JPS6134466A - ハプテンの定量のためのイムノメトリツク法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 測定するために標識抗体を用いた方法によるハプテンの
定量法に関する。

イムノアッセイの手順は、予後、診断または他の臨床的
目的のために生物学的試料中、とくに患者から採られた
血液試料中の特定の成分分子を測定するために広く用い
られている。現在、１［ 最も重要な免疫化学的分析法には、放射性同位体、螢光
性もしくは生物発光性分子、またはア−　ツセイのシグ
ナルとしての色の変化を促進する酵素が用いられている
。これらは一般に標識として言及される。

免疫化学的分析に用いられる抗体（免疫グロブリン）は
、現在までのところ抗原によって免疫された動物（たと
えばウサギやヒツジ）中の抗血清の形でえられ工おり、
該抗原はそれ自身分析対象物質（ａｎａｌＶｔｅ）であ
るかまたはその類似体であり、また該分析対象物質は該
分析対象物質を認識する抗体の産生をうながす。

ハプテンとよばれる小さな分子のばあいは、抗体を用い
る方法が特に重要である。というのも、分子量が約５０
００ダルトン未満の分子はもともと免疫原性を有してお
らず、通常たとえばウシの血清アルブミンまたはチログ
ロブリンのようなタンパク質である一層大きなキャリヤ
ー分子と接合しなければならないからである。それぞれ
の接合ハプテンに対して産生きれ抗血清中に存在する抗
体は多価性を示す。すなわち、抗血清中には抗体のいく
つかのポピユレーションが存在し、各ポピユレーション
は接合ハプテンの分子構造の異なる部位を認識する。そ
れゆえ、これらの抗体はその特異性を異にする。特定の
抗血清中に存在する抗体のこの多様性はいくつかの点に
おいて、特に抗原が大きなタンパク質であるばあいには
沈降しうる大きな抗原−抗体複合体の生成が容易になる
ので有利であるかもしれない。しかしながら、イムノメ
トリックアッセイにｍｍｕｎｏｍｅｔｒｔｃ　ａｓｓａ
ｙｓ）のばあいのように特定の抗体を純粋に製造するこ
とが要求されるばあいには、複雑な精製法が用いられな
ければならず、一般にこれらの精製法の有効性には限度
がある。最近これらの問題は、一定の抗原に対して唯一
の親和性と特異性を有するただ１種の抗体のみを分泌す
る単クローン性ハイブリドーマ細胞を大規模に生産する
技術が開発されたことによって克服されている。しかし
ながら、分子量が２０００ダルトン未満のハプテン（た
とえばステロイドや多くの薬剤）の異なる部位を認識す
る２種またはそれ以上の抗体は同時に単一のハプテン分
子に結合することができず、このことが大抵の分子量の
小さな化合物に対して標識抗体によるイムノアッセイ（
イムノメトリック　イムノアッセイ）を用いることを制
限してきた。

従来のイムノアッセイにおいて、純粋に製造された分析
対象物質または分析対象物質の類似体は適当な標識と結
合され、該標識の性質が、用いられた検出法を決定する
。たとえばラジオイムノアッセイにおいては、放射性同
位体が標識として用いられ、液体または結晶シンチレー
ションスペクトロメーターで定量することができる。

この標識された分析対象物質または分析対象物質の類似
体は、分析対象物質それ自身とだけでなく標識された分
析対象物質を認識する抗体のある一定量とともにある一
定の濃度においてインキュベートされうる。それゆえ、
標識された分析対象物質と標識されていない分析対象物
質とのあいだで抗体結合部位に対する競争がおこり、抗
体によって結合され標識された分析対象物質の量は、存
在する標識されていない分析対象物質の量に反比例する
。生成された抗体結合複合体は、たとえば抗体結合複合
体または結合していない分析対象物質（標識されたちの
および標識されていないもの）のどちらかの免疫吸収（
ｉ１１１１＋１ｕｎｏａｂｓＯｒｌ）ｔｉｏｎ）、物理
化学的吸着または沈降によって分離される。つぎに、標
識された抗体結合分析対象物質を測定し、既知の分析対
象物質濃度（標準）から標準曲線を作図する。

