FI78787C - Immunometrisk metod foer bestaemning av en hapten. - Google Patents
Immunometrisk metod foer bestaemning av en hapten. Download PDFInfo
- Publication number
- FI78787C FI78787C FI851620A FI851620A FI78787C FI 78787 C FI78787 C FI 78787C FI 851620 A FI851620 A FI 851620A FI 851620 A FI851620 A FI 851620A FI 78787 C FI78787 C FI 78787C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- hapten
- antibody
- conjugate
- analyte
- labeled
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 18
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 8
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 8
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 8
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 4
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 4
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- 101000800130 Bos taurus Thyroglobulin Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- -1 e.g. Proteins 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000013198 immunometric assay Methods 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003418 antiprogestin Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000003623 progesteronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
78787
Immunometrinen menetelmä hapteenin määrittämiseksi Immunometrisk metod för bestämning av en hapten Tämän keksinnön kohteena on hapteenien määrittäminen menetelmällä , jossa käytetään leimattuja vasta-aineita hapteenien konsentraation mittaamiseksi biologisissa näytteissä.
Immunomääritysmenetelmiä käytetään laajalti erityiskomponenttien molekyylien mittaamiseksi biologisista näytteistä, erityisesti potilaiden verinäytteistä prognostisiin, diagnostisiin tai muihin kliinisiin tarkoituksiin. Nykyään tärkeimmissä immunokemiallisissä analyysimenetelmissä käytetään mittaussignaaleina radioaktiivisia isotooppeja, molekyylejä, joilla on fluoresoivia tai bioluminesoivia ominaisuuksia tai entsyymeitä, jotka edesauttavat värinmuutoksia. Näitä kutsutaan yleensä leimausaineiksi.
Immunokemiallisissä analyyseissä käytettäviä vasta-aineita (immunoglobuliineja) on viime aikoihin saakka tuotettu anti-seerumien muodossa eläimissä (esim. kaneissa tai lampaissa) immunisoimalla antigeenillä, joka on tavallisesti itse ana-lyytti tai analyytin analogi, joka edistää analyyttiä tunnistavien vasta-aineiden tuotantoa.
Pienten, hapteeneiksi kutsuttujen molekyylien ollessa kysymyksessä jälkimmäinen lähestymistapa on erityisen tärkeä, koska molekyylit, joiden molekyylipaino on pienempi kuin n. 5000 daltonia, eivät ole luonnostaan immunogeenisiä ja ne täytyy konjugoida suurempaan kantajamolekyyliin, joka on tavallisesti proteiini, esim. naudan seerumialbumiini tai ty-roglobuliini. Antiseerumeissa läsnäolevat vasta-aineet, jotka ovat muodostuneet kutakin konjugoitunutta hapteenia vastaan, ovat monivalenttisia, so. antiseerumeissa on läsnä useita vasta-ainepopulaatioita, joista jokainen tunnistaa konjugoidun hapteenin molekulaarisen konfiguraation eri puolia. Vasta-aineet eroavat siten spesifisyydeltään. Tämä 2 78787 tietyssä antiseerumissa läsnäolevien vasta-aineiden moninaisuus voi olla edullista joissakin tapauksissa, erityisesti kun antigeeni on suuri proteiini, koska se edistää suurten, saostumaan kykenevien vasta-aine-antigeeni-kompleksien muodostumista. Kuitenkin jos halutaan spesifisten vasta-aineiden puhtaita preparaatteja, kuten käytettäessä immunometri-siä määritysmenetelmiä, täytyy käyttää monimutkaisia puhdistusmenetelmiä ja yleensä näiden tehokkuus on rajallinen.
Viime aikoina nämä ongelmat on voitettu kehittämällä menettelytapoja, joiden avulla voidaan tuottaa suuressa mittakaavassa monoklonaalisia hybridomasoluja, jotka erittävät yksittäistä vasta-ainetta, jolla on ainutlaatuinen affiniteetti ja spesifisyys tiettyyn antigeeniin. Kuitenkaan kaksi tai useampia vasta-aineita, jotka tunnistavat eri puolia hapteenista, jonka molekyylipaino on pienempi kuin 2000 dal-tonia (esim. steroidit ja monet lääkeaineet) ei kykene samanaikaisesti sitoutumaan yksittäiseen hapteenimolekyyliin, ja tämä on rajoittanut leimatun vasta-aineen käyttöä kaikkein pienimmän molekyylipainon omaavien yhdisteiden (immunometri-sissä) immunomääritysmenetelmissä.
