WO2011145664A1 - 含硫黄アミノ酸誘導体 - Google Patents

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WO2011145664A1
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low molecular
amino acid
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和幸 窪田
利巳 水越
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味の素株式会社
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    • G01N33/6815—Assays for specific amino acids containing sulfur, e.g. cysteine, cystine, methionine, homocysteine

Definitions

  • the present invention relates to a specific sulfur-containing amino acid derivative. Furthermore, the present invention relates to a reagent containing the sulfur-containing amino acid derivative, an endogenous low-molecular-weight compound recognition antibody using the sulfur-containing amino acid derivative and a method for producing the same, and a method for measuring an endogenous low-molecular compound using the sulfur-containing amino acid derivative.
  • Patent Document 1 a non-competitive immunoassay for low molecular weight compounds.
  • an animal is immunized with an antigen-antibody complex consisting of a hapten (antigen) and an anti-hapten antibody (first antibody) as an immunogen, and a new second antibody capable of recognizing the complex is obtained.
  • the measurement method is based on the principle that the first antibody is immobilized on a carrier, an antigen-antibody reaction with the hapten is established, and then the labeled second antibody is bound.
  • at least two types of antibodies are required, which leads to an increase in time and cost for establishing a measurement method.
  • Patent Document 2 Non-Patent Documents 1 to 3
  • Sensitivity that can be quantified is not obtained.
  • the size of the antigenic determinant In general, the size of the antigenic determinant is said to be about 3 to 8 amino acids as the size of the presented molecule. Therefore, when the low molecular weight compound is an amino acid, for example, it is difficult to obtain an anti-amino acid antibody that recognizes one amino acid, and even if it can be obtained, its affinity is considered to be low. The other is that an immune response is generally unlikely to occur against in vivo compounds such as amino acids.
  • Immunoassays for examining antigen-antibody reactions are generally roughly divided into two types: competitive immunoassays and non-competitive immunoassays.
  • competitive immunoassay an antigen in a sample competes with a certain amount of labeled antigen for an antibody immobilized on a certain amount on a carrier. That is, when the amount of antigen in the sample is small, the amount of binding between the labeled antigen and the antibody increases and the signal intensity is observed to be high, whereas when the amount of antigen in the sample is large, the signal intensity is conversely It is observed low.
  • a sandwich immunoassay is known as a non-competitive immunoassay.
  • an antigen-containing sample is added to an excessive amount of antibody (first antibody) immobilized on a carrier, and then a labeled antibody (second antibody) is added.
  • the second antibody recognizes the same antigen as the first antibody, but the recognition site on each antigen surface is different, so that it becomes a sandwich type binding mode in which one antigen is sandwiched between two antibodies.
  • signal increase corresponding to the antigen amount is induced, and quantitative analysis of the antigen amount becomes possible.
  • a reaction time is required from several hours to overnight until the binding type (B) and the free type (F) reach an equilibrium state in the antigen-antibody reaction.
  • the accuracy of the analysis value may be reduced.
  • non-competitive immunoassays can shorten the reaction time, and the amount of antigen corresponds to the amount of labeled antibody, so a measurement method with a wide measurement concentration range can be constructed.
  • the equilibrium state of the following formula (1) is inclined toward the complex formation direction. The environment is easy to form. As a result, the non-competitive immunoassay can measure with higher sensitivity than the competitive immunoassay.
  • a non-competitive immunoassay such as a sandwich type requires two types of antibodies for one antigen. Each of these antibodies must recognize a separate region of the antigen. Therefore, when the antigen is a low molecular weight compound, it is difficult to obtain two antibodies with different molecular sizes and different recognition sites. Therefore, it is difficult to use a non-competitive immunoassay for measuring low molecular weight compounds. It was not easy.
  • An object of the present invention is to provide a method for measuring an endogenous low molecular weight compound with high sensitivity, specificity and simplicity.
  • the present inventors have found that the above problem can be solved by using a specific sulfur-containing amino acid derivative, and have completed the present invention.
  • General formula (I) is the following general formula (II):
  • the sulfur-containing amino acid derivative according to (1) which has a structure represented by: (4) The sulfur-containing amino acid derivative according to any one of (1) to (3), wherein the immunoresponsive hydrophobic group has a cyclic structure.
  • the sulfur-containing amino acid derivative according to (4), wherein the immunoresponsive hydrophobic group is a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group or a quinolinylaminocarbonyl group.
  • the intrinsic low molecular weight compound reactive group contains an aldehyde group, an N-succinimidyl group, a halogen group, an isothiocyanate group, or a maleimide group.
  • Sulfur amino acid derivatives (7) The sulfur-containing amino acid derivative according to any one of (1) to (3), wherein the high molecular weight imparting group or the labeling compound modifying group is bonded via a linker.
  • the reagent according to (8), wherein the endogenous low molecular weight compound is an amino acid.
  • a method for producing an endogenous low molecular weight compound-recognizing antibody comprising a step of immunizing an animal using the sulfur-containing amino acid derivative according to (2) as an antigen.
  • An endogenous low molecular weight compound-recognizing antibody which is obtained by using the sulfur-containing amino acid derivative according to (2) as an antigen.
  • a method for measuring an endogenous low molecular weight compound comprising the following steps (A) to (C): (A) reacting the sulfur-containing amino acid derivative according to (3) with a test sample to form a complex of the sulfur-containing amino acid derivative and an endogenous low-molecular compound present in the test sample; (B) a step of contacting the complex formed by the step (A) with the endogenous low molecular weight compound recognition antibody according to (11) or (12), (C) A step of measuring the label of the complex bound to the endogenous low molecular weight compound recognition antibody.
  • the specific sulfur-containing amino acid derivative in the present invention can provide a method for measuring an endogenous low molecular weight compound with high sensitivity, in a specific and simple manner.
  • FIG. 1 is a diagram showing MALDI-TOF-MS spectra in a conjugate of BSA or various haptens and BSA.
  • 1 is a non-chemically modified BSA
  • 2 is a maleimide activated BSA
  • 3 is a spectrum of a conjugate of maleimide activated BSA and Fmoc-Cys [H] -Gly.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of an ELISA for measuring endogenous low molecular weight compounds.
  • 1 is a microplate
  • 2 is protein A / G
  • 3 is an anti-hapten antibody
  • 4 is a hapten
  • 5 is biotin
  • 6 is avidin or streptavidin
  • 7 is horseradish peroxidase (HRP).
  • A is a dose-response curve showing reactivity to biotin- [Fmoc-Cys-Gly] standard solution.
  • the horizontal axis of the graph indicates the concentration of the standard solution, and the vertical axis indicates the relative absorbance at the measurement wavelength of 492 nm.
  • B is a graph showing cross-reactivity of anti-Fmoc-Cys-Gly antibody to various amino acid standard solutions.
  • the horizontal axis of the graph indicates the concentration of various amino acid standard solutions, and the vertical axis indicates the relative absorbance at a measurement wavelength of 492 nm.
  • A is a graph showing Gly concentrations measured in sake (squares), FCS (triangles), and rat plasma samples (circles), and the horizontal axis shows Gly concentrations measured by ELISA based on the principle shown in FIG.
  • the vertical axis represents the Gly concentration measured by high performance liquid chromatography-mass spectrometer (LC-MS).
  • the R 2 value based on the approximate curve of Gly concentration obtained by both measurement methods was 0.9945.
  • FIG. 5 is a diagram showing another example of ELISA for measuring endogenous low molecular weight compounds. 1 is a microplate, 2 is avidin or streptavidin, 3 is biotin, 4 is a hapten, 5 is an anti-hapten antibody, 6 is an antibody that recognizes an anti-hapten antibody, and 7 is a labeled compound.
  • 1 is a microplate
  • 2 is avidin or streptavidin
  • 3 is biotin
  • 4 is a hapten
  • 5 is an anti-hapten antibody
  • 6 is an antibody that recognizes an anti-hapten antibody
  • 7 is a labeled compound.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of measurement and evaluation of Phe concentration in an actual sample.
  • the Phe concentration measured by ELISA is represented by a white bar
  • the Phe concentration measured by high performance liquid chromatography-mass spectrometer (LC-MS) is represented by a black bar.
  • the vertical axis represents Phe concentration.
  • the present invention provides a sulfur-containing amino acid derivative as a compound that can be used for measuring novel compounds, particularly endogenous low molecular weight compounds.
  • the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention is a compound in which an amino acid containing a sulfur atom is used as a base material, and functional group introduction and atom replacement are performed to such an extent that the structure and properties of the base material are not significantly changed. More specifically, the following general formula (I):
  • X represents an immunoreactive hydrophobic group
  • Y represents an endogenous low molecular compound reactive group or a group to which an endogenous low molecular compound is bonded
  • Z represents a hydrogen atom, a high molecular weight imparting group, or a labeling compound modifying group
  • A is a single bond or an alkylene group having 1 to 6, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 4, even more preferably 1 to 3, and most preferably 1 or 2 carbon atoms. It is a compound which has a structure represented by these.
