JP5817720B2 - 含硫黄アミノ酸誘導体 - Google Patents
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Description
(1)下記一般式(I):
で表される構造を有することを特徴とする、含硫黄アミノ酸誘導体。
(2)一般式(I)が下記一般式(II):
で表される構造を有することを特徴とする、(1)に記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
(3)一般式(I)が下記一般式(III):
で表される構造を有することを特徴とする、(1)に記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
(4)免疫応答性疎水基が環状構造を有することを特徴とする、(1)〜(3)のいずれかに記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
(5)免疫応答性疎水基が、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基又はキノリニルアミノカルボニル基であることを特徴とする、(4)に記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
(6)内因性低分子化合物反応活性基が、アルデヒド基、N−スクシンイミジル基、ハロゲン基、イソチオシアネート基又はマレイミド基を含有することを特徴とする、(1)又は(3)に記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
(7)高分子量付与基又は標識化合物修飾基がリンカーを介して結合されていることを特徴とする、(1)〜(3)のいずれかに記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
(8)(1)〜(7)のいずれかに記載の含硫黄アミノ酸誘導体を含むことを特徴とする、内因性低分子化合物を測定するための試薬。
(9)内因性低分子化合物がアミノ酸であることを特徴とする、(8)に記載の試薬。
(10)(2)に記載の含硫黄アミノ酸誘導体を抗原として用いて動物を免疫する工程を含む、内因性低分子化合物認識抗体の製造方法。
(11)(2)に記載の含硫黄アミノ酸誘導体を抗原として用いることにより得られることを特徴とする、内因性低分子化合物認識抗体。
(12)前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする、(11)に記載の内因性低分子化合物認識抗体。
(13)以下の工程(A)〜(C)を含むことを特徴とする、内因性低分子化合物の測定方法:
(A)(3)に記載の含硫黄アミノ酸誘導体と被験試料とを反応させ、該含硫黄アミノ酸誘導体と被験試料中に存在する内因性低分子化合物との複合体を形成させる工程、
(B)工程(A)により形成した複合体と、(11)又は(12)に記載の内因性低分子化合物認識抗体とを接触させる工程、
(C)前記内因性低分子化合物認識抗体に結合した複合体の標識を測定する工程。
本発明は、新規化合物、特に内因性低分子化合物を測定するために利用され得る化合物として含硫黄アミノ酸誘導体を提供するものである。本発明の含硫黄アミノ酸誘導体は、硫黄原子を含有するアミノ酸を母体として、該母体の構造や性質を大幅に変えない程度に官能基の導入や原子の置き換え等の改変がなされた化合物であり、より詳細には、下記一般式(I):
で表される構造を有する化合物である。
で表される構造とすることもできる。
で表される構造とすることもできる。
で表される部分、又は下記一般式(2):
で表される部分と結合し得る部位が1又は2以上存在する。2以上の上記部分と結合するような態様も本発明に包含される。
本発明はまた、高分子量付与基と内因性低分子化合物とを有する含硫黄アミノ酸誘導体を抗原とする、内因性低分子化合物認識抗体の製造方法を提供する。
内因性低分子化合物を認識し得る抗体を作製するために、該抗体の抗原(免疫原)が作製される必要がある。該抗原としては、主に上記一般式(II)で表される構造を有する化合物を用いることができ、上述の方法又は後述の実施例の通り製造することができる。