Tavanomaisissa immunomääritysmenetelmissä analyytin tai ana-lyytin analogin puhdas preparaatti kytketään sopivaan lei-mausaineeseen, jonka luonne määrää käytettävän detektiomene-telmän. Esimerkiksi radioimmunomäärityksessä leimausaineena käytetään radioaktiivista isotooppia ja sen määrä voidaan mitata neste- tai kidetuikespektrometrillä.
Tätä leimattua analyyttiä tai analyytin analogia voidaan in-kuboida vakiokonsentraationa vakiomäärän kanssa vasta-ainetta, joka tunnistaa leimatun analyytin ja myös analyytin itsensä. Leimatun ja leimaamattoman analyytin välillä esiintyy siksi kilpailua vasta-aineen sitoutumiskohdasta, ja vasta-aineen sitoman leimatun analyytin määrä on kääntäen verrannollinen läsnäolevan leimaamattoman analyytin määrään. Muo- 3 78787 dostuneet vasta-aineeseen sitoutuneet kompleksit erotetaan, esim. immunoabsorptiolla, fysikaalis-kemiallisella adsorptiolla tai saostamalla joko vasta-aineeseen sitoutuneet kompleksit tai sitoutumaton analyytti (leimattu ja leimaamaton). Sitten mitataan vasta-aineeseen sitoutunut leimattu analyytti ja standardikäyrä laaditaan tunnettujen analyyttikonsent-raatioiden perusteella (standardit). Analyytin konsentraatio tuntemattomassa näytteessä voidaan lukea tältä käyrältä. Kun on kysymys pienten molekyylien immunomääritysmenetelmistä, leimattu ligandi on leimattu analyytti tai analyytin johdannainen (analogi), joka voi olla kovalenttisesti sitoutunut leimausaineeseen. On kuitenkin yleensä olemassa raja pieneen molekyyliin sitoutuneiden leimausaineiden lukumäärälle ja tämä määräytyy suureksi osaksi molekyylin koon perusteella. Lisäksi pienten molekyylien muuttaminen johdannaisikseen tai suhteellisen suuren molekyylipainon omaavien leimausaineiden (esim. 125j tai jokin entsyymi) liittäminen voi muuttaa vasta-aineen affiniteettia leimattuun analyyttiin, suhteessa sen affiniteettiin leimaamattomaan analyyttiin siten, että ilmiö rajoittaa tiettyjen vasta-aineiden käyttökelpoisuutta, esimerkiksi sellaisten vasta-aineiden, jotka tunnistavat johdannaisen sivuketjun, ja niissä ilmenee nk. "siltaefek-ti". Jälkimmäinen ongelma voidaan voittaa käyttämällä vasta-aineita (monoklonaalisia tai polyvalenttisia), jotka osoittavat heikkoa affiniteettia hapteenin johdannaisen sivuketjuun tai käyttämällä erilaista johdannaissivuketjua kuin antigeeniä muodostettaessa on käytetty.
Immunometrisissä määritysmenetelmissä käytetään leimattuja vasta-aineita leimatun analyytin sijasta ja ne ovat erityisen käyttökelpoisia suurten molekyylien, esim. proteiinien mittauksiin, joilla on kaksi tai useampia erillisiä antigeenisiä kohtia eli epitooppeja. Tämäntyyppisissä analyyseissä käytetään yhtä tai useampia vasta-ainepopulaatioita "pyydystävänä vasta-aineena", joka voidaan immobilisoida 4 78787 kiinteäfaasikantajaan tai joka voidaan immunosaostaa toisella vasta-aineella, joka on spesifisesti suuntautunut sitä vastaan. Jälkimmäinen on mahdollista ainoastaan jos "pyydystävä vasta-aine" on muodostettu eri lajissa kuin "leimattu vasta-aine". "Leimattu vasta-aine" on yhden tai useamman vasta-ainepopulaation puhdas preparaatti, joka mieluiten tunnistaa eri epitoopin (epitoopit) kuin "pyydystävä vasta-aine", vaikkakaan tämä ei ole välttämätöntä. Inkuboitaessa analyytin vakiomäärien kanssa tai analyytin biologisissa näytteissä olevien tuntemattomien konsentraatioiden kanssa muodostuu "pyydystävän vasta-aineen", analyytin ja "leimatun vasta-aineen" välille "sandwich"-rakenne. Sen vuoksi, kun läsnä on ylimäärä sekä "pyydystävää" että "leimattua" vasta-ainetta, tällaiseen "sandwich"-rakenteeseen kiinnittyneen "leimatun vasta-aineen" määrä on suoraan verrannollinen läsnäolevan analyytin määrään ja sen vuoksi luo perustan kvantitatiiviselle mittaukselle.