  • X is an immunoresponsive hydrophobic group
  • Y ′ is a group to which an endogenous low molecular weight compound is bonded
  • Z ′ is a hydrogen atom or a high molecular weight imparting group
  • A is a single bond or having 1 to 6 carbon atoms, preferably Is 1 to 5, more preferably 1 to 4, even more preferably 1 to 3, and most preferably 1 or 2 alkylene groups.
  • the compound having the structure represented by the general formula (II) can be used as a hapten or an antigen that binds to an antibody that recognizes an endogenous low molecular weight compound when Z ′ is a hydrogen atom.
  • Z ′ is a hydrogen atom.
  • it can be used as an antigen (immunogen) for producing the antibody.
  • X is an immunoresponsive hydrophobic group
  • Y ′′ is an endogenous low molecular compound reactive group
  • Z ′′ is a labeling compound modifying group
  • A is a single bond or 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 -5, more preferably 1-4, even more preferably 1-3, most preferably 1 or 2 alkylene groups.
  • the compound having the structure represented by the above general formula (III) is capable of constructing a conjugate with the endogenous low molecular weight compound to be measured, and further detecting the endogenous low molecular weight compound.
  • Can be used as The compound can be mainly used in a method for measuring an endogenous low molecular weight compound described later.
  • the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention having a structure represented by the above general formula (I), general formula (II) and general formula (III) is used for measuring endogenous low molecular weight compounds, particularly immunologically. It is useful as a reagent for measurement, and the present invention also provides such a reagent.
  • X is an immune-responsive hydrophobic group, which is a hydrophobic group that can improve immune response as a structure derived from an exogenous compound.
  • the hydrophobic group means a group having a small polarity and a low affinity with a water molecule, and specifically, a hydrocarbon group such as an alkyl group.
  • the second point is to improve the affinity of the antigen-antibody reaction.
  • the affinity of the antigen-antibody reaction is increased by the hydrophobic interaction effect when the antibody is recognized including the X moiety. Can be increased.
  • the third point is to increase the immune response. Since an endogenous compound is a substance that is originally present in the living body, the immune response to the compound is generally low. On the other hand, when an immunoresponsive hydrophobic group having a structure as an exogenous compound is added, immunogenicity is increased, and the immune response can be promoted to improve antibody production ability.
  • the molecular weight of the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention is increased, the affinity of the antigen-antibody reaction is improved, and the immune response of a test animal administered with the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention as an antigen
  • it is preferable that it is group which has a cyclic structure.
  • the group having a cyclic structure include a hydrocarbon ring-containing group.
  • the hydrocarbon ring-containing group is a group containing a structure in which carbon atoms are bonded cyclically, and the structure may be a monocyclic hydrocarbon or a condensed polycyclic hydrocarbon. Good.
  • Monocyclic hydrocarbons include cyclopropane, cyclobutane, cyclopentane, cyclohexane, cyclobutene, cyclopenta-2,4-diene, etc.
  • condensed polycyclic hydrocarbons include pentalene, indene, naphthalene, azulene, biphenylene, fluorene, anthracene. , Tetracene, triphenylene and the like.
  • the group having a cyclic structure may be a group containing a hetero atom (heterocycle).
  • heterocyclic ring examples include pyrrole, furan, thiophene, imidazole, oxazole, thiazole, pyrazole, isoxazole, isothiazole, pyridine, pyridazine, pyrimidine, pyrazine, piperidine, morpholine and the like, isobenzofuran, 1,3 -Condensed heterocycles such as dihydroisobenzofuran, phthalane, phthalide, phthalidyl, benzofuran, isochromene, isochromenium, 2H-chromene, 9H-xanthene, xanthylium, oxatolene.
  • the group having a cyclic structure is more preferably a group containing an aromatic ring or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • the aromatic ring include benzene, naphthalene, anthracene, furan, benzofuran and the like.
  • the alkyl group having 1 to 10 carbon atoms include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, pentyl group, hexyl group, heptyl group, octyl group , Nonyl group, decanyl group and the like.
  • the alkyl group may be linear or branched, and is preferably an alkyl group having 3 to 10 carbon atoms, more preferably 5 to 10 carbon atoms.
  • the immunoresponsive hydrophobic group has a condensed ring from the viewpoint of increasing the molecular weight, improving the affinity of the antigen-antibody reaction, and improving the immune response of the test animal.
  • immunoresponsive hydrophobic group examples include 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group, quinolinylaminocarbonyl group, 4-N, N-dimethylaminosulfonyl-7-piperazino-2,1,3-benzoxadiazole ( DBD-PZ group), 4-fluoro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F group), 5-N, N-dimethylaminonaphthalenesulfonyl chloride (DNS-Cl group), o-phthalaldehyde (OPA) Group) and 4-phenylspiro [furan-2 (3H), 1'-phthalan] -3,3'-dione (fluorescamine group), N, N, N-trimethylammonioanilyl N'-hydroxysuccinimidyl carbamate iodide (TAHS group), fluorescein Group, dansyl chloride group and the like.
  • Fmoc 9-
  • Y, Y ′ and Y ′′ in the above formulas (I) to (III) are endogenous low molecular compound reactive groups (hereinafter sometimes referred to as “y1 group”) or a group to which an endogenous low molecular compound is bonded. (Hereinafter sometimes referred to as “y2 group”), and among these, the active group capable of reacting with the endogenous low molecular compound to be measured is introduced into the endogenous low molecular compound reactive group (y1 group). Represents a group.
  • the y1 group contains, for example, an aldehyde group, an N-succinimidyl group, a halogen group (eg, F, Cl, Br, etc.), an isothiocyanate group, etc., It reacts easily with an endogenous low molecular weight compound containing a group, and the endogenous low molecular weight compound can be bound to the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention. Further, if the y1 group contains, for example, an amino group (—NH 2 ), it easily reacts with an endogenous low-molecular compound containing a carboxylic acid (carboxyl group) as a carboxyl group-reactive active group.
  • a halogen group eg, F, Cl, Br, etc.
  • an isothiocyanate group etc.
  • the y1 group contains, for example, a maleimide group, it easily reacts with an endogenous low molecular compound containing a thiol group as a thiol group reactive group, and the endogenous low molecular compound is included in the present invention. It can be coupled to sulfur amino acid derivatives. Further, if the y1 group contains, for example, a hydrazine group, it can easily react with a sugar structure-containing endogenous low molecular weight compound, and the endogenous low molecular weight compound can be bound to the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention. .
  • the y2 group in the present invention refers to a group formed by a reaction between the y1 group and an endogenous low molecular compound as described above, and contains the endogenous low molecular compound to be measured as a chemical structure. is there. Thereby, it can utilize for preparation of the antibody with respect to this endogenous low molecular weight compound.
  • Z, Z ′, and Z ′′ are a hydrogen atom, a high molecular weight imparting group, or a labeling compound modifying group.
  • the high molecular weight-imparting group is a group introduced to increase the molecular weight of the above formula (I) or (II), and preferably has a low immunogenicity for the animal to be immunized.
  • the labeling compound modifying group is a group introduced to label the above formula (I) or (III).
  • Z or Z ′ is a high molecular weight imparting group
  • such a sulfur-containing amino acid derivative can be used as an immunogen for antibody production.
  • Immune response by periodically administering the prepared immunogen multiple times to animals such as mice, guinea pigs, rats, goats, monkeys, rhesus monkeys, dogs, rabbits, cows, chickens, cats, hamsters, sheep, pigs, camels, etc.
  • animals such as mice, guinea pigs, rats, goats, monkeys, rhesus monkeys, dogs, rabbits, cows, chickens, cats, hamsters, sheep, pigs, camels, etc.
  • an antibody that recognizes a part of the molecular region on the surface of the immunogen in three-dimensional structure that is, the immunoreactive hydrophobic group and the endogenous low molecular weight compound in the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention.
  • a so-called carrier protein can be used as the substance used as the high molecular weight-imparting group.
  • a so-called carrier protein can be used.
  • BSA bovine serum albumin
  • RSA rabbit serum albumin
  • OVA ovalbumin
  • KLH scallop hemocyanin
  • TG Thyroglobulin
  • immunoglobulin immunoglobulin and the like.
  • the high molecular weight imparting group in the present invention can also be referred to as a “carrier protein binding group”.
  • Synthetic polymers can also be used as the high molecular weight imparting group, for example, various latexes such as polymers or copolymers such as polyamino acids, polystyrenes, polyacryls, polyvinyls, and polypropylenes. Can be mentioned.
  • the high molecular weight imparting group in the present invention can also be referred to as a “synthetic polymer binding group”.
  • One high molecular weight imparting group (Z or Z ′)
  • X is an immunoresponsive hydrophobic group
  • Y is an endogenous low molecular weight compound reactive group or a group to which an endogenous low molecular weight compound is bonded
  • A is a single bond or an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms.
  • X is an immunoresponsive hydrophobic group
  • Y ′ is a group to which an endogenous low molecular weight compound is bonded
  • A is a single bond or an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the high molecular weight imparting group is preferably bonded to a sulfur atom via a linker.