上記抗原を、動物に対して、それ自体又は希釈剤若しくはアジュバントとともに抗体産生が可能な部位に投与することができる。希釈剤としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝液等が用いられる。抗体産生能を高めるアジュバントとしては、フロイント完全アジュバントやフロイント不完全アジュバント等が用いられる。投与は通常1〜6週毎に1回ずつ、計2〜10回行われる。用いられる動物としては、例えば、マウス、モルモット、ラット、ヤギ、サル、アカゲザル、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ネコ、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ラクダ等が挙げられ、本発明ではマウス及びラットが好ましい。
[a]測定対象の内因性低分子化合物に対応する上記一般式(II)の抗原を動物に免疫処理する工程、
[b]測定対象の内因性低分子化合物に対応する上記一般式(II)のハプテンをプレートに固相化し、抗体価評価用プレートを作製する工程、
[c]工程[a]により免疫処理した動物から血清を採取し、該血清を上記抗体価評価用プレートに添加し、抗原抗体反応を測定する工程、
[d]工程[c]の反応結果が陽性である動物から細胞を採取し、該細胞とミエローマ細胞とを混合し、細胞融合させてハイブリドーマを作製する工程、
[e]工程[d]により得られたハイブリドーマのうち、上記一般式(II)のハプテンを認識する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする工程、
[f]工程[e]により選別されたハイブリドーマをクローニングする工程。
[g]得られた2種類以上のモノクローナル抗体に対し、非測定対象の内因性低分子化合物に対応する上記一般式(II)のハプテンを反応させる工程、
[h]工程[g]の反応結果が陰性であるモノクローナル抗体を選別する工程。
上記抗原に対するポリクローナル抗体は、当業者に公知の方法により製造することができ、例えば、上記のモノクローナル抗体の製造方法と同様に動物に免疫を行い、該免疫動物から所望の抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。本発明におけるポリクローナル抗体の製造方法は、特に限定されないが、より詳細には以下の通り説明することができる。
上記1に示した含硫黄アミノ酸誘導体及び上記2により得られた抗体を用いることにより、被験試料中の内因性低分子化合物を測定することができる。即ち、本発明は、以下の工程(A)〜(C):
(A)上記1の含硫黄アミノ酸誘導体と被験試料とを反応させ、該含硫黄アミノ酸誘導体と被験試料中に存在する内因性低分子化合物との複合体を形成させる工程、
(B)工程(A)により得られた複合体と、上記2により得られた内因性低分子化合物認識抗体とを接触させる工程、
(C)前記内因性低分子化合物認識抗体に結合した複合体の標識を測定する工程、
を含む、内因性低分子化合物を測定し得る方法を提供することができる。
上記2により得られた内因性低分子化合物認識抗体を、担体に固相化する。使用する担体は、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリジビニルベンゼン、シリコン等の合成樹脂又はガラス等が挙げられ、具体的には、合成樹脂で成形された48穴、96穴、192穴、384穴等のマイクロタイタープレートが好ましい。抗体の固相化は、例えば、固相化用抗体を含む緩衝液を担体上に乗せ、インキュベーションすればよい。好ましくは、プロテインA、プロテインG、プロテインA/G、プロテインL、又は当該抗体を獲得するために免疫した動物種由来の抗体を認識する抗体、例えば、当該抗体がマウスから得たものであれば、ウサギ又はヤギ由来の抗マウス抗体を事前に担体に吸着及びコーティングさせた後、当該抗体を添加すれば固相化効率が増大する。また、抗体はアミノ基を含む分子であるため、N−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルが固相化されている担体を用いることで、抗体を直接担体に固相化することが可能になる。緩衝液中の抗体濃度は、通常0.01μg/mLから100μg/mLであり、緩衝液としては、測定手段に応じて公知のものを使用することができる。