Immunometrisillä menetelmillä on lukuisia etuja verrattuna tavanomaisiin kompetitiivisiin immunomääritysmenetelmiin, ne esim. poistavat leimattujen analyyttien puhtaiden preparaattien tarpeen. Reagenssien ylimäärän käyttäminen myös vähentää reagenssien tarkan pipetoinnin tarvetta, lisää reaktio-kinetiikkaa ja lyhentää siten inkubointiaikoja. Tämän tekniikan tärkeys on kuitenkin oivallettu täysin vasta äskettäin, erityisesti sen jälkeen kun monoklonaalisten vasta-aineiden tuotanto on oleellisesti yksinkertaistanut ainutlaatuisen spesifisyyden omaavien vasta-aineiden suurien määrien tuotantoa. Leimattujen vasta-aineiden käyttö määritettäessä pienimolekyylipainoisia hapteeneita immunometrisesti on kuitenkin ollut rajoitettua, pääasiassa sen vuoksi, että useamman kuin yhden vasta-aineen on voinut olla steerisesti mahdotonta olla samanaikaisesti vuorovaikutuksessa pienen molekyylin kanssa.
5 78787
Eräs yritys tämän ongelman voittamiseksi on tehty immobili-soimalla proteiineihin konjugoituneita hapteeneita (muita kuin antigeenisiin tarkoituksiin käytettyjä) "kiinteäfaasi"-kantajaan, ks. EP-patenttijulkaisu n:o 0028132. Tämä tekee mahdolliseksi kompetitiivisen reaktion esiintymisen leimatun vasta-aineen sitoutumiskohtaan analyytin ja proteiiniin kon-jugoituneen hapteenin välillä; ks. EP-patenttijulkaisu n:o 0028133 ja GB-patenttijulkaisu n:o 1550320. Sen vuoksi sellaisissa olosuhteissa, joissa käytetään vakiomäärää proteiiniin konjugoitunutta hapteenia ja leimattua vasta-ainetta, proteiiniin konjugoituneeseen hapteeniin sitoutumaan kykenevän leimatun vasta-aineen määrä on kääntäen verrannollinen standardeissa tai tuntemattomissa näytteissä läsnäolevan analyytin määrään. Vaikkakin tämäntyyppinen menettelytapa mahdollistaa leimattujen vasta-aineiden käytön pienten molekyylien immunomääritysmenetelmissä, systeemiin lisätyn proteiiniin konjugoituneen hapteenin määrä osittain vaikuttaa määrityksen mittausalueeseen ja herkkyyteen, ja proteiiniin konjugoituneen hapteenin suhteellinen määrä kussakin yksittäisessä määritysputkessa tai kyvetissä määrää (suureksi osaksi) mittaustarkkuuden. Tämä on ongelma erityisesti siksi, että se teho, jolla proteiinimolekyylit passiivisesti, tai aktiivisesti, adsorboituvat kiinteäfaasikantajiin, on epävarma, ja sitä on vaikea kontrolloida. Lisäksi tarvitaan suuria määriä proteiiniin konjugoitunutta hapteenia, jonka ominaisuudet saattavat muuttua erästä toiseen.