  • a linker By attaching a high molecular weight-providing group via a linker, the surface presentation ability of the antigen moiety is increased compared to the case where a high molecular compound and a sulfur atom are directly bonded, and a more specific antibody can be produced.
  • the linker in the present invention is not particularly limited as long as it can be used for improving the antigen presentation ability. For example, a linker that crosslinks an amino group and a sulfur atom is preferable.
  • MBS maleimidobutyryl succinimide
  • MCS maleimidocaproyl succinimide
  • MUS maleimidoundecanoyl succinimide
  • Sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) ) Etc. are known.
  • the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention can be used as a signal probe that can detect the presence of an endogenous low molecular weight compound.
  • the labeling compound modifying group may be bound via a linker in the same manner as the high molecular weight imparting group.
  • Labeled compound modifying groups include enzymes (horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (AP), ⁇ -galactosidase, luciferase, etc.), fluorescent substances (fluorescamine, fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE) , allophycocyanin (APC), green fluorescent protein (GFP), etc.), radioactive isotopes (125 I, 131 I, 3 H, 32 S, 14 C , etc.), stable isotopes, dyes, metals, colloidal, magnetic materials, etc. Is a group for introducing the labeled compound of formula (I) or (III).
  • HRP horseradish peroxidase
  • AP alkaline phosphatase
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • PE phycoerythrin
  • APC allophycocyanin
  • GFP green fluorescent protein
  • the labeling compound modifying group may be introduced via biotin or lectin instead of directly. Since biotin is a molecule that selectively reacts with avidin or streptavidin, when biotin is introduced, avidin or streptavidin may be labeled in advance. In the case of a lectin, the same effect can be obtained by labeling a saccharide that reacts selectively in advance.
  • A is a single bond or an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the alkylene group having 1 to 6 carbon atoms is a linear or branched alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 5 carbon atoms, more preferably 1 to 4 carbon atoms, still more preferably 1 to 3, most preferably 1 or 2 alkylene groups.
  • Specific examples include methylene, ethylene, trimethylene, propylene, isopropylene, butylene, isobutylene, pentylene, n-hexylene and the like.
  • the endogenous low molecular weight compound to be measured according to the present invention is a low molecular weight compound derived from a living body and usually indicates a compound having a molecular weight of 1000 or less.
  • the endogenous low molecular weight compound referred to in the present invention may be a low molecular weight compound existing in the living body. For example, even if it is a low molecular weight compound artificially produced by a synthesis method, the low molecular weight compound Are present in the living body, they are included in the endogenous low molecular weight compound in the present invention.
  • endogenous low molecular weight compounds include amino acids, organic acids, sugars, sugar phosphates, nucleic acids, free fatty acids, oligopeptides (dipeptides, tripeptides, tetrapeptides, pentapeptides, hexapeptides, etc.) and the like.
  • amino acids include glycine, alanine, valine, norvaline, leucine, isoleucine, norleucine, phenylglycine, phenylalanine, methionine, cysteine, cystine, homocysteine, homocystine, glutamine, asparagine, glutamic acid, aspartic acid, lysine, ornithine, hydroxy Lysine, arginine, histidine, 1-methylhistidine, 3-methylhistidine, proline, hydroxyproline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, citrulline, ⁇ -alanine, thyroxine, sarcosine, creatinine, ⁇ -aminobutyric acid or their derivatives, etc. Is mentioned.
  • organic acid examples include lactic acid, citric acid, cis-aconitic acid, isocitric acid, 2-oxoglutaric acid, succinic acid, fumaric acid, malic acid, oxaloacetic acid, maleic acid, maleic anhydride, and derivatives thereof. Can be mentioned.
  • sugar examples include glucose, sucrose, fructose, lactose, maltose, trehalose, N-acetylglucosamine, raffinose, acarbose and the like.
  • sugar phosphates include glucose-1-phosphate, glucose-6-phosphate, fructose-6-phosphate, 1,3-bisphosphoglycerate, fructose-1,6-bisphosphate, glyceraldehyde -3-phosphoric acid, dihydroxyacetone phosphoric acid, 3-phosphoglyceric acid, 2-phosphoglyceric acid, phosphoenolpyruvate and the like.
  • nucleic acids examples include adenine, adenosine, adenosine monophosphate, adenosine diphosphate, adenosine triphosphate, deoxyadenosine monophosphate, deoxyadenosine diphosphate, deoxyadenosine triphosphate, guanine, guanosine, and guanosine monophosphate.
  • free fatty acids examples include butyric acid, valeric acid, caproic acid, enanthic acid, caprylic acid, pelargonic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, pentadecylic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, margaric acid, stearic acid, oleic acid , Vaccenic acid, linoleic acid, linolenic acid, eleostearic acid, tuberculostearic acid, arachidic acid, arachidonic acid, behenic acid, lignoceric acid, nervonic acid, serotic acid, montanic acid, melicic acid, or derivatives thereof. Can be mentioned.
  • oligopeptides examples include carnosine ( ⁇ -alanyl-L-histidine), anserine ( ⁇ -alanyl-N-methylhistidine), and homoantherin (N- (4-aminobutyryl) -L-histidine).
  • amino acids are preferred from the viewpoint of becoming a material that can easily grasp the health state of animals.
  • amino acids include neutral amino acids, acidic amino acids, and basic amino acids.
  • Neutral amino acids are preferable from the viewpoint of becoming an animal health index, and branched chain amino acids (leucine, isoleucine or valine) or aromatic amino acids (phenylalanine). Or tyrosine) is more preferable, and an aromatic amino acid (phenylalanine or tyrosine) is more preferable.
  • the amino acid includes L-form, D-form and DL-form, and the asymmetric center of the amino acid may be any of R configuration, S configuration and RS configuration.
  • the method for producing the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention is not particularly limited, and the production method may vary depending on the starting material.
  • the basic compound in the synthesis of the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention is not particularly limited as long as it has an amino group, a carboxyl group, or a thiol group.
  • a compound similar to cysteine or cysteine can be used.
  • starting materials include (A) an endogenous low molecular weight compound already bound to the carboxyl group of the basic compound, and (B) an immunoresponsive hydrophobic group already bound to the amino group of the basic compound. (C) Any of the amino group, carboxyl group and thiol group of the basic compound may be unmodified.
  • (A) When (A) is used as a starting material, for example, compounds such as 9-fluorenylmethyl carbonate N-succinimidyl carbonate and 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate having a reactive group that easily reacts with an amino group (Hereinafter referred to as “immunoreactive hydrophobic group-containing compound”) is mixed at 4 to 80 ° C. under neutral to basic (pH 7 to 11) conditions and allowed to react for 1 minute to 24 hours. Thereby, an immunoresponsive hydrophobic group can be introduced into the starting material.
  • immunoresponsive hydrophobic group-containing compound compounds such as 9-fluorenylmethyl carbonate N-succinimidyl carbonate and 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate having a reactive group that easily reacts with an amino group
  • N-hydroxysuccinimide (NHS) or the like capable of binding an endogenous low-molecular compound to be detected is added to a non-aqueous solvent. Then, the mixture is subjected to a condensation reaction at 4 to 60 ° C. for 30 to 240 minutes in the presence of a condensing agent such as DCC, DIC, EDC, DIPCDI, HATU, HBTU, and DMT-MM.
  • a condensing agent such as DCC, DIC, EDC, DIPCDI, HATU, HBTU, and DMT-MM.
  • an endogenous low molecular weight compound containing an amino group is mixed at 4 to 80 ° C. under neutral to basic (pH 7 to 11) conditions, and reacted for 1 minute to 24 hours.
  • the group (y2 group) to which the endogenous low molecular weight compound is bonded can be introduced into the carboxyl group of the starting material.
  • a halogen group eg, F, Cl, Br, etc.
  • an isothiocyanate group, etc. are introduced into the y1 group, for example, an aldehyde group, a halogen group, an isothiocyanate group, etc.
  • a compound containing can be reacted with a starting material.
  • an amino group (—NH 2 ) is introduced into the y1 group, for example, a compound having two amino groups such as ethylenediamine is reacted, and one of the two amino groups is converted to a carboxyl of the starting material. What is necessary is just to couple
  • the y1 group contains a maleimide group.
  • the y1 group contains a hydrazine group.
  • the reaction of the above various compounds with the starting material can be carried out under the same conditions as in the case of N-hydroxysuccinimide.
  • various y2 groups can be introduced into the starting material by reacting an endogenous low molecular weight compound containing an amino group, a carboxyl group or a thiol group corresponding to various y1 groups under the same conditions as described above. it can.
  • (C) When (C) is used as a starting material, for example, an immunoreactive hydrophobic group-containing compound having a reactive group that easily reacts with an amino group is subjected to neutral to basic (pH 7 to 11) conditions at 4 to 80 ° C. And react for 1 minute to 24 hours. The subsequent reaction is the same as when (B) is used as the starting material.
  • the target compound after the chemical reaction (A) to (C) can be purified by separation and fractionation by chromatography or the like.