担体の固相表面へのタンパク質の非特異的吸着を防止するため、固相化用抗体が吸着していない固相表面部分を、抗体とは無関係なタンパク質等によりブロッキングする。ブロッキング剤としては、ウシ血清アルブミン(BSA)もしくはスキムミルク溶液、又は市販のブロックエース(DSファーマバイオメディカル社製)、Applie Block(生化学工業社製)、N101/N102(日本油脂社製)等を使用することができる。ブロッキングは、前記ブロッキング剤を担体に添加し、例えば、約4℃で1時間〜一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、上記(a)と同じ緩衝液を使用することができる。
上記(a)及び(b)で処理された固相表面に、標識化合物修飾基を有する本発明の含硫黄アミノ酸誘導体と内因性低分子化合物との複合体を含有する試料(測定用試料)を加え、担体に固相化された抗体と該複合体との抗原抗体反応を行う。また、測定用試料とは別に、標識化合物修飾基を有する本発明の含硫黄アミノ酸誘導体と内因性低分子化合物との複合体を標準試料として予め調製しておき、測定用試料と並行して各種濃度の標準試料を加え、同様に抗原抗体反応を行う。いずれも抗原抗体反応は、通常10〜40℃、好ましくは25〜37℃において、1分間〜数時間で行うことができる。
上記(c)の抗原抗体反応を行った後、固相化抗体と結合した該複合体(B)及び該抗体に結合していない未反応の該複合体(F)を分離させる。分離自体は、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、上記(a)と同じ緩衝液を使用することができる。
上記(d)の処理の後、固相化抗体に結合した該複合体が有する標識化合物の量を調べることにより、対象とする内因性低分子化合物を測定することができる。ここで、上記(c)において並行して抗原抗体反応を行った各種濃度の標準試料を利用して、検量線を予め作成することができる。該検量線を用いることによって、被験試料に含まれる内因性低分子化合物の量を決定することができる。
抗体作製用の抗原(免疫原)は、合成したハプテンに架橋剤を介してキャリアタンパク質を結合したものを使用した。一般式(I)のX部分に導入した免疫応答性疎水基は、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基又はキノリニルアミノカルボニル基、Y部分に導入した測定対象抗原(内因性低分子化合物)はグリシン(Gly)、フェニルアラニン(Phe)又はイソロイシン(Ile)、Z部分に導入した高分子化合物であるキャリアタンパク質はウシ血清アルブミン(BSA)を採用し、架橋剤としてスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(sulfo-SMCC)を適用した。
出発物質(Cys-Gly)2(BACHEM社製)を20mmol/Lとなるようにジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した。この溶液を50%アセトニトリル溶液で10倍希釈し、2mmol/L (Cys-Gly)2溶液を5mL調製した。また、9-Fluorenylmethyl Succinimidyl Carbonate(Fmoc-OSu)(和光純薬社製)を0.25mol/Lとなるようにアセトニトリルに溶解した。
出発物質(Cys-Phe)2(BACHEM社製)を20mmol/Lとなるようにジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した。溶解以降の操作、Fmoc-OSu試薬との反応、DTTによる還元処理条件及び目的化合物Fmoc-Cys[H]-PheのHPLC分離条件は上述のFmoc-Cys[H]-Glyと同じ条件で実施した。目的化合物Fmoc-Cys[H]-Pheを回収し、凍結乾燥により必要時まで-20℃で保存した。再溶解した化合物を質量分析計により質量測定を実施した結果、Fmoc-Cys[H]-Pheに相当する質量が得られ、合成したハプテンが目的化合物であることが示された。