Yllämainitut ongelmat on voitettu tässä keksinnössä, jonka mukaisesti proteiiniin konjugoitunut hapteeni valmistetaan käyttämällä eri proteiinia (esim. tyroglobuliinia) kuin sitä, jota on käytetty konjugoimaan hapteeni sen vasta-aineiden tuottamista varten (esim. naudan seerumialbumiini). Jos käytetään samaa johdannaissivuketjua, voidaan konjugoitunutta hapteenia käyttää sellaisesta antiseerumista saatujen vasta-aineiden alapopulaatioiden affiniteettipuhdistukseen, 6 78787 joka tunnistaa huonosti muita hapteenialueita kuin sen (erilaisen) hapteenikonjugaatin alueita, jota vastaan anti-seerumi valmistettiin. Lisäksi voidaan käyttää myös erilaista sivuketjua, koska tämä eliminoi sellaisten vasta-aineiden sitoutumisen, jotka tunnistavat itse sivuketjua ja sitoutuvat siihen. Konjugoituneen hapteenin päätehtävä on kuitenkin toimia kantajana hapteenille, joka on vapaa kilpailemaan analyytin kanssa leimatun vasta-aineen sitoutumiskohdista nestefaasissa, sen perusteella, että proteiini (tyroglobu-liini) voidaan eristää immunokemiallisesti sitä vastaan suunnattujen vasta-aineiden (esim. antityroglobuliini-antiseerumin) ylimäärän avulla, jotka vasta-aineet voidaan kiinnittää kiinteäfaasikantajaan. Tällä tavoin kiinteä määrä proteiiniin konjugoitunutta hapteenia inkuboidaan yhdessä leimatun vasta-aineen kanssa, kun läsnä on vaihtelevat määrät standardeja tai tuntemattomia seeruminäytteitä. Proteiiniin konjugoituneeseen hapteeniin sitoutuneen leimatun vasta-aineen määrä on kääntäen verrannollinen standardeissa tai tuntemattomissa näytteissä olevan analyytin määrään. Proteiiniin konjugoituneen hapteenin ja leimatun vasta-aineen kompleksit poistetaan spesifisesti inkubaateista immunokemiallisesti proteiinin vasta-aineiden avulla. Nämä jälkimmäiset vasta-aineet voidaan absorboida reaktioastian/ putken seinämiin tai liittää kiinteäfaasikantajaan ja erottaa fysikaalisesti lyhyen inkubointijakson jälkeen.
Tässä keksinnössä esitetään siten immunometrinen menetelmä hapteenin määrittämiseksi, jossa menetelmässä valmistetaan seos, joka sisältää määritettävän hapteenin, mainitun hapteenin leimatun vasta-aineen ja kyseisen hapteenin konjugaa-tin makromolekulaarisen hapteenikantajan kanssa, sellaisissa olosuhteissa, että hapteeni ja hapteenikonjugaatti sitoutuvat leimatun vasta-aineen hapteeni-sitoutumiskohtiin, ja mitataan sen leimausaineen määrä, joka on kiinnittynyt määritettävän hapteenin immobilisoituun hapteenikonjugaattiin.
7 78787
Menetelmälle on tunnusomaista, että hapteenikonjugaatin mak-romolekulaarinen hapteenikantaja on erilainen kuin se hap-teenikantaja, jota on käytetty vasta-aineen valmistuksessa, ja immobilisoidaan hapteenikonjugaatti antamalla sen reagoida immobilisoivan vasta-aineen ylimäärän kanssa, joka vasta-aine on spesifinen makromolekulaariselle hapteenikantajalle.
Tämä keksintö mahdollistaa myös polyvalenttisten vasta-aine-populaatioiden affiniteettipuhdistuksen, jotka vasta-aineet on saatu antiseerumista, joka tunnistaa vain analyytille ainutlaatuisia epitooppeja eikä analyyttihapteenin johdannais-sivuketjua. Tämä saadaan aikaan kytkemällä hapteeni eri proteiiniin (esim. tyroglobuliini) kuin siihen, jota käytettiin immunisointitarkoitukseen (esim. naudan seerumialbumiini). Tyroglobuliini-hapteeni immobilisoidaan esimerkiksi syaani-bromidilla aktivoituun Sepharose 4B CL:ään ja yhtä hapteeni-konjugaattia, esim. naudan seerumialbumiinihapteenia vastaan valmistettuja antiseerumeita inkuboidaan toisen immobilisoi-dun hapteenikonjugaatin, esim. tyroglobuliini-hapteenin kanssa siten, että hapteenin vasta-aineet itse immobilisoituvat selektiivisesti. Tyroglobuliini-hapteenin affiniteettimat-riisin perusteellisen pesun jälkeen ne vasta-aineet, jotka osoittavat voimakkainta affiniteettia hapteenin ja analyytin yhteisiin alueisiin eivätkä johdannaissivuketjuun, poistetaan tyroglobuliini-hapteeni-affiniteettimatriisista analyyt-tiylimäärän kanssa, joka analyytti poistetaan tämän jälkeen vasta-aineesta dialyysillä tai fysikaalisella adsorptiolla. Tämä tekee mahdolliseksi sellaisten vasta-aineiden tuotannon, joilla on voimakas spesifisyys kysymyksessä olevaan hapteeniin.