  • the collected solution is volatilized by freeze-drying or evaporation, and then the target compound is obtained.
  • the oxidation reaction may proceed and the thiol group may disappear due to the formation of a disulfide bond. Therefore, dithiothreitol (DTT) or the like is used for 30 to 360 minutes at room temperature. It is preferable to perform the reduction treatment.
  • the above compound is redissolved in a neutral to basic (pH 7 to 11) buffer solution containing EDTA, and then the polymer compound or the labeling compound (whichever (Including those chemically modified with a crosslinking agent) are reacted at 4 to 60 ° C. for 5 to 240 minutes.
  • the polymer compound is a compound that can provide the above-described high molecular weight imparting group (carrier protein binding group, synthetic polymer binding group, etc.), and is preferably a protein or polymer having a molecular weight of 10,000 or more.
  • the labeling compound is a compound that can provide the labeling compound modifying group described above.
  • the cross-linking agent preferably has an active group capable of binding to a thiol group and an amino group. After the reaction is completed, a high molecular weight imparting group or a labeling compound modifying group (including those via a crosslinking agent) is bound to the thiol group by ultrafiltration (molecular weight size 10000 cutoff) or gel filtration chromatography. The obtained compound can be purified.
  • the present invention also provides a method for producing an endogenous low molecular weight compound-recognizing antibody using a sulfur-containing amino acid derivative having a high molecular weight-providing group and an endogenous low molecular weight compound as an antigen.
  • an antigen (immunogen) of the antibody needs to be produced.
  • an antigen a compound having a structure represented mainly by the above general formula (II) can be used, and can be produced by the above-mentioned method or the examples described later.
  • the antibody obtained using the antigen is not particularly limited as long as it is an antibody capable of recognizing the endogenous low molecular weight compound to be measured, and in particular, one that recognizes a part of the surface molecule of the three-dimensional structure of the antigen is preferable. More preferably, the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention recognizes an immunoresponsive hydrophobic group and a portion of an endogenous low molecular weight compound. Further, the obtained antibody may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. As a polyclonal antibody, in addition to an antibody that recognizes a target hapten site, various types of antibodies such as an antibody that recognizes a part of a hapten and a protein can be used.
  • monoclonal antibody one that is favorable in terms of selectivity, sensitivity, and reproducibility for recognizing a hapten can be used.
  • monoclonal antibodies or polyclonal antibodies are not particularly limited, but can be produced, for example, as follows.
  • the antigen can be administered to an animal itself or together with a diluent or an adjuvant at a site where antibody production is possible.
  • a diluent water, physiological saline, phosphate buffer or the like is used.
  • an adjuvant that enhances antibody production ability Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, or the like is used.
  • the administration is usually performed once every 1 to 6 weeks, 2 to 10 times in total.
  • mice examples include mice, guinea pigs, rats, goats, monkeys, rhesus monkeys, dogs, rabbits, cows, chickens, cats, hamsters, sheep, pigs, camels and the like, and mice and rats are preferred in the present invention.
  • Hybridomas can be prepared by fusing with tumor cells (myeloma cells).
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256: 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include NS-1, P3, P3U1, SP2 / 0, AP-1, and MPC-11, and P3 is preferably used.
  • the preferred ratio of the number of cells (spleen cells) used and the number of myeloma cells is 1: 1-20: 1, PEG (preferably PEG1000-PEG6000) is added at a concentration of 10-80%, 20 Cell fusion can be carried out efficiently by incubating at -40 ° C, preferably 30-37 ° C for 1-20 minutes.
  • Hybridoma can be cultured in an animal cell medium supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine), for example.
  • the medium include RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal calf serum, GIT medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 1 to 10% fetal calf serum, or hybridoma culture.
  • a serum-free medium SFM-101, manufactured by Nissui Pharmaceutical
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. Culturing can usually be performed under 5% carbon dioxide gas.
  • Hybridomas producing monoclonal antibodies can be screened by measuring the antibody titer of the culture supernatant by a method known per se. For example, a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) to which an antigen or hapten is adsorbed, and then an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme (cells used for cell fusion are mice Anti-mouse immunoglobulin antibody is used in the case, or a predetermined protein (protein A, protein G, protein L, protein A / G, etc.) is added, and the monoclonal antibody bound to the solid phase is detected or quantified; Screening by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase adsorbed with globulin antibody or protein A, adding an antigen labeled with a radioactive substance or enzyme, etc., and detecting or quantifying the monoclonal antibody bound to the solid phase; can do.
  • the monoclonal antibody can be obtained from the culture supernatant of the screened hybridoma.
  • a monoclonal antibody can be obtained from the ascites of an animal using the hybridoma.
  • a mouse for example, a BALB / c mouse or the like
  • a substance having an immunosuppressive action such as pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane) is used.
  • Is transplanted into the abdominal cavity for example, 10 6 or more
  • ascites collected after about 1 to 3 weeks may be collected.
  • Purification of the monoclonal antibody from the hybridoma culture supernatant or ascites can be performed by a method known per se, for example, an immunoglobulin separation and purification method (for example, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion Absorption and desorption using an exchanger (eg, DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase, or active adsorbent such as protein A, protein G, or protein L, and collecting only the antibody to dissociate the binding Specific purification method for obtaining an antibody).
  • an immunoglobulin separation and purification method for example, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion Absorption and desorption using an exchanger (eg, DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase, or active adsorbent such as protein A, protein G, or protein L,
  • the manufacturing method including the following processes can be mentioned, for example.
  • step [e] screening can be performed using the antibody titer evaluation plate prepared in step [b], and hybridomas with high antibody producing ability can be selected by the screening.
  • a desired monoclonal antibody can be obtained from the culture supernatant of the hybridoma or the ascites of the animal as described above.
  • the method for producing a monoclonal antibody preferably includes the following steps in addition to the steps [a] to [f].
  • [G] a step of reacting the obtained two or more types of monoclonal antibodies with a hapten of the above general formula (II) corresponding to an endogenous low molecular compound to be measured;
  • [H] A step of selecting a monoclonal antibody having a negative reaction result in the step [g].
  • the degree of selection of the monoclonal antibody is adjusted using a compound having a functional group or structure different from that of the endogenous low molecular compound to be measured as the endogenous low molecular compound to be measured. be able to. That is, the closer the functional group and structure are to the endogenous low molecular weight compound to be measured, the more monoclonal antibody with higher antigen recognition specificity can be selected.
  • the endogenous low molecular weight compound to be measured is glycine, it is possible to select a monoclonal antibody having higher antigen recognition specificity by using alanine rather than phenylalanine as the endogenous low molecular weight compound to be measured. it can.
  • a monoclonal antibody having a higher antigen recognition specificity it is preferable to obtain a monoclonal antibody having a higher antigen recognition specificity while properly using an endogenous low molecular compound to be measured.
  • a monoclonal antibody whose antigen recognition specificity is adjusted can also be adopted depending on the use situation.
  • the monoclonal antibody of the present invention for example, when the measurement target is glycine, a monoclonal antibody produced by a hybridoma deposited under accession number FERM P-21947 can be used. Further, for example, when the measurement target is phenylalanine, a monoclonal antibody produced by a hybridoma deposited under accession number FERM P-21948 can be used. In addition, these hybridomas have all been applied for transfer to international deposits, and are given the receipt number FERM ABP-11384 and the receipt number FERM ABP-11385, respectively.
  • Polyclonal antibodies against the antigen can be produced by methods known to those skilled in the art. For example, an animal is immunized in the same manner as the monoclonal antibody production method described above. It can be produced by collecting a desired antibody-containing material and performing separation and purification of the antibody.
  • the method for producing a polyclonal antibody in the present invention is not particularly limited, but can be described in more detail as follows.
  • an animal is administered together with an antigen itself, a diluent or an adjuvant to a site where antibody production is possible.
  • a diluent or an adjuvant include those similar to those used in the above-described method for producing a monoclonal antibody (b).
  • the administration is usually performed once every 1 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
  • Polyclonal antibodies can be obtained as antisera by collecting blood of animals immunized by the above method.
  • the method for measuring the polyclonal antibody titer in the antiserum is the same as the method for measuring the antibody titer of the monoclonal antibody (b) above.
  • Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described monoclonal antibody separation and purification.
  • the present invention includes the following steps (A) to (C): (A) reacting the sulfur-containing amino acid derivative of 1 with a test sample to form a complex of the sulfur-containing amino acid derivative and an endogenous low-molecular compound present in the test sample; (B) contacting the complex obtained in step (A) with the endogenous low molecular weight compound-recognizing antibody obtained in 2 above, (C) measuring the label of the complex bound to the endogenous low molecular weight compound recognition antibody, It is possible to provide a method capable of measuring an endogenous small molecule compound, including
  • a sulfur-containing amino acid derivative of the present invention having a labeling compound modifying group (mainly a compound having a structure represented by the above general formula (III) is used as a measurement sample.
  • a complex of the endogenous low molecular weight compound to be measured is prepared.
  • the complex can be obtained by contacting a test sample containing the endogenous low molecular weight compound with the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention.
