請求の範囲第２頂に計、載の
   方法。 ６　非結合トレーサーを試料中のステロイドホルモング
   ルクロン醇化合物の尺度として測定する特許請求の範囲
   第５項に記載の方法。 ７、非結合トレーサーを比色定量法で測定する特許請求
   の範囲第６項に記載、の方法。 ８、抗体と結合したトレーサーを試料中のステロイドホ
   ルモングルクロン酸化合物の尺度として沖１定する特許
   請求の範囲第５項に記載の方法。 ９、抗体と結合したトレーサーを比色定量法で測定すゐ
   特許請求の範囲第８項にＦｆの方法、 １０試料とトレーサーをアンチステロイドホルモン抗体
   およびアンチステロイドホルモン抗体に対する抗体よシ
   成る複合物の既知量と処理して工程（ｂ）と（ｃ）を同
   時に行々つで抗体と結合したトレーサーと抗体と結合し
   たステロイドホルモングルクロン酸化合物の沈澱をえる
   特許請求の範囲第２項に記載の方法。