Tässä keksinnössä voidaan hapteenin konjugoimiseksi käyttää minkätyyppistä proteiinia tai synteettistä polypeptidiä tahansa, joka saa aikaan immuunivasteen. Lisäksi keksinnön mukaisella tekniikalla voidaan mitata mitä tahansa pienimole- 8 78787 kyylistä yhdistettä, luonnollista tai synteettistä (esim. lääkeainetta, hormonia tai muuta biologisesti aktiivista pienimolekyylipainoista yhdistettä).
Esitettyä eristysmenetelmää voidaan soveltaa myös (käyttämällä esim. immobilisoitua antityroglobuliinivasta-ainetta) muihin proteiineihin tai synteettisiin molekyyleihin ja sitä voidaan laajentaa sisältämään toista vasta-ainejärjestelmää, joissa immobilisoitua vasta-ainetta voidaan käyttää haptee-nin konjugoimiseen käytetyn proteiinin vasta-aineiden sitomiseen ja erottamiseen.
Keksinnön piiriin kuuluu keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävä analyysipakkaus, jossa on (1) kyseessä olevan hapteenin leimattu vasta-aine, (2) mainitun hapteenin konju-gaatti makromolekulaarisen hapteenikantajan kanssa, joka on eri kuin leimattua vasta-ainetta (l) valmistettaessa käytetty, (3) välineet kyseisen hapteenikonjugaatin (2) immobili-soimiseksi ja (4) määritettävän hapteenin kalibrointistan-dardit.
"Välineet määritysmenetelmässä käytettävän hapteenikonjugaatin immobilisoimiseksi" tarkoittaa edullisesti mainitun kon-jugaatin ei-hapteeni-epitoopin vasta-ainetta, joka itse on kiinnittynyt kiinteään kantajaan, esim. määrityksessä käytetyn muoviputken sisäpuolelle tai inerttiin jauheeseen, kuten kaoliiniin. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää jotain muuta sideainetta kuten avidiinia, jolloin avidiini voi olla sitoutunut kiinteään faasiin ja hapteeni voi olla biotinyloitu (so. sitoutunut biotiiniin), tai päinvastoin (hapteeni voi olla kytketty avidiiniin ja kiinteä faasi voi olla biotinyloitu) .
Uudessa menetelmässä käytetty leimausaine voi olla mikä tahansa immunometrisissä ja samankaltaisissa määritysmene- 9 78787 telmissä tavallisesti käytetty leimausaine, esim. jokin radio-isotooppi, entsyymi tai fluoresoiva, fosforoiva, lumine-soiva tai spin-leimattu molekyyli.
Tämän keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa liitteenä olevien piirustusten kuviossa 1 kaaviomaisesti esitetyllä tavalla. Aluksi standardianalyytti, so. määritettävä hapteeninäyte, jolla on tunnettu konsentraatio, tai määritettävä tuntematon analyytti sekoitetaan proteiiniin kytkettyyn hapteeniin ja hapteenin leimattuun vasta-aineeseen (joka on valmistettu eri proteiinia vastaan kuin mitä on käytetty proteiini-hapteeni-konjugaatissa). Käytetään myös proteiini-hapteeni-konjugaatissa läsnäolevan proteiinin vasta-ainetta, joka on immobilisoitu kiinnittämällä kiinteään kantajaan, jota esittää määrityksessä käytetyn putken (esim. polystyreeniä) sisäpinta. Inkuboinnin aikana haptee-nikonjugaatti kiinnittyy immobilisottuun vasta-aineeseen. Analyytissä oleva hapteeni ja kiinteään kantajaan kiinnittynyt hapteeni kilpailevat leimatusta vasta-aineesta siten, että osa leimausaineesta immobilisoituu ja loppu (se, joka kiinnittyy analyytissä olevaan hapteeniin) ei immobilisoidu. Nestefaasin dekantointi jättää vastaavasti jäljelle vain im-mobilisoidun leimausaineen, joka siten voidaan mitata. Käyttämällä analyyttisarjaa, jossa on tunnettu hapteenikon-sentraatio voidaan laatia standardi-analyyttikäyrä, josta voidaan lukea tuntemattomassa näytteessä olevan hapteenin määrä.