  • the contact between the two is not particularly limited as long as the endogenous low molecular weight compound can form a complex with the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention, but contact (reaction) is performed at 15 to 40 ° C. for 1 to 120 minutes. Just keep it.
  • the solution used at that time examples include a phosphate buffer solution and a borate buffer solution, and known solutions can be used depending on the measurement means.
  • the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention may be used in an excessive amount compared to the endogenous low molecular weight compound.
  • a solution having a concentration of 1 to 100 ⁇ mol / mL may be added to the test sample.
  • bond is also contained in the said composite_body
  • test sample used in the present invention is not particularly limited as long as it contains an endogenous low molecular weight compound or measurement of the endogenous low molecular weight compound is required, but in vivo where antibody production is difficult
  • a sample derived from a living body is preferable from the viewpoint of measuring a low molecular weight compound.
  • the sample derived from a living body may be a sample derived from an animal or a sample derived from a plant, and may be a processed product (food, beverage, etc.) of a sample derived from an animal and / or a plant.
  • animal-derived samples include blood, plasma, serum, extravascular fluid, interstitial fluid, cerebrospinal fluid, synovial fluid, pleural fluid, lymph fluid, saliva, semen, tears, urine, and the like. be able to.
  • blood, serum, plasma, saliva, semen, tears, and urine are preferable, blood, serum, and plasma are more preferable, and plasma or serum is still more preferable from the viewpoint of less invasion to animals.
  • plant-derived samples include fruit juice and molasses.
  • the endogenous low molecular weight compound is measured by using the antibody obtained in 2 above for the complex of the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention having a labeling compound modifying group and the endogenous low molecular weight compound.
  • An embodiment of the measurement method is not particularly limited. For example, first, a measurement sample labeled as described above is prepared. Next, the antibody obtained in 2 above is immobilized on a carrier. At this time, the antibody can recognize a part of the structure of the complex (immunoresponsive hydrophobic group and endogenous low molecular weight compound). Then, the complex is captured by the immobilized antibody. Finally, the amount of label contained in the captured complex is measured, and the endogenous low molecular weight compound is measured.
  • ELISA is particularly preferable among immunoassays from the viewpoints of sensitivity, rapidity, accuracy, safety, automation, and the like. The method for measuring the endogenous low molecular weight compound can be described in more detail as follows.
  • (A) Immobilization of antibody The endogenous low molecular weight compound-recognizing antibody obtained in 2 above is immobilized on a carrier.
  • the carrier to be used include synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, polydivinylbenzene, and silicon, or glass, and specifically, 48 holes, 96 holes, 192 holes, 384 holes and the like molded with a synthetic resin.
  • a microtiter plate is preferred.
  • a buffer solution containing the antibody for immobilization may be placed on a carrier and incubated.
  • an antibody that recognizes protein A, protein G, protein A / G, protein L, or an antibody derived from an animal species immunized to obtain the antibody for example, if the antibody is obtained from a mouse If the anti-mouse antibody derived from rabbit or goat is previously adsorbed and coated on a carrier and then the antibody is added, the immobilization efficiency increases. Further, since the antibody is a molecule containing an amino group, the antibody can be directly immobilized on the carrier by using a carrier on which the N-hydroxysuccinimide active ester is immobilized.
  • the antibody concentration in the buffer is usually 0.01 ⁇ g / mL to 100 ⁇ g / mL, and any known buffer can be used as the buffer depending on the measurement means.
  • the antibody used for the solid phase may be any antibody produced by the method shown in 2 above, but the immunoreactive hydrophobic group and intrinsic factor in the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention may be used.
  • An antibody capable of recognizing the structural portion of a low molecular weight compound is preferable.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and is a Fab fragment or F (ab ′) 2 fragment, or a polypeptide (scFv (single chain variable region) in which only the variable region of the antibody is expressed. ) Or hypervariable region (CDR), etc.), and may be part of an antibody having antigen-binding properties.
  • Blocking In order to prevent nonspecific adsorption of the protein to the solid phase surface of the carrier, the solid phase surface portion to which the antibody for solid phase immobilization has not been adsorbed is blocked with a protein unrelated to the antibody.
  • blocking agents include bovine serum albumin (BSA) or skim milk solution, or commercially available Block Ace (DS Pharma Biomedical), Applie Block (Seikagaku Corporation), N101 / N102 (Nippon Yushi Co., Ltd.), etc. Can be used. Blocking is performed by adding the blocking agent to the carrier and, for example, incubating at about 4 ° C. for 1 hour to overnight and then washing with a washing solution. Although there is no restriction
  • (C) Antigen-antibody reaction A sample containing a complex of the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention having a labeling compound modifying group and an endogenous low-molecular compound on the solid phase surface treated in (a) and (b) above (Sample for measurement) is added, and an antigen-antibody reaction between the antibody immobilized on a carrier and the complex is performed.
  • a complex of the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention having a labeling compound modification group and an endogenous low molecular weight compound is prepared in advance as a standard sample, and various kinds of samples are prepared in parallel with the measurement sample. A standard sample of concentration is added, and an antigen-antibody reaction is similarly performed.
  • the antigen-antibody reaction can be carried out usually at 10 to 40 ° C., preferably 25 to 37 ° C., for 1 minute to several hours.
  • (E) Measurement of endogenous low molecular weight compound After the treatment of (d) above, the target endogenous low molecular weight compound is measured by examining the amount of the labeled compound possessed by the complex bound to the immobilized antibody. can do.
  • a calibration curve can be prepared in advance using standard samples of various concentrations subjected to the antigen-antibody reaction in parallel in (c). By using the calibration curve, the amount of the endogenous low molecular weight compound contained in the test sample can be determined.
  • the amount of the labeling compound can be examined by adding a chromogenic substrate solution that reacts with the enzyme and then measuring a predetermined absorbance.
  • a chromogenic substrate solution containing hydrogen peroxide and 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine or o-phenylenediamine can be used.
  • the enzyme reaction is stopped by adding sulfuric acid.
  • 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine is used, the absorbance at 450 nm is measured.
  • the absorbance at 492 nm is measured. In order to correct the background value, it is desirable to simultaneously measure the absorbance at 630 nm.
  • alkaline phosphatase for example, a method of coloring with p-nitrophenyl phosphate as a substrate, adding an NaOH solution to stop the enzyme reaction, and measuring the absorbance at 415 nm can be mentioned.
  • ⁇ -galactosidase for example, 4-methylumbelliferyl- ⁇ -D-galactopyranoside is developed as a substrate, and a 0.1 M glycine-NaOH buffer (pH 10.3) solution is used.
  • a glycine-NaOH buffer pH 10.3
  • the radiation dose can be measured using autoradiography or a scintillation measuring instrument.
  • a binding molecule such as biotin or lectin is used instead of the labeled compound, if biotin is reacted with labeled avidin or labeled streptavidin, if lectin is reacted with a labeled saccharide, The amount of the labeled compound thereafter can be examined in the same manner as described above.
  • the reaction of the binding molecule can be performed by a method known to those skilled in the art.
  • the configuration shown in FIG. 5 can be used as another embodiment for measuring an endogenous low molecular weight compound in the present invention.
  • the target endogenous low molecular weight compound can be measured using the above-mentioned sulfur-containing amino acid derivative having no labeling compound modifying group. Specifically, a sample containing a complex of a sulfur-containing amino acid derivative attached with biotin or the like and an endogenous low molecular weight compound is added to a plate on which avidin or streptavidin or the like is immobilized, and avidin or streptavidin is added. The complex is immobilized on a plate via a binding molecule such as biotin.
  • an antibody that recognizes the complex is added to perform an antigen-antibody reaction under predetermined conditions, and a labeled antibody that recognizes the antibody (such as an HRP anti-mouse IgG antibody) is added to measure the amount of the label.
  • a labeled antibody that recognizes the antibody such as an HRP anti-mouse IgG antibody
  • cleaning can be appropriately performed using a cleaning liquid between the steps.
  • another embodiment for measuring endogenous low molecular weight compounds includes, for example, the following method.
  • the target endogenous low molecular weight compound can be measured using the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention which has no labeling compound modification group and is attached with biotin or the like instead.
  • the antibody obtained in 2 above is contacted in the same container to establish an antigen-antibody reaction.
  • the antigen-antibody complex obtained by the reaction is immobilized on a carrier such as a plate, and labeled avidin or streptavidin is added thereon.
  • avidin or streptavidin is captured by biotin or the like contained in the solid-phased antigen-antibody complex, and by measuring the amount of label attached to the captured avidin or the like, Endogenous small molecule compounds can be measured. Also in the above-described embodiment, washing can be appropriately performed between the respective steps using a washing liquid, and blocking treatment can be appropriately performed at the time of immobilization.
  • an antigen (immunogen) for antibody production a synthesized hapten obtained by binding a carrier protein via a crosslinking agent was used.