出発物質(Fmoc-Cys)2(BACHEM社製)を200mmol/LとなるようにDMSOに溶解した。また、縮合剤N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、東京化成社製)を500mmol/LとなるようにDMSOに溶解した。さらにN-ハイドロキシスクシンイミド(NHS、東京化成社製)を500mmol/LとなるようにDMSOに溶解した。3種の溶液について各1mLずつ混合し(計3mL)、室温振盪下で120分間反応させた。反応中は時間経過とともに反応物の一部が析出した。また、Ileを200mmol/Lとなるように0.1N 塩酸/ホウ酸緩衝液(pH11.0)(50/50)混合液に溶解した。反応終了後にDMSO 1mLを加え、Ile溶液1mLを少量ずつ添加した。反応溶液を室温下で15分放置した後、5%酢酸を0.5mL添加した。析出した化合物は0.45μmフィルターにより限外ろ過し、ろ過液をHPLCに導入して(Fmoc-Cys-Ile)2を分離及び分取した。HPLC装置は島津製作所製CLASS-VPシリーズ、カラムは逆相系カラムであるCadenza(内径4.6mm x 長さ250mm、インタクト社製)を使用した。
出発物質(Cys-Phe)2(BACHEM社製)を10mmol/Lとなるように0.1M塩酸に溶解した。また、AccQ・Tag Ultra Derivatization Kit(ウォーターズ社製)のAccQ・Ultra Derivatization Reagentをアセトニトリルによって100mmol/Lに調製した(AQC試薬)。調製した(Cys-Phe)2溶液500μL、AQC試薬1000μL、0.1mol/Lのホウ酸緩衝液1000μLを混合し、55℃で20分間加熱した。次いで、2mol/L DTT水溶液を250μL加えて40℃で2時間反応した。その後、0.2%の酢酸を2.25mL加えて反応を停止させ、HPLCにより目的化合物AQC-Cys[H]-Pheを分離及び分取した。なお、本ハプテンはキノリニルアミノカルボニル基が付与されているが、AQCに由来する基であるため上記名称を用いた。
出発物質(Cys-Phe)2(BACHEM社製)を10mmol/Lとなるように0.1M塩酸に溶解した。次いで、2mol/L DTT水溶液を250μL加えて40℃で2時間反応した。その後、HPLCにより目的化合物Cys[H]-Pheを分離及び分取した。
合成したハプテンFmoc-Cys[H]-Gly、Fmoc-Cys[H]-Phe、Fmoc-Cys[H]-Ile、AQC-Cys[H]-Phe及びCys[H]-PheとBSAをそれぞれ結合させるため、Imject(登録商標) Maleimide Activated BSA(ピアス社製)を用いた。このマレイミド活性化BSAは既にBSAの表面上のLys残基由来のアミノ(ε−NH2)基を介して架橋剤Sulfo-SMCC−マレイミド基が導入されたBSAである。2mgのマレイミド活性化BSAを50mM リン酸緩衝液(pH7.3)(0.1M エチレンジアミン-N,N,N’,N’-テトラ酢酸4ナトリウム塩4水和物を含む)(同仁化学社製)1mLに加えて溶解した。合成した0.5mgの各種ハプテンを200μLのジメチルスルホキシドに溶解し、マレイミド活性化BSA溶液にゆっくりと滴下した。滴下後は室温下で2時間静置した。反応終了後、Amicon(登録商標) Ultra-4 (分子量10,000 Da cut-off、ミリポア社製)を用いて遠心による限外ろ過を行った。遠心処理後、50mM リン酸緩衝液(pH7.3)を6〜7回程度繰り返し継ぎ足し、過剰のEDTAをできる限り除去した。その後、Bradford法によるタンパク質定量を行い、各ハプテン−BSA結合体の濃度を求めたところ、0.50-0.92mg/mLであった。
2−1.免疫作業から抗血清評価まで
免疫処理を行う前に、BALB/cマウス(メス4週齢)を1週間予備飼育しておいた。調製したFmoc-Cys[H]-Gly/BSA結合体溶液(50μg/100μL/匹)をフロイント完全アジュバント(DIFCO社製)と等量混合し、エマルジョンを形成させた。この懸濁液を、毛刈りしたマウスの背中に数箇所皮下投与し、これを初回免疫とした。その2週間後に2回目の免疫処理として、フロイント完全アジュバントに代えてフロイント不完全アジュバント(DIFCO社製)を用いて同様な操作を行った。さらに2週間後に3回目の免疫処理として、2回目の免疫処理と同様な操作を行った。3回目の免疫処理から1週間後、マウス部分採血を行い、酵素免疫測定法(ELISA)により抗体価を測定して該マウスが抗体産生を行っていることを確認した上で、その翌日に、2回目の免疫処理と同様な方法で最終の免疫処理を行った。最終の免疫処理から3日後、該マウスより脾臓を無菌的に摘出し、脾臓細胞を調製し、該脾臓細胞を細胞融合に供した。なお、他のハプテン−BSA結合体についても同様な処理を行った。