未知の試料中における分析対象物質の濃度もこの曲線か
ら読みとりうる。小さな分子のイムノアッセイのばあい
には、標識されたリガンドは、共有結合的に標識と結合
しうる標識された分析対象物質または分析対象物質の誘
導体（類似体）である。しかしながら、一般に小さな分
子に結合しつる標識の数には限度があり、このことは該
分子の大きさによってほとんど決められる。　　　　　
　　［そのうえ、小さな分子をその誘導体にしたり（ｄ
ｅｒ＋ｖａｔ；ｚａＨｏｎ）分子の大きさが比較的大き
な標ｖＡ（たとえば　　■または酵素）を導入したすす
ると、たとえば誘導体の側鎖を認識する抗体のような特
別の抗体の有用性を制限し、いわゆる「架橋効果（ｂｒ
ｉｄｇｅ　ｅｆｆｅｃｔ）　Ｊを示すような仕方で、標
識されていない分析対象物質に対する親和性に比べて標
識された分析対象物質に対する抗体の親和性が変化され
うる。親和性・が変化するという後者の問題は、ハプテ
ンの誘導体側鎖に対してほとんど親和性を示さない抗体
く単クローン性または多価性）を用いることによって、
または抗原を構成するために用いられた誘導体側鎖とは
異なる誘導体側鎖を用いることによって克服されうる。

イムノメトリックアッセイは、標識された分析対象物質
のかわりに標識抗体を用い、大きな分子、特に２個また
はそれ以上の別個の抗原性部位（エピトープ）を有する
タンパク質の測定にとりわけ有用である。このタイプの
アッセイでは１またはそれ以上の抗体のポピユレーショ
ンが「捕捉抗体（ｃａｔｃｈｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ
）　Ｊとして用いられ、該捕捉抗体は固相支持体上に固
定されてもよいし、または該捕捉抗体に対して特異的に
向けられた第２の抗体によって免疫沈降されてもよい。

後者は、「捕捉抗体」が「標識抗体」とは異なる種類に
おいて産生されるばあいにのみ可能である。「標識抗体
」は１またはそれ以上の抗体のポピユレーションを純粋
にｍ製したものであり、該標識抗体は「捕捉抗体」とは
異なるエピトープを好んで認識するが、このことは必ず
しも必要なことではない。分析対象物質を標準量で、ま
たは生物学的試料中の分析対象物質を未知の濃度でイン
キュベートするあいだに、「捕捉抗体」、分析対象物質
および「標識抗体」のあいだで「サンドイッチ」が形成
される。それゆえ、「捕捉抗体」および「標識抗体」が
過剰量で存在していると、そのような「サンドインチ」
に付着している「標識抗体」の曇は存在している分析対
象物質の量に正比例し、それによって定量的な測定の根
拠かえられる。

イムノメトリック技術は、従来の競争的イムノアッセイ
に対して数多くの利点を提供する。

たとえば、イムノメトリック５法では標識された分析対
象物質を純粋に調製する必要がない。試薬を過剰口で用
いるため試薬をピペットで精密に移す必要が減少し、反
応の動力学（ｒｅａｃｔｉｏｎｂｔｎｅｔｒｃｓ）が増
加し、それによってインキュベートする時間が短くなる
。しかしながら、単クローン性抗体が生産されるように
なって唯一の特異性を有する抗体を大量に生産する問題
が少なからず単純化されて以来、このイムノメトリック
技術の重要性が充分に評価されるようになったのはごく
最近のことである。にもかかわらず、２個以上の抗体が
同時に小さな分子と相互反応することは立体的に不可能
であるという主な理由から、標識抗体イムノメトリック
アッセイを小さな分子量のハプテンに応用することは制
限されてきた。