  • the immunoreactive hydrophobic group introduced into the X moiety of the general formula (I) is a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group or quinolinylaminocarbonyl group, and the antigen to be measured introduced into the Y moiety (intrinsic low
  • the molecular compound is glycine (Gly), phenylalanine (Phe) or isoleucine (Ile), and the carrier protein, which is a polymer compound introduced into the Z moiety, is bovine serum albumin (BSA), and sulfosuccinimidyl as a crosslinking agent.
  • BSA bovine serum albumin
  • sulfosuccinimidyl as a crosslinking agent. 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carbox
  • Hapten synthesis method 1 Fmoc-Cys [H] -Gly
  • the starting material (Cys-Gly) 2 (manufactured by BACHEM) was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to 20 mmol / L. This solution was diluted 10-fold with 50% acetonitrile solution to prepare 5 mL of 2 mmol / L (Cys-Phe) 2 solution. Further, 9-Fluorenylmethyl Succinimidyl Carbonate (Fmoc-OSu) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in acetonitrile so as to be 0.25 mol / L.
  • Fmoc-OSu 9-Fluorenylmethyl Succinimidyl Carbonate
  • the HPLC system was Shimadzu's CLASS-VP series, and the column was Cadenza (inner diameter 4.6 mm x length 250 mm, manufactured by Intact), which was a reversed-phase column.
  • the analysis conditions were mobile phase A: water / acetonitrile (95 / 5) with 0.1% formic acid added, mobile phase B: water / acetonitrile (10/90) with 0.1% formic acid added, flow rate: 1 mL / min, column oven: 40 ° C., UV detection wavelength: 265 nm
  • Elution conditions mobile phase B 45% constant (measurement start time 0-10 minutes), mobile phase B 45-100% (10-30 minutes).
  • the reaction solution containing Fmoc-Cys [H] -Gly was introduced into HPLC, and the peak derived from Fmoc-Cys [H] -Gly was collected while monitoring the chromatogram. Since the sample injection amount was 400 ⁇ L per time, the collection operation was repeated for the above reaction solution (total 6.5 mL). The collected fractions were collected in the same container, frozen under liquid nitrogen, and dried by a freeze dryer. As a result of weighing the powder obtained by freeze-drying, it was 4.79 mg (yield 49%). Part of the lyophilized compound was redissolved and the rest was stored at -20 ° C until needed. As a result of mass measurement of the re-dissolved compound using a mass spectrometer, a mass corresponding to Fmoc-Cys [H] -Gly was obtained, indicating that the synthesized hapten was the target compound.
  • the precipitated compound was ultrafiltered with a 0.45 ⁇ m filter, and the filtrate was introduced into HPLC to separate and fractionate (Fmoc-Cys-Ile) 2 .
  • HPLC apparatus used was a CLASS-VP series manufactured by Shimadzu Corporation, and the column used was a reverse phase column Cadenza (inner diameter 4.6 mm x length 250 mm, manufactured by Intact).
  • the HPLC apparatus and separation column were the same as those described above, and the analysis conditions for Fmoc-Cys [H] -Ile were mobile phase A: water / acetonitrile (95/5) with 0.1% formic acid added, Mobile phase B: Water / acetonitrile (10/90) with 0.1% formic acid, flow rate: 0.9-1.0 mL / min (0-5 min measurement start), 1.0-1.0 mL / min (5-25 min) Column oven: 40 ° C., UV detection wavelength: 265 nm, liquid feeding condition: mobile phase B was 72% constant.
  • the HPLC system is CLASS-VP series manufactured by Shimadzu Corporation, the column is Cadenza (inner diameter 4.6mm x length 75mm, manufactured by Intact), and the analysis conditions are 0.1% in mobile phase A: water / acetonitrile (95/5).
  • mobile phase B water / acetonitrile (10/90) with 0.1% formic acid added, flow rate: 1 mL / min, column oven: 40 ° C., UV detection wavelength: 265 nm, liquid feeding condition: mobile Phase B was 40-100% (0-30 minutes).
  • Hapten synthesis method 4 AQC-Cys [H] -Phe
  • the starting material (Cys-Phe) 2 (manufactured by BACHEM) was dissolved in 0.1 M hydrochloric acid so as to be 10 mmol / L.
  • AccQ • Ultra Derivatization Reagent of AccQ • Tag Ultra Derivatization Kit (manufactured by Waters) was prepared to 100 mmol / L with acetonitrile (AQC reagent).
  • 500 ⁇ L of the prepared (Cys-Phe) 2 solution, 1000 ⁇ L of AQC reagent, and 1000 ⁇ L of 0.1 mol / L borate buffer were mixed and heated at 55 ° C. for 20 minutes.
  • Analytical conditions for AQC-Cys [H] -Phe using the Shimadzu CLASS-VP series HPLC system and the separation column Cadenza (inner diameter 4.6 mm x length 250 mm, manufactured by Intact) as a reverse phase column are mobile phase A: water / acetonitrile (95/5) with 0.1% formic acid, mobile phase B: water / acetonitrile (10/90) with 0.1% formic acid, flow rate: 1 mL / min, Column oven: 40 ° C., UV detection wavelength: 265 nm, liquid feeding condition: mobile phase B 15-60% (0-10 minutes).
  • Hapten synthesis method 5 Cys [H] -Phe
  • the starting material (Cys-Phe) 2 (manufactured by BACHEM) was dissolved in 0.1 M hydrochloric acid so as to be 10 mmol / L.
  • 250 ⁇ L of 2 mol / L DTT aqueous solution was added and reacted at 40 ° C. for 2 hours.
  • the target compound Cys [H] -Phe was separated and fractionated by HPLC.
  • FIG. 1 shows MALDI-TOF-MS spectra of non-chemically modified BSA, maleimide activated BSA and Fmoc-Cys [H] -Gly / BSA conjugate.
  • the mass difference between non-chemically modified BSA and maleimide activated BSA was 8186.
  • Fmoc-Cys [H] -Gly has a molecular weight of 386, it was found that an average of 26 residues of Fmoc-Cys [H] -Gly was introduced per molecule of maleimide-activated BSA. Similarly, when Fmoc-Cys [H] -Phe, Fmoc-Cys [H] -Ile, AQC-Cys [H] -Phe, and Cys [H] -Phe were reacted with maleimide-activated BSA, An increase was observed, indicating that a hapten of 10 residues or more was introduced per molecule of maleimide-activated BSA.
  • Fmoc-Cys [H] -Gly was adjusted to 2 ⁇ g / mL using 50 mM phosphate buffer (containing 10 mM EDTA), and 100 ⁇ L of the solution was added to each well of the plate and left at 4 ° C. overnight. . Next, the well was washed three times with PBS (containing 0.05% Tween20).
  • the spleen aseptically removed from the mouse was loosened in a MEM- ⁇ medium (Gibco) using a cell strainer (Falcon).
  • the mouse myeloma cell line P3-Ag-X3 cells were cultured in advance in a sufficient amount, collected, and then counted.
  • the culture supernatant was removed by centrifugation and the cell pellet was loosened.
  • the cell pellet container was immersed in a 37 ° C.
  • Antigen-antibody reaction is OPD solution (0.018% [w / v] orthophenylenediamine-containing 20 mM citrate buffer (pH 5.0) with 0.018% [v / v] hydrogen peroxide solution added just before the reaction) was added to each well in an amount of 100 ⁇ L, and the absorbance was measured (measurement wavelength: 492 nm). A well showing an absorbance of 0.5 or more was determined as a positive well, and the cell culture solution in the positive well was transferred to another 96-well microplate to continue the culture.
  • Wells that were determined to be positive in the primary screening include false positives.After culturing for 1 week, the culture supernatant was subjected to secondary screening in the same manner, and wells that showed an absorbance of 3.0 or more were determined as positive wells. did.
  • the culture supernatant containing the monocloned hybridoma showed a positive determination, it was cloned again by limiting dilution (recloning). After recloning, wells in which single colonies were observed with a microscope were similarly limited, and it was confirmed that the culture supernatant showed a positive determination, and a monoclonal antibody-producing hybridoma was obtained.
  • the obtained hybridoma was deposited with the Patent Organism Depository Center of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-1-1 Tsukuba Center, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture) on April 1, 2010.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody against -Cys-Gly is assigned accession number FERM P-21947, and the hybridoma producing the monoclonal antibody against Fmoc-Cys-Phe is assigned accession number FERM P-21948. All of these hybridomas have been applied for international deposit at the same center, and the hybridoma producing the monoclonal antibody against Fmoc-Cys-Gly is given the receipt number FERM ABP-11384, and it is against Fmoc-Cys-Phe. The hybridoma producing the monoclonal antibody is given the receipt number FERM ABP-11385 (notification date of receipt: May 16, 2011).
  • the established hybridoma strain was cultured in a complete medium and suspended in MEM- ⁇ medium at a concentration of 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • the suspension was administered intraperitoneally to BALB / c mice previously administered pristane 7 days ago (0.5 mL / animal). After 7 to 14 days, ascites was collected from the mice, and the cells were removed by centrifugation. The obtained ascites was purified by a Protein G column (manufactured by GE Healthcare).
  • the ascites was diluted 10-fold with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) and added to the Protein G column.