Reacti-Bind(商標) Maleimide Activated Plates(ピアス社製)の96ウェルマイクロプレート上にFmoc-Cys[H]-Glyを固相化した。Fmoc-Cys[H]-Glyは50mMリン酸緩衝液(10mM EDTAを含む)を用いて2μg/mLに調製し、該溶液を上記プレートの各ウェルに100μLずつ添加し、4℃で終夜放置した。次いで、PBS(0.05% Tween20を含む)によりウェル内を3回洗浄した。洗浄後、10μg/mLシステイン溶液を各ウェルに200μLずつ加えて、室温にて1時間放置し、プレート上の未反応マレイミド基のクエンチング処理を行った。続けて、PBS(0.05% Tween20を含む)によりウェル内を3回洗浄して、Fmoc-Cys[H]-Gly固相化プレートを作製した。該プレートは4℃にて必要時まで保管した。なお、他のハプテンについても同様な処理を行い、抗体価評価用プレートを作製した。
免疫処理したマウスから部分採血した血液を室温にて1時間以上放置した後、パスツールピペット等で凝固した血液をほぐし、遠心処理(3000rpm、15分間)をして血清を得た。得られた血清は、0.1%ゼラチン(ナカライテスク社製)を含むPBS緩衝液により段階希釈した(103〜106倍希釈)。段階希釈した血清を上記抗体価評価用プレートの所定のウェルに100μLずつ添加し、室温下で1時間放置した。次いでPBS(0.05% Tween20を含む)によりウェル内を3回洗浄した後、Peroxidase Conjugated Affinity Purified Anti-Mouse IgG Fc specific antibody(Goat)(Jackson Immuno Research社製)を添加し、室温下で1時間放置した。その後、PBS(0.05% Tween20を含む)によりウェル内を3回洗浄した。抗原抗体反応は、OPD溶液(0.04%[w/v]オルトフェニレンジアミンを含む20mMクエン酸緩衝液(pH5.0)に0.018%[v/v]の過酸化水素液を反応直前に加えたもの)又はTMB one solution(プロメガ社製)を用いて確認した。各種溶液を各ウェルに100μLずつ添加して発色反応を10分間行い、1N硫酸溶液により発色反応を停止した。発色反応停止後、OPD発色では波長492nm、TMB発色では波長450nmによる吸光度をマイクロプレートリーダーSpectraMax M2e(モレキュラーデバイス社製)を用いて測定した。
上記の通り、マウスから無菌的に摘出した脾臓を、セルストレイナー(ファルコン社製)によりMEM-α培地(Gibco社製)内でほぐした。マウスミエローマ細胞株P3-Ag-X3細胞は事前に充分量を培養しておき、回収したのち、細胞数をカウントした。脾臓1個あたりに含まれる細胞数を1x108個として、細胞数が脾細胞:ミエローマ細胞=5:1となるように両者を混合した。遠心分離により培養上清を除去し、細胞ペレットをほぐした。細胞ペレットの容器は37℃水浴下に浸し容器を回転させながら、PEG1500(ロシュダイアグノスティックス社製)溶液1mLを1分間かけて少しずつ加えて細胞融合を開始した。PEG溶液添加1分後からの1分間は激しくピペッティングした。次いで、それから4分間、MEM-α培地を合計4mL添加した。さらにそれから2分間、MEM-α培地を10mL添加した。室温下で5分間放置した後、遠心分離により上清を除去した融合細胞をHAT培地(0.01mMヒポキサンチン、0.04μMアミノプテリン、1.6μMチミジンを含むMEM-α培地に10% FCS液を加えたもの)160mLにより懸濁した。最後に、この懸濁液を96ウェルマイクロプレートの各ウェルに200μLずつまきこみ、5% CO2下37℃で培養した。以降3日毎に各ウェルの培地を半分量除去し、新たにHAT培地を半分量加えた。細胞融合後10日目以降、HT培地(0.01mMヒポキサンチン、1.6μMチミジンを含むMEM-α培地に10% FCS液を加えたもの)によってHAT培地と同様な培地交換を行った。