Seuraava esimerkki kuvaa keksintöä.
Esimerkki
Kahta rinnakkaista 50 l:n näytettä ihmisen seerumistandar-dia, joka sisälsi tunnetun määrän progesteronia (0, 1, 10, 30, 100 ja 300 nmoolia/1) inkuboitiin (10 min. 20 °C:ssa) 10 78787 polystyreeniputkissa yhdessä 100 l:n kanssa 125I-leimattua monoklonaalista anti-progesteroni-vasta-ainetta (100 000 cpm määrityspuskurissa, so. fosfaattipuskuroitu suolaliuos, joka sisälsi fosfaattia (0,25 nmoolia/1), 0,9 % NaCl, 0,625 % laktoosia, 0,125 % naudan gammaglobuliinia, 0,05 % natrium-atsidia, pH 7,6). Monoklonaalinen vasta-aine oli tuotettu progesteroni-il-hemisukkinaatti:naudan seerumialbumiinia vastaan ja puhdistettu viljelyalustasta proteiini-A-Sepharose-affiniteettikromatografialla. 100 1 erä progeste- roni-ll-hemisukkinaatti rnaudan tyroglobuliini-konjugaattia (1 nmoolia/1 määrityspuskurissa) lisättiin kaikkiin muihin paitsi kahteen putkeen. Näitä kahta putkea käytettiin ei-spesifisen sitoutumisen tarkkailemiseksi ja ne sisälsivät 50 1 alhaisimman progesteronipitoisuuden omaavaa standardisee-rumia (0 nmoolia/1), 125I-leimattua monoklonaalista vasta-ainetta ja naudan tyroglobuliinia (100 1, 1 nmooli/1 määri tyspuskurissa). Kun oli inkuboitu edelleen (30 min. 20 °C:ssa), kaikkiin putkiin lisättiin 100 1 kaniinin anti- nauta-tyroglobuliini-antiseerumia (1:500 määrityspuskurissa), sitten vortex-sekoitettiin ja inkuboitiin 30 minuuttia 20 °C:ssa. 1 ml:n erä kaoliini-aasi-antikaniini-antiseerumia lisättiin kaikkiin putkiin ja 30 minuutin kuluttua (20 °C) nämä sentrifugoitiin (2000 g, 10 minuuttia). Supernatantti dekantoitiin ja jäännös laskettiin monikanava-gammalaskijalla. Laadittiin standardikäyrä, kuten kuviossa 2 on esitetty. Tässä kuviossa B/B0 tarkoittaa standardien prosentuaalista sitoutumista (miinus ei-spesifinen sitoutuminen) verrattuna maksimisitoutumiseen (nollastandardi: Bq) miinus ei-spesifinen sitoutuminen.
Mikäli samanlainen määritys suoritetaan käyttämällä tuntemattoman progesteronimäärän sisältävää näytettä, näytteelle saatu prosentuaalinen sitoutuminen (B/B0) tekee mahdolliseksi näytteessä olevan progesteronin konsentraation lukemisen tältä käyrältä.
Claims (3)
1. Immunometrinen menetelmä hapteenln määrittämiseksi, jolloin valmistetaan seos, joka sisältää (l) määritettävän hap-teenin, (2) mainitun hapteenin leimatun vasta-aineen ja (3) kyseisen hapteenin konjugaatin makromolekulaarisen hapteeni-kantajan kanssa, sellaisissa olosuhteissa, että hapteeni (1) ja hapteenikonjugaatti (3) sitoutuvat leimatun vasta-aineen (2) hapteeni-sitoutumiskohtiin, ja mitataan sen leimausai-neen määrä, joka on kiinnittynyt määritettävän hapteenin (1) immobilisoituun hapteenikonjugaattiin (3), tunnettu siitä, että hapteenikonjugaatin (3) makromolekulaarinen hap-teenikantaja on erilainen kuin se hapteenikantaja, jota on käytetty vasta-aineen (2) valmistuksessa, ja immobilisoidaan hapteenikonjugaatti (3) antamalla sen reagoida immobilisoi-van vasta-aineen ylimäärän kanssa, joka vasta-aine on spesifinen makromolekulaariselle hapteenikantajalle.