  • Antibody component immunoglobulin G
  • the contaminant components remaining in the column were washed and removed with a 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) solution, and then the antibody component was eluted with a glycine buffer.
  • the eluted antibody component was immediately neutralized with 1M Tris buffer (pH 9.0).
  • the purified antibody solution was stored frozen at ⁇ 20 ° C. until needed.
  • Maleimide-PEG2-Biotin (manufactured by PIERCE) was dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 7.3) containing 0.1% EDTA, mixed with Fmoc-Cys [H] solution, and allowed to stand at room temperature for 2 hours. The reaction solution was introduced into HPLC, and the biotin- [Fmoc-Cys] fraction was collected and lyophilized.
  • the measurement principle by ELISA is shown in FIG.
  • the antibody solution recognizing Fmoc-Cys-Gly was diluted to 0.1 ⁇ g / mL with 50 mM phosphate buffer (pH 7.3) (PBS) containing 0.9% sodium chloride. 100 ⁇ L of this solution was added to each well of Reacti-Bind TM Protein A / G Coated Plate (manufactured by Thermo Scientific) and left at room temperature for 2 hours. Subsequently, the inside of the well was washed three times with a phosphate buffer solution (PBST) containing 0.05% Tween20.
  • PBST phosphate buffer solution
  • the biotin- [Fmoc-Cys-Gly] compound was diluted stepwise with 0.1% gelatin-containing PBS solution (GPB), and 100 ⁇ L of the diluted solution was added to each well to carry out an antigen-antibody reaction. After leaving at room temperature for 60 minutes, the wells were washed three times with PBST solution. After washing, 100 ⁇ L of 1 ⁇ g / mL HRP-labeled streptavidin conjugate solution was added to each well and left at room temperature for 60 minutes.
  • OPD solution 25 mM citric acid / 50 mM disodium hydrogen phosphate (pH 5.0) solution containing 10 mg of orthophenylenediamine and 6 ⁇ L of hydrogen peroxide
  • HRP phosphate
  • a color reaction was performed by adding 100 ⁇ L of each well as a substrate solution.
  • 100 ⁇ L of 1M sulfuric acid was added to each well as a reaction stop solution, and the absorbance of each well was measured at a measurement wavelength of 492 nm.
  • the anti-Fmoc-Cys-Gly antibody obtained as described above was confirmed by using a biotin- [Fmoc-Cys-Gly] standard solution, which is an antigen standard solution, whether the ELISA principle of FIG. As a result, a dose action curve was obtained in which the absorbance increased with the concentration of the antigen standard solution (FIG. 3A). This confirmed that the ELISA principle with anti-Fmoc-Cys-Gly antibody was established.
  • Each amino acid is glycine, sarcosine, alanine, ⁇ -alanine, ⁇ -aminobutyric acid (GABA), serine, proline, valine, taurine, threonine, valine, leucine, isoleucine, asparagine, aspartic acid, glutamic acid, methionine, histidine, phenylalanine, Arginine and tryptophan were applied.
  • the derivatization reaction solution was diluted 1000 times with a PBS solution containing 0.1% gelatin to prepare a sample for ELISA measurement.
  • Protein A / G Coated plate manufactured by Thermo Scientific
  • 100 ⁇ L of anti-Fmoc-Cys-Gly antibody solution concentration 0.1 ⁇ g / mL
  • the antibody was immobilized by allowing to stand at room temperature for 2 hours. Next, each well was washed with PBST three times, and 100 ⁇ L of an ELISA measurement sample was added to each well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Next, each well was washed and 1000 times with a GPB solution containing 1 ⁇ g / mL streptavidin-HRP conjugate (Jackson Immuno Research) solution (5% [v / v] Applie Block (Seikagaku Corporation)). 100 ⁇ L was added to each well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Thereafter, each well was washed and a color reaction was performed with an OPD solution.
  • a GPB solution containing 1 ⁇ g / mL streptavidin-HRP conjugate (Jackson Immuno Research) solution (5% [v / v] Applie Block (Seikagaku Corporation)
  • FIG. 3B shows a plot of absorbance corresponding to the concentration of each amino acid.
  • the anti-Fmoc-Cys-Phe antibody and anti-Fmoc-Cys-Ile antibody prepared in the same manner were examined for cross-reactivity with amino acids other than Phe and Ile.
  • the anti-Fmoc-Cys-Phe antibody when the ratio of other amino acids when cross-reactivity was defined as 100% responsiveness to Phe, Tyr was 11%, Leu was 10%, and other The amino acid content was 0.1% or less.
  • the anti-Fmoc-Cys-Ile antibody when responsiveness to Ile was 100%, Leu was 16%, Phe was 13%, and other amino acids were 1% or less. From these results, it was shown that anti-Fmoc-Cys-Phe antibody and anti-Fmoc-Cys-Ile antibody can also be used as tools for selectively detecting the measurement target.
  • Each protein was mixed with acetonitrile 1: 1 to precipitate proteins in the sample. Mixing was performed by vortexing for about 15 to 30 seconds, and the protein was precipitated by centrifugation. The supernatant after the treatment was diluted 1 to 100 times with a PBS solution and then subjected to a derivatization reaction with a biotin- [Fmoc-Cys-NHS] reagent. In the derivatization reaction, 11 ⁇ L of acetonitrile, 4 ⁇ L of 0.1 M borate buffer (pH 9), 4 ⁇ L of the above protein sample, and 1 ⁇ L of derivatization reagent biotin- [Fmoc-Cys-NHS] were mixed. Mixing was performed by vortexing for about 15 to 30 seconds and left at room temperature for 15 minutes. Next, 20 ⁇ L of 0.2% acetic acid solution was added to stop the derivatization reaction.
  • the Gly standard solution used for the calibration curve was prepared by serial dilution with PBS in a concentration range of 0.1 to 1000 ⁇ M, and then the Gly standard solution of each concentration and acetonitrile were mixed at 1: 1.
  • the Gly standard solution after mixing with acetonitrile was subjected to a derivatization reaction with a biotin- [Fmoc-Cys-NHS] reagent.
  • Gly quantification by ELISA measurement was performed according to the following procedure. First, 100 ⁇ L of anti-Fmoc-Cys-Gly antibody at a concentration of 0.1 ⁇ g / mL was added to each well of the Protein A / G coating plate, and left at room temperature for 2 hours. Next, the well was washed three times with a PBST solution to prepare an anti-Fmoc-Cys-Gly antibody-immobilized plate. To each well of this plate, 100 ⁇ L each of the derivatization reaction and diluted real sample or Gly standard solution was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour. During this time, all wells were sealed with a plate seal.
  • the wells were washed three times with PBST solution, and 100 ⁇ L of the streptavidin-HRP conjugate solution diluted to a concentration of 1 ⁇ g / mL with Applie Block / GPB (5/95) mixed solution was added to each well. After standing at room temperature for 1 hour (all wells were sealed with a plate seal during this period), the wells were washed three times with PBST solution. Thereafter, each well was washed and a color reaction was performed with an OPD solution.
  • FIG. 4A shows the results of plotting the respective measured values obtained by ELISA and LC-MS for the Gly concentrations of sake, FCS and rat plasma samples.
  • FCS fetal bovine serum
  • SD system female, 20 weeks old, manufactured by Charles River, Japan
  • Phe phenylalanine
  • LC-MS high performance liquid chromatography-mass spectrometer
  • Each protein was mixed with acetonitrile 1: 1 to precipitate proteins in the sample. Mixing was performed by vortexing for about 15 to 30 seconds, and the protein was precipitated by centrifugation. The supernatant after the treatment was diluted 1 to 100 times with a PBS solution and then subjected to a derivatization reaction with a biotin- [Fmoc-Cys-NHS] reagent. In the derivatization reaction, 11 ⁇ L of acetonitrile, 4 ⁇ L of 0.1 M borate buffer (pH 9), 4 ⁇ L of the above protein sample, and 1 ⁇ L of derivatization reagent biotin- [Fmoc-Cys-NHS] were mixed. Mixing was performed by vortexing for about 15 to 30 seconds and left at room temperature for 15 minutes. Next, 20 ⁇ L of 0.2% acetic acid solution was added to stop the derivatization reaction.
  • the Phe standard solution used for the calibration curve was prepared by serial dilution of PBS with a concentration range of 0.1 to 1000 ⁇ M, and then the Phe standard solution of each concentration and acetonitrile were mixed at 1: 1.
  • the Phe standard solution after mixing with acetonitrile was subjected to a derivatization reaction with a biotin- [Fmoc-Cys-NHS] reagent.
  • the derivatization reaction was performed by mixing 11 ⁇ L of acetonitrile, 4 ⁇ L of 0.1 M borate buffer (pH 9), 4 ⁇ L of the above acetonitrile mixed Phe standard solution, and 1 ⁇ L of the derivatization reagent biotin- [Fmoc-Cys-NHS]. Mixing was performed by vortexing for about 15 to 30 seconds and left at room temperature for 15 minutes. Next, 20 ⁇ L of 0.2% acetic acid solution was added to stop the derivatization reaction. The actual sample after the derivatization reaction and the Phe standard solution were diluted 2000 times with a 0.1% gelatin-containing PBS solution, and then subjected to ELISA measurement.