細胞融合後、成育したハイブリドーマから目的抗体が分泌されているかどうかを判断するためにスクリーニングを行った。細胞融合後10日目乃至16日目の培養上清を各ウェルから50μLずつ採取した後、該上清を上記抗体価評価用プレートに添加し、1時間放置した。PBS(0.05% Tween20を含む)によりウェル内を3回洗浄後、Peroxidase Conjugated Affinity Purified Anti-Mouse IgG Fc specific antibody(Goat)(Jackson Immuno Research社製)を添加し、室温下で1時間放置した。その後、PBS(0.05% Tween20を含む)によりウェル内を3回洗浄した。抗原抗体反応はOPD溶液(0.04%[w/v]オルトフェニレンジアミンを含む20mMクエン酸緩衝液(pH5.0)に0.018%[v/v]の過酸化水素液を反応直前に加えたもの)を各ウェルに100μLずつ添加して吸光度測定(測定波長492nm)を行った。吸光度0.5以上を示したウェルを陽性ウェルと判定し、陽性ウェル内の細胞培養液を別の96ウェルマイクロプレートに移して培養を継続した。1次スクリーニングで陽性と判定されたウェルは疑陽性も含まれるため、1週間培養継続後、同様な操作で培養上清を2次スクリーニングに供して、吸光度3.0以上を示したウェルを陽性ウェルとした。
細胞のモノクローン化は以下の限界希釈法により行った。2次スクリーニング後、陽性判定されたウェル内の細胞懸濁液を、10%[v/v]のBM condemned H1(Roche社製)を含む完全培地(BM培地)により100倍、1000倍、10000倍と段階希釈した。それぞれの希釈率で希釈した細胞懸濁液は32ウェルずつ1枚の96ウェルマイクロプレートに添加し、培養を継続した。培養は6日ごとにBM培地で半量を交換した。培養開始から10〜15日後、顕微鏡によるコロニー観察を行った。1ウェル内に単コロニーが観察されたウェルの上清サンプルについて、抗体活性の有無を調べた。モノクローン化されたハイブリドーマを含む培養上清が陽性判定を示した後、再び限界希釈法によりクローニングした(リクローニング)。リクローニング後、同様に顕微鏡により単コロニーが観測されたウェルを限定し、培養上清が陽性判定を示すことを確認して、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。なお、得られたハイブリドーマは、2010年4月1日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1つくばセンター中央第6)に寄託しており、Fmoc-Cys-Glyに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマには受託番号FERM P-21947が付与され、Fmoc-Cys-Pheに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマには受託番号FERM P-21948が付与されている。また、これらのハイブリドーマはいずれも同センターにおいて国際寄託へ移管申請されており、Fmoc-Cys-Glyに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマには受領番号FERM ABP-11384が付与され、Fmoc-Cys-Pheに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマには受領番号FERM ABP-11385が付与されている(受領書の通知年月日:2011年5月16日)。
以下の表1は免疫原ごとのモノクローナル抗体作製工程での陽性ウェル数又はハイブリドーマ株数を示した結果である。これより、Fmoc-Cys-Gly、Fmoc-Cys-Phe、Fmoc-Cys-Ile及びAQC-Cys-Pheについては最終的にモノクローナル抗体産生細胞株が5乃至10株樹立できた。一方、Cys-Pheを免疫原としたデザインでは1次スクリーニングの段階で陽性と判定されたウェル数が少なく、抗体作製工程を進めていくにつれ、細胞がドロップアウトしてしまった。この結果より、Cysのアミノ基部分にFmocやAQC構造をもった生体内に存在しない構造が導入されることで、免疫応答が高まり、抗体が得られやすくなったと考えられた。
培養上清由来の抗体量では充分な評価を行うことができないため、腹水による抗体の大量生成を行った。樹立したハイブリドーマ株を完全培地で培養し、MEM-α培地で1x107個/mLの濃度に懸濁した。該懸濁液を、7日前に予めプリスタン投与したBALB/cマウスの腹腔内に投与した(0.5mL/匹)。7〜14日後、該マウスより腹水を採取し、遠心分離により細胞を除去した。