2. Analyysipakkaus käytettäväksi hapteenin määrittämiseksi patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä, tunnet-t u siitä, että se sisältää (1) mainitun hapteenin leimatun vasta-aineen, (2) mainitun hapteenin konjugaatin makromolekulaarisen hapteenikantajan kanssa, joka on eri kuin leimattua vasta-ainetta (1) valmistettaessa käytetty, (3) välineet kyseisen hapteenikonjugaatin (2) immobilisoimiseksi ja (4) määritettävän hapteenin kalibrointistandardit.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen analyysipakkaus, tunnettu siitä, että "välineet (3) hapteenikonjugaatin (2) immobilisoimiseksi" tarkoittaa mainitun makromolekulaarisen hapteenikantajan vasta-ainetta, joka on sitoutunut suoraan tai epäsuorasti kiinteään kantajaan.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8411706 | 1984-05-08 | ||
| GB08411706A GB2158578B (en) | 1984-05-08 | 1984-05-08 | Immunometric method for the determination of a hapten |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI851620A0 FI851620A0 (fi) | 1985-04-24 |
| FI851620L FI851620L (fi) | 1985-11-09 |
| FI78787B FI78787B (fi) | 1989-05-31 |
| FI78787C true FI78787C (fi) | 1989-09-11 |
Family
ID=10560620
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI851620A FI78787C (fi) | 1984-05-08 | 1985-04-24 | Immunometrisk metod foer bestaemning av en hapten. |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0161107A3 (fi) |
| JP (1) | JPS6134466A (fi) |
| DK (1) | DK161168C (fi) |
| FI (1) | FI78787C (fi) |
| GB (1) | GB2158578B (fi) |
| NO (1) | NO164135C (fi) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0282192A1 (en) * | 1987-03-09 | 1988-09-14 | Quidel | Competitive immunoassay for haptens using protein-hapten coupled solid phase |
| EP0366673B1 (en) * | 1987-06-09 | 1992-09-16 | Cambridge Life Sciences Plc | Immunoassay method |
| EP0396570B1 (en) * | 1987-11-28 | 1994-07-20 | Cambridge Patent Developments Limited | Determination method, use and components |
| US5468651A (en) * | 1987-11-28 | 1995-11-21 | Cambridge Patent Developments Limited | Method for determining haptens, use of method and components useful in method |
| DE4214922C2 (de) * | 1992-05-06 | 1996-06-13 | Brahms Diagnostica Gmbh | Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Anteils der freien Form eines Schilddrüsenhormon-Liganden in einer biologischen Flüssigkeit und Kit zur Durchführung eines solchen Verfahrens |
| GB2270976A (en) * | 1992-09-18 | 1994-03-30 | Marconi Gec Ltd | Immunoassay/separation process using an auxiliary species on a support |
| DE4440487A1 (de) * | 1994-11-12 | 1996-05-15 | Behringwerke Ag | Heterogener Immunoassay mittels präzipitierbarer Festphase |
| JP5817720B2 (ja) * | 2010-05-18 | 2015-11-18 | 味の素株式会社 | 含硫黄アミノ酸誘導体 |
| CN104364652A (zh) * | 2012-04-20 | 2015-02-18 | Zbx公司 | 用于检测样品中的分析物的固相载体和方法 |
| JP6040595B2 (ja) * | 2012-07-02 | 2016-12-07 | 東ソー株式会社 | ハプテン標準液およびそれを含むハプテン定量試薬 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5341420A (en) * | 1976-09-29 | 1978-04-14 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunochemically measuring methoa of hapten |
| JPS5344622A (en) * | 1976-09-30 | 1978-04-21 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunologically measuring method |
| US4235960A (en) * | 1977-07-29 | 1980-11-25 | The Medical College Of Wisconsin, Inc. | Competitive enzyme-linked immunoassay |
| FR2403556A1 (fr) * | 1977-09-19 | 1979-04-13 | Merieux Inst | Nouveau materiau poreux pour chromatographie, sa preparation et son application |