この問題を克服する試みは、免疫原性の目的に用いられ
るタンパク質以外のタンパク質に接合したハプテンを「
固相」支持体に固定することによってなされている（ヨ
ーロッパ特許公開第２８１３２号明細！参照）。このこ
とによって標識抗体結合部位に対して分析対象物質とタ
ンパク接合ハプテンとのあいだに競争反応の起こること
が可能になる（ヨーロッパ特許公開第２８１３３号明細
書および英国特許第１５５０３２０号明細書参照）。そ
れゆえ一定量のタンパク接合ハプテンと標識抗体が用い
られる条件のもとでは、タンパク接合ハプテンに結合す
ることのできる標識抗体の凶は標準または未知の試料中
に存在する分析対象物質の量に反比例する。この型の実
験観察記録によって小さな分子のイムノアッセイに標識
抗体を用いることが可能になるが、この系に加えられた
タンパク接合ハプテンの量は部分的にアッセイの範囲と
感度に影響を及ぼし、個々のアッセイ管または浅い水ば
ち中に存在するタンパク接合ハシテンの相対量がアッセ
イの精密さを大部分決定する。タンパク質分子が固相支
持体へ受動的または能動的に吸着する有効性が当てにな
らず制御することが回能なので、叙上のことは格別の問
題である。その上、大量のタンパク接合ハプテンが要求
され、またその特質はバッチによって変化しうる。

叙上の問題点は本発明によって克服される。

本発明によれば、タンパク接合ハプテンは、ハプテンに
対する抗体をよび起こすために該ハプテンに結合して用
いられるタンパク質（たとえばウシの血清アルブミン）
とは異なるタンパク質（たとえばチログロブリン）を用
いて製造される。タンパク接合ハプテンは、同じ誘導体
側鎖が用いられているばあいには、それに対して抗血清
がつくられたハプテン接合体中に存在する領域以外のハ
プテンの領域をほとんど認識しない抗血清からの抗体の
ポピユレーション内（ｓｕｂ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ
）のアフィニティ精製（ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒＨｉ
ｃａｔｉｏｎ）に用いることもできる。加えて、異なる
側鎖を用いると側鎖それ自体を認識して結合する抗体が
結合するのを排除するであろうので異なる側鎖もまた用
いることができる。しかしながら、タンパク質（チログ
ロブリン）がそれに向けられた過剰の抗体く・たとえば
抗チログロブリン抗血清）によって免疫化学的に分離す
ることができ、それを固相支持体に付着させる。ことが
できるという事実によって、接合タンパク質の主な機能
は、液相中の標識抗体結合部位に対して分析対象物質と
自由に競争するハプテンのキャリヤーとして働くことで
ある。このようにして一定日のタンパク接合ハプテンが
、種々の量の標準または未知の血清試料の存在下で標識
抗体とともにインキュベートされる。タンパク接合ハプ
テンに結合した標識抗体の量は、標準または未知の試料
中の分析対象物質の量に反比例するであろう。タンパク
接合ハプテン−標識抗体複合体は、該タンパク質に対す
る抗体によって免疫化学的にインキュベートから特異的
に取り除かれる。後者の抗体は反応容器／管の壁に吸着
されるかまたは固相支持体に結合され、短時間のインキ
ュベーションののちに物理的に分離される。

したがって本発明は、 （Ｉｌ　［１）定器されるハプテン （２）ハプテンとハプテンの高分子キャリヤー（１）と
の接合体に対して産生された該ハプテンに対する標識抗
体および （３）該キャリヤー（１）とは異なるハプテンの高分子
キャリヤーα）と該ハプテンとの接合体からなる混合物
を、該ハプテン（１）および該ハプテン接合体（３）が
該標識抗体（２）のハプテン結合部位に結合するような
条件下で生成させること、 （Ｉ［］該混合物を生成させる前、生成させるあいだ、
または生成後にハプテン接合体（３）を固定すること、
および （２）定量されるハプテン（１）上の固定されたハプテ
ン接合体（３）に付着した標識を測定することからなる
ハプテンの定量のためのイムツメ°トリック法を提供す
る。