得られた腹水はProtein Gカラム(GEヘルスケア社製)により精製した。Protein Gカラムは20mMリン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化した後、該腹水を20mMリン酸緩衝液(pH7.0)を用いて10倍希釈後、Protein Gカラムに添加し、腹水中の抗体成分(免疫グロブリンG)を吸着させた。20mMリン酸緩衝液(pH7.0)溶液によりカラム内に残存している夾雑成分を洗浄除去後、グリシン緩衝液で抗体成分を溶出した。溶出した抗体成分は、1Mトリス緩衝液(pH9.0)により直ちに溶出液を中和した。精製した抗体溶液は必要時まで-20℃で凍結保存した。
3−1.誘導体化試薬の調製:biotin-[Fmoc-Cys]
(Fmoc-Cys)2(BACHEM社製)を20μMとなるようにアセトニトリルに溶解した後、3mol/Lジチオスレイトールを添加し、40℃で1時間放置した。HPLC装置によりFmoc-Cys[H]画分を分取し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、該画分を50mMリン酸緩衝液(pH6.0)に溶解させ、Fmoc-Cys[H]溶液とした。Maleimide-PEG2-Biotin(PIERCE社製)を0.1% EDTA含有50mMリン酸緩衝液(pH7.3)に溶解し、Fmoc-Cys[H]溶液と混合し、室温下で2時間放置した。反応液をHPLCに導入し、biotin-[Fmoc-Cys]画分を分取後、凍結乾燥した。
N,N-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)及びN-ハイドロキシスクシニルイミド(NHS)を0.1mol/Lとなるようにアセトニトリルにそれぞれ溶解させた。また上述で調製したbiotin-[Fmoc-Cys]凍結乾燥品を1μg秤量し、56μLのアセトニトリルに溶解させ、この溶液に0.1mol/L DCC液12μL及び0.1mol/L NHS液12μLを加えて室温下で2時間放置した。
調製したbiotin-[Fmoc-Cys-NHS]にアミノ酸溶液及び0.1Mホウ酸緩衝液(pH9.0)を添加し、室温下で15分間放置した。その後、0.2%酢酸を添加し、誘導体化反応を停止した。本反応液は測定時まで4℃で保存した。
ELISAによる測定原理を図2に示す。Fmoc-Cys-Glyを認識する抗体の溶液は、0.9%塩化ナトリウムを含む50mM リン酸緩衝液(pH7.3)(PBS)により0.1μg/mLに希釈した。この溶液をReacti-Bind(商標) Protein A/G Coated Plate(サーモサイエンティフィック社製)の各ウェルに100μLずつ添加し、室温下で2時間放置した。次いで0.05% Tween20含有リン酸緩衝液(PBST)でウェル内を3回洗浄した。biotin-[Fmoc-Cys-Gly]化合物を0.1%ゼラチン含有PBS液(GPB)により段階的に希釈し、該希釈液を各ウェルに100μLずつ添加し、抗原抗体反応を行った。室温下で60分間放置した後、PBST液によりウェル内を3回洗浄した。洗浄後、1μg/mL HRP標識ストレプトアビジン結合体溶液を各ウェルに100μLずつ添加し、室温下で60分放置した。さらに、PBSTによりウェル内を3回洗浄した後、OPD溶液(25mMクエン酸/50mMリン酸水素二ナトリウム(pH5.0)溶液10mLにオルトフェニレンジアミン4mg及び過酸化水素6μLを添加したもの)をHRP基質溶液として各ウェルに100μLずつ加えて呈色反応を行った。反応開始から10分後、1M 硫酸を反応停止液として各ウェルに100μLずつ添加し、各ウェルの吸光度を測定波長492nmで測定した。
5−1.グリシン(Gly)の定量
実試料として日本酒(益荒男、鹿野酒造社製)、ウシ胎児血清(FCS)(Fetal Bovine Serum、インビトロジェン社製)及びラット血漿サンプル(SD系、メス、20週齢、日本チャールズリバー社製)を用いて、抗Fmoc-Cys-Gly抗体及びアミノ酸誘導体化試薬による試料中のGly測定評価を行った。その評価は、図2の原理に基づいたELISAによって算出されたGly測定値と高速液体クロマトグラフィー−質量分析計(LC-MS;高速液体クロマトグラフィー装置;1100シリーズ(アジレントテクノロジー社製)、質量分析計;API3000(アプライドバイオシステムズ社製))から得られたGly測定値とを比較することにより行った。