| AU6295180A (en) * | 1979-10-26 | 1981-04-30 | Dynasciences Corp. | Competitve binding assay for haptens + antigens |
| AU533026B2 (en) * | 1979-10-26 | 1983-10-27 | Dynasciences Corp. | Passively adsorbing immuno-reactive haptens to solid phases |
| GB2084317B (en) * | 1980-09-30 | 1984-01-18 | Erba Farmitalia | Antigen-linked competitive enzymeimmunoassay |
| DE3150878A1 (de) * | 1981-12-22 | 1983-06-30 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | "verfahren und reagenz zur bestimmung von creatinin" |
| EP0089806B1 (en) * | 1982-03-22 | 1989-06-28 | AMERSHAM INTERNATIONAL plc | Assay for the free portion of substances in biological fluids |
-
1984
- 1984-05-08 GB GB08411706A patent/GB2158578B/en not_active Expired
-
1985
- 1985-04-24 FI FI851620A patent/FI78787C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-05-01 JP JP9453185A patent/JPS6134466A/ja active Pending
- 1985-05-03 EP EP85303174A patent/EP0161107A3/en not_active Withdrawn
- 1985-05-07 DK DK202285A patent/DK161168C/da not_active IP Right Cessation
- 1985-05-07 NO NO851807A patent/NO164135C/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO164135C (no) | 1990-08-29 |
| NO164135B (no) | 1990-05-21 |
| DK161168C (da) | 1991-11-18 |
| EP0161107A3 (en) | 1986-12-10 |
| GB8411706D0 (en) | 1984-06-13 |
| FI851620A0 (fi) | 1985-04-24 |
| DK161168B (da) | 1991-06-03 |
| JPS6134466A (ja) | 1986-02-18 |
| GB2158578B (en) | 1988-03-09 |
| NO851807L (no) | 1985-11-11 |
| GB2158578A (en) | 1985-11-13 |
| FI851620L (fi) | 1985-11-09 |
| DK202285A (da) | 1985-11-09 |
| EP0161107A2 (en) | 1985-11-13 |
| FI78787B (fi) | 1989-05-31 |
| DK202285D0 (da) | 1985-05-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5126241A (en) | Process for the determination of a specifically bindable substance | |
| US6326159B1 (en) | Receptors for immune complexes | |
| US4244940A (en) | Single-incubation two-site immunoassay | |
| US4434236A (en) | Immunoassay wherein labeled antibody is displaced from immobilized analyte-analogue | |
| US4298685A (en) | Diagnostic reagent | |
| US4551426A (en) | Heterogeneous immunoassay for digoxin using ouabain as a separation means | |
| US4894347A (en) | Erythrocyte agglutination assay | |
| US4504585A (en) | Affinity immunoassay system | |
| EP1082613B1 (en) | Method for detecting analytes | |
| JPS5923251A (ja) | 多価抗原の測定法及び測定試薬 | |
| AU664621B2 (en) | Two step process for coating of antibodies to a solid phase | |
| JPH0467914B2 (fi) | ||
| FI78787C (fi) | Immunometrisk metod foer bestaemning av en hapten. | |
| US5814461A (en) | Method for the determination of anti-TSH receptor autoantibodies | |
| EP0088974A2 (en) | Homogeneous immunoassay with labelled monoclonal anti-analyte | |
| US6942977B1 (en) | Immunoassays for determining vitamin b12, and reagents and kits therefor | |
| US6201109B1 (en) | Assay for bone alkaline phosphatase | |
| US5639627A (en) | Method for assaying specific antibody | |
| US5437981A (en) | Method for the immunological determination of ligands | |
| USH1018H (en) | Immunological method for the determination of free substances having hapten properties | |
| CA2090392C (en) | Coupling of antigens and antibodies to non-fixed erythrocytes | |
| US5277589A (en) | Process for the determination of antibodies | |
| CA2066736A1 (en) | Agglutination assay | |
| EP0308242A2 (en) | Agglutination assay | |
| JPH03503566A (ja) | 天然結合タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いたイムノアツセイ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: FARMOS-YHTYMAE OY |