本発明はまた、分析対象物質に固有のエピトープのみを
認識し分析対象物質ハプテンの誘導体側鎖はｉ！議しな
い抗血清からの多価抗体ポピユレーションのアフイニテ
イ精製をも可能にする。このことは免疫の目的のために
用いられるタンパク質（たとえばウシの血清アルブミン
）とは異なるタンパク質（たとえばチログロブリン）に
ハプテンを結合させることによって達成される。チログ
ロブリン−ハプテンは、たとえば臭化シアン活性セファ
ロース（ｃｙａｎｏｇｅｎｂｒｏｍｉｄｅ　ａｃｔｉｖ
ａｔｅｄ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂ　ＣＬ上に固定さ
れ、あるハプテン接合体（たとえばウシの血清アルブミ
ン−ハプテン）に対して生成された抗血清が他の固定さ
れたハプテン接合体（たとえばチログロブリン−ハプテ
ン）とともにインキュベートされ、その結果、該ハプテ
ンに対する抗体がそれ自身選択的に固定される。チログ
ロブリン−へブテン　アフイニテイマトリックスの広範
囲にわたる洗浄ののち、誘導体側鎖ではなくてハプテン
と分゛□析対象物質の両方に共通する領域に最大のアフ
イニテイを示す抗体が過剰の分析対象物質との競争によ
ってチログロブリン−ハプテン　アフイニテイマトリッ
クスから取り除かれ、該分析対象物質はつづいて透析ま
たは物理的吸着によって抗体から取り除かれる。こうし
て問題のハプテンに対して高度の特異性を有する抗体の
製造が可能になる。

本発明においては、免疫応答をひき起こすことのできる
ものであればいかなる型のタンパク質または合成ポリペ
プチドをもハプテンの接合のために用いることができる
。加えて、天然または合成を問わずいかなる小さな化合
物分子（たとえば薬剤、ホルモンまたは他の生物学的に
活性な低分子量化合物）をも本発明の技術によって測定
することができる。

たとえば固定された抗チログロブリン抗体を用いる叙上
の分離法は、他のタンパク質または合成分子に応用する
こともでき、またハプテンに接合させるために用いられ
たタンパク質に対して向けられた抗体を結合し分離する
ために、固定された抗体が用いられる第２の抗体システ
ムを包含するまでに拡張することもできる。

本発明はまた本発明の範囲内において、（１）ハプテン
に対するｓｉｔ抗体 （２）該標識抗体（１）を産生ずるために用いられたキ
ャリヤーとは異なるハプテンの高分子キャリヤーと該ハ
プテンとの接合体 （３）該ハプテン接合体を固定するための手段および （４）定器されるハプテンの目盛り標準（ｃａｌｉｂｒ
ａｔｉｏｎ　５ｔａｎｄａｒｄｓ）からなる本発明に有
用なアッセイ装置も含む。

アッセイ法に用いられたハプテン接合体を固定するため
の手段は、該接合体のハプテンでないエピトープに対す
る抗体であるのが好ましく、該抗体はそれ自身固相のキ
ャリヤーまたは支持体（たとえばアッセイに用いられた
プラスチック管の内部またはカオリンのような不活性パ
ウダー）に付着される。またはアビジンのような他の結
合剤も用いることができ、そのばあいにはアビジンが固
相に結合されハプテンがビオチン化される（ｂｉｏｔｉ
ｎｙ’１ａｔｅｄ）　（すなわちビオチンに結合される
）か、または逆にハプテンがアビジンに結合され固相が
ビオチン化される。

本発明による新規な方法に用いられる標識は、たとえば
放射性同位体、酵素、螢光分子、リン光分子、冷光分子
またはスピンラベル分子のようなイムノメトリック　ア
ッセイ法および同様のアッセイ法に通常用いられるいか
なる標識であってもよい。