実試料としてウシ胎児血清(FCS)(Fetal Bovine Serum、インビトロジェン社製)及びラット血漿サンプル(SD系、メス、20週齢、日本チャールズリバー製)を用いて、抗Fmoc-Cys-Phe抗体及びアミノ酸誘導体化試薬による試料中のPhe測定評価を行った。その評価は、図2の原理に基づいたELISAによって算出されたPhe測定値と高速液体クロマトグラフィー−質量分析計(LC-MS;高速液体クロマトグラフィー装置;1100シリーズ(アジレントテクノロジー社製)、質量分析計;API3000(アプライドバイオシステムズ社製))から得られたPhe測定値とを比較することにより行った。
Claims (13)
- 下記一般式(I):
(式中、Xは免疫応答性疎水基、Yは内因性低分子化合物反応活性基又は内因性低分子化合物が結合した基、Zは水素原子、高分子量付与基又は標識化合物修飾基、Aは単結合又は炭素数1〜6のアルキレン基である。)
で表される構造を有することを特徴とする、含硫黄アミノ酸誘導体。 - 一般式(I)が下記一般式(II):
(式中、Xは免疫応答性疎水基、Y’は内因性低分子化合物が結合した基、Z’は水素原子又は高分子量付与基、Aは単結合又は炭素数1〜6のアルキレン基である。)
で表される構造を有することを特徴とする、請求項1に記載の含硫黄アミノ酸誘導体。 - 一般式(I)が下記一般式(III):
(式中、Xは免疫応答性疎水基、Y’’は内因性低分子化合物反応活性基、Z’’は標識化合物修飾基、Aは単結合又は炭素数1〜6のアルキレン基である。)
で表される構造を有することを特徴とする、請求項1に記載の含硫黄アミノ酸誘導体。 - 免疫応答性疎水基が環状構造を有することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
- 免疫応答性疎水基が、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基又はキノリニルアミノカルボニル基であることを特徴とする、請求項4に記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
- 内因性低分子化合物反応活性基が、アルデヒド基、N−スクシンイミジル基、ハロゲン基、イソチオシアネート基又はマレイミド基を含有することを特徴とする、請求項1又は3に記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
- 高分子量付与基又は標識化合物修飾基がリンカーを介して結合されていることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の含硫黄アミノ酸誘導体を含むことを特徴とする、内因性低分子化合物を測定するための試薬。
- 内因性低分子化合物がアミノ酸であることを特徴とする、請求項8に記載の試薬。
- 請求項2に記載の含硫黄アミノ酸誘導体を抗原として用いて動物を免疫する工程を含む、下記一般式(II’):
(式中、Xは免疫応答性疎水基、Y’は内因性低分子化合物が結合した基、Zは水素原子又は高分子量付与基、Aは単結合又は炭素数1〜6のアルキレン基である。)で表される含硫黄アミノ酸誘導体を認識し得る抗体の製造方法。 - 請求項2に記載の含硫黄アミノ酸誘導体を抗原として用いることにより得られることを特徴とする、下記一般式(II’):
(式中、Xは免疫応答性疎水基、Y’は内因性低分子化合物が結合した基、Zは水素原子又は高分子量付与基、Aは単結合又は炭素数1〜6のアルキレン基である。)で表される含硫黄アミノ酸誘導体を認識し得る抗体。 - 前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項11に記載の抗体。
- 以下の工程(A)〜(C)を含むことを特徴とする、内因性低分子化合物の測定方法:(A)請求項3に記載の含硫黄アミノ酸誘導体と被験試料とを反応させ、該含硫黄アミノ酸誘導体と被験試料中に存在する内因性低分子化合物との複合体を形成させる工程、
(B)工程(A)により形成した複合体と、請求項11又は12に記載の抗体とを接触させる工程、
(C)前記抗体に結合した複合体の標識を測定する工程。
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