本発明による方法は、添付の第１図に図式的にあられさ
れているような方法で行なわれてよい。最初に既知の濃
度を有する測定されるべきハプテンの試料である標準分
析対象物質、または測定されるべき未知の分析対象物質
が、タンパク結合ハプテンおよびハプテンに対する標識
抗体（用いられたタンパク−ハプテン接合体中のタンパ
ク質とは異なるタンパク質に対して産生された標識抗体
）と混合される。タンパク−ハプテン接合体中のタンパ
ク質に対する抗体もまた固相支持体に付着させることに
よって固定されて用いられ、これはアッセイ管（たとえ
ばポリスチレン）の内部表面としてあられされている。

インキュベーションのあいだにハプテン接合体は固定さ
れた抗体に付着する。分析対象物質中のハプテンと固相
支持体に結合したハプテンは標識抗体に対して競争し、
その結果、標識のある部分は固定され、分析対象物質中
のハプテンに付着した残りの部分は固定されない。

それゆえ液相をデカントすることによって固定された標
識のみが残され、これはつぎに測定することができる。

濃度の知られた一連の分析対象物質を用いることによっ
て標準分析対象物質曲線を作図することができ、これに
よって未知の試料中のハプテンの量を読みとることが可
能になる。

つぎに本発明を実施例を用いてさらに詳しく説明するが
、本η明はかかる実施例にのみ限定されるものでない。

実施例 プロゲステロンの既知の１（ｏｌｉ、１０．３０゜１０
０および３０Ｑｎｍｏｌ／ｊ１　）を含有ｔ７；、ＷＡ
準ｔ　ト血′１２５ 清のアリクウォット５０μｇ各２本ずつを　　Ｉで標識
した単りローン性抗プロゲステロン抗体（アッセイバッ
ファー、すなわち０．２５　ｔｖｏｌ／ρのリン酸、０
．９％Ｎａｃｅ、　　０．６２５％ラクトース、０１２
５％ウシのガンマグロブリンおよび０．０５％アジ化ナ
トリウムを含有しｐＨが７．６であ□るリン酸バッファ
ー塩類中において１１０００００ｃｐ　）とともにポリ
スチレン管中、２０℃において１０分間インキュベート
した。単クローン性抗体はプログステロン−１１−ヘミ
スクシネート （ｈｅｍｔｓｕｃｃ＋ｎａｔｅ）：ウシ血清アルブミン
に対して産生され、プロティン　Ａ−セファロース　ア
フィニティー　りロマトグラフイーによって培地から精
製した。プロゲステロン−１１−ヘミスクシネート：ウ
シのチログロブリン接合体（アッセイバッファー中に１
　ｎｍｏｌ／　４１　）のアリクウオット１００μｇを
２本の管を除くすべぞの管に加えた。これらの２本の管
は非特異的な結合をモニタリングするために用いられ、
最低濃度のプロゲステロンを含有する標準血清（Ｏｎｍ
ｏｌ／　ＩＪ＞５０μ９、　　　■で標識された単クロ
ーン性抗体およびウシのチログロブリン１００μｆＪ（
アッセイバッファー中に１　ｎｍｏＩ／　ｊｌ　）を含
有していた。

さらに２０℃において３０分間インキュベートしたのち
、ウサギ抗ウシ　チログロブリン抗血清（アッセイバッ
ファー中に”ｌ　：　　５００）をすべての管に加え、
これをつぎに撹拌混合しくｖｏｒｔｅｘ−ｎ＋１ｘｅｄ
）２０℃において３０分間インキュベートした。

カオリン−ロバ抗ウサギ抗血清のアリクラット１ｍをす
べての管に加え、さらに２０℃において３０分間インキ
ュベートしたのち２０００１１１で１０分間遠心分離し
た。上ずみ液をデカントし、残りをマルチウェル（ｍｕ
ｌｔｉ−ｗｅｌｌ）ガンマカウンターでカウントした。

第２図に示されているような標準曲線を作図し起。第２
図においてＢ／Ｂｏは、非特異的結合を差し引いた最大
結合（ゼロ標準：Ｂｏ）に対する、非特異的結合を差し
引いた標準の結合パーセントをあられす。

プロゲステロンの未知の量を含、有する試料を用いて同
様のアッセイを行なえば、該試料５対する結合パーセン
ト（Ｂ／Ｂｏ）を定量することによって前記曲線から試
料中のプロゲステロンの濃度を読みとることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によるハプテンの定量のためのイムノメ
トリック法を図式的にあられした図、第２図は既知のプ
ロゲステロン濃度および測定され・た標識からえられた
標準曲線をあられす。 特許出願人　ファルモスーユヒチュメ・オニ、ｒ− 代理人弁理士　朝　日　奈　宗　太　ほか１名し１：、
・ 第　　１　　図 図面の浄宙（内容に変更なし） 手続ネ甫正書（方式） ％式％ １事件の表示 昭和６０年特許願第９４５３１、 発明の名称 ハプテンの定量のためのイムノメトリック法３補正をす
る者 事件との関係　　　　特　許　出　願　人任　所　　フ
ィンランド共和国、ニスエフ　２０１０１　　ツルク１
０、ペーエル　４２５ 名　称　　ファルモスーユヒチュメ・オニ代表者　へカ
ン・コトカ　　　　′ 代表者　ベツカ・ニレカンガス 国　籍　　フィンランド共和国 ４代理人　　〒５４０ ５補正命令の日付 昭和６０年７月３０日（発送日） ６補正の対象 （１）図面（第２図） ７補正の内容 （１）図面（第２図）の浄書（内容に変更なし）８添付
書類の目録

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　（ I ）（１）定量されるハプテン （２）ハプテンとハプテンの高分子キャリヤー（１）と
   の接合体に対して産生された該 ハプテンに対する標識抗体および （３）該キャリヤー（ｉ）とは異なるハプテンの高分子
   キャリヤー（ｉｉ）と該ハプテンとの接合体 からなる混合物を、該ハプテン（１）および該ハプテン
   接合体（３）が該標識抗体（２）のハプテン結合部位に
   結合するような条件下 で生成させること、 （II）該混合物を生成させる前、生成させるあいだ、ま
   たは生成後にハプテン接合体（３）を固定すること、お
   よび （III）定量されるハプテン（１）上の固定されたハプ
   テン接合体（３）に付着した標識を測定すること からなるハプテンの定量のためのイムノメトリック法。 ２　標識を測定する前に、標識され固定されたハプテン
   接合体（３）が標識ハプテン（１）から分離される特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ３　ハプテン接合体（３）が該ハプテン接合体に対する
   高い親和性を有する結合剤によって固定される特許請求
   の範囲第１項または第２項記載の方法。 ４　前記結合剤がハプテンの高分子キャリヤー（ｉｉ）
   に対する抗体またはアビジン−ビオチン系である特許請
   求の範囲第３項記載の方法。 ５　結合剤それ自体が固相のキャリヤーに固定される特
   許請求の範囲第３項または第４項記載の方法。 ６　前記固相のキャリヤーがカオリンである特許請求の
   範囲第５項記載の方法。 ７　ハプテンの高分子キャリヤー（ｉ）および（ｉｉ）
   が互いに異なるタンパク質または合成ポリペプチドであ
   る特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第
   ５項または第６項記載の方法。 ８　標識が放射性同位体、酵素、螢光分子、リン光分子
   、冷光分子またはスピンラベル分子である特許請求の範
   囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項ま
   たは第７項記載の方法。 ９　ハプテンが天然もしくは合成の薬剤、ホルモンまた
   は他の生物学的に活性な低分子量化合物である特許請求
   の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６
   項、第７項または第８項記載の方法。 １０　（１）ハプテンに対する標識抗体 （２）標識抗体（１）を産生するために用いられたキャ
   リヤーとは異なるハプテンの高分子キ ャリヤーと該ハプテンとの接合体 （３）該ハプテン接合体を固定するための手段および （４）定量されるハプテンの目盛り標準 からなり該ハプテンの定量に有用なアッセイ装置。 １１　前記ハプテン接合体（２）を固定するための手段
   （３）が、該ハプテンの高分子キャリヤーに対する抗体
   であり固相キャリヤーに直接または間接的に結合した抗
   体である特許請求の範囲第１０項記載のアッセイ装置。