  • the Phe quantification by ELISA measurement was performed according to the following procedure. First, 100 ⁇ L of an anti-Fmoc-Cys-Phe antibody having a concentration of 0.1 ⁇ g / mL was added to each well of the Protein A / G coating plate and left at room temperature for 2 hours. Subsequently, the well was washed three times with a PBST solution to obtain an anti-Fmoc-Cys-Phe antibody-immobilized plate. To each well of this plate, 100 ⁇ L of the actual sample or Phe standard solution that had been derivatized and diluted was added, and left at room temperature for 1 hour. During this time, all wells were sealed with a plate seal.
  • the wells were washed three times with PBST solution, and 100 ⁇ L of the streptavidin-HRP conjugate solution diluted to a concentration of 1 ⁇ g / mL with Applie Block / GPB (5/95) mixture was added to each well. After standing at room temperature for 1 hour (all wells were sealed with a plate seal during this period), the wells were washed three times with PBST solution. Thereafter, each well was washed and a color reaction was performed with an OPD solution.
  • FIG. 6 shows a graph comparing the measured values obtained by ELISA and LC-MS for the Phe concentrations of FCS and rat plasma samples. From this result, it was found that the Phe measurement value in the actual sample obtained by ELISA showed almost the same value as the Phe measurement value obtained by LC-MS.
  • the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention can provide a method for measuring an endogenous low molecular weight compound with high sensitivity, specificity and simplicity.
  • the measuring method using the sulfur-containing amino acid derivative of the present invention can be used for examination, diagnosis and the like, and is useful in the fields of medical care, food, environment and the like.
  • an amino acid that is an endogenous low molecular weight compound is also an animal health index, and health status can be managed by measuring amino acids in the body.
  • liver disorders may be found by examining the balance of amino acids in the body. By measuring the amino acid in the body in this way, it can be connected to preventive medicine or early detection and early treatment of diseases.

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Abstract

　本発明は、内因性低分子化合物を高感度で特異的且つ簡便に測定する方法を提供することを目的とする。本発明では、特定の含硫黄アミノ酸誘導体を用いることにより、内因性低分子化合物を高感度で特異的且つ簡便に測定する方法を提供することができる。

Description

含硫黄アミノ酸誘導体
　本発明は、特定の含硫黄アミノ酸誘導体に関する。更に、該含硫黄アミノ酸誘導体含有試薬、該含硫黄アミノ酸誘導体を用いた内因性低分子化合物認識抗体及びその製造方法、並びに含硫黄アミノ酸誘導体を用いた内因性低分子化合物の測定方法に関する。
　近年、低分子化合物に対する非競合型の免疫学的測定法が報告されている（特許文献１）。該報告によれば、ハプテン（抗原）と抗ハプテン抗体（第１抗体）とからなる抗原－抗体複合体を免疫原として動物免疫し、該複合体を認識し得る新たな第２抗体を獲得している。測定方法としては、第１抗体を担体上に固相化し、ハプテンとの抗原抗体反応を成立させ、次いで、標識された第２抗体を結合させるという原理である。しかしながら該方法を用いるには少なくとも２種類の抗体が必要となり、測定法の構築に至るまでの時間とコスト増大を招くことになる。また、抗原に対して選択性の高い抗体を少なくとも２つ作製する必要がある。その他にも低分子化合物を検出又は測定するための報告はなされているが（特許文献２、非特許文献１～３）、上記と同様に複数種類の抗体が必要であったり、低分子化合物を定量できる程度の感度が得られなかったりしている。
　低分子化合物（特に、内因性低分子化合物）に対して充分な親和性を有する抗体を得られない要因は２つあげられる。一つは抗原決定基のサイズである。一般に、抗原決定基のサイズは、提示された分子の大きさとしてアミノ酸３～８残基程度といわれている。したがって、低分子化合物がアミノ酸である場合、例えば１残基のアミノ酸を認識するような抗アミノ酸抗体を獲得することは困難であり、仮に獲得できたとしても、その親和性は低いと考えられる。もう一つは、アミノ酸をはじめとした生体内の化合物に対しては、一般に、免疫応答が生じにくいという点である。
　抗原抗体反応を調べるイムノアッセイは、通常、競合型イムノアッセイと非競合型イムノアッセイの２つに大別される。競合型イムノアッセイでは、担体上に一定量固相化された抗体に対して試料中の抗原と一定量の標識抗原とが競合する。即ち、試料中の抗原量が少ない場合は、標識抗原と抗体との結合量が多くなり、シグナル強度は高く観測されるのに対して、試料中の抗原量が多い場合は逆にシグナル強度は低く観測される。他方、非競合型イムノアッセイとしてはサンドイッチ型イムノアッセイが知られている。サンドイッチ型イムノアッセイでは、担体上に固相化された過剰量の抗体（第１抗体）に抗原含有試料が添加され、次いで標識抗体（第２抗体）が添加される。第２抗体は第１抗体と同じ抗原を認識するが、それぞれの抗原表面の認識部位が異なるため、１つの抗原を２つの抗体で挟み込むサンドイッチ型の結合様式となる。結果として、抗原量に応じたシグナル増大が誘起され抗原量の定量分析が可能となる。
　一般に、競合型イムノアッセイでは、結合型（Ｂ）と遊離型（Ｆ）とが抗原抗体反応において平衡状態に達するまで数時間から終夜にかけて反応時間を必要とする。また競合型イムノアッセイでは、非標識抗原と標識抗原との間で抗体に対する親和性に差異があった場合、分析値の正確度の低下を招くおそれがある。
　これに対し、非競合型イムノアッセイでは反応時間の短時間化が可能となり、また抗原量は標識抗体量に対応するため、測定濃度範囲の広い測定法が構築できる。また、抗原抗体反応時には２つの抗体は抗原量に対して過剰量存在するため、下式（１）の平衡状態が複合体生成方向に傾くことから、微量の抗原量であっても複合体を形成し易い環境となる。結果として、非競合型イムノアッセイは競合型イムノアッセイに比べて高感度測定が可能となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　しかしながら、上述の通り、サンドイッチ型のような非競合型イムノアッセイでは一つの抗原に対して２種類の抗体が必要となる。また、これらの抗体はそれぞれ抗原の別々の領域を認識するものでなければならない。そのため、抗原が低分子化合物である場合には、分子サイズが小さく、認識部位の異なる２つの抗体を獲得することは困難であることから、低分子化合物の測定において非競合型イムノアッセイを用いることは容易ではなかった。
特開平８－２１１０５４号公報 特開２０００－５５９１７号公報
J. Immunological. Met. 272, 1-10 (2003) Histochemistry 90, 427-445 (1989) Clin. Chem. Lab. Med. 42, 1377-1383 (2004)
　本発明の課題は、内因性低分子化合物を高感度で特異的且つ簡便に測定する方法を提供することである。
　本発明者らは、特定の含硫黄アミノ酸誘導体を用いることにより上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下の通りである。
（１）下記一般式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（式中、Ｘは免疫応答性疎水基、Ｙは内因性低分子化合物反応活性基又は内因性低分子化合物が結合した基、Ｚは水素原子、高分子量付与基又は標識化合物修飾基、Ａは単結合又は炭素数１～６のアルキレン基である。）
で表される構造を有することを特徴とする、含硫黄アミノ酸誘導体。
（２）一般式（Ｉ）が下記一般式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式中、Ｘは免疫応答性疎水基、Ｙ’は内因性低分子化合物が結合した基、Ｚ’は水素原子又は高分子量付与基、Ａは単結合又は炭素数１～６のアルキレン基である。）
で表される構造を有することを特徴とする、（１）に記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
（３）一般式（Ｉ）が下記一般式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（式中、Ｘは免疫応答性疎水基、Ｙ’’は内因性低分子化合物反応活性基、Ｚ’’は標識化合物修飾基、Ａは単結合又は炭素数１～６のアルキレン基である。）
で表される構造を有することを特徴とする、（１）に記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
（４）免疫応答性疎水基が環状構造を有することを特徴とする、（１）～（３）のいずれかに記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
（５）免疫応答性疎水基が、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基又はキノリニルアミノカルボニル基であることを特徴とする、（４）に記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
（６）内因性低分子化合物反応活性基が、アルデヒド基、Ｎ－スクシンイミジル基、ハロゲン基、イソチオシアネート基又はマレイミド基を含有することを特徴とする、（１）又は（３）に記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
（７）高分子量付与基又は標識化合物修飾基がリンカーを介して結合されていることを特徴とする、（１）～（３）のいずれかに記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
（８）（１）～（７）のいずれかに記載の含硫黄アミノ酸誘導体を含むことを特徴とする、内因性低分子化合物を測定するための試薬。
（９）内因性低分子化合物がアミノ酸であることを特徴とする、（８）に記載の試薬。
（１０）（２）に記載の含硫黄アミノ酸誘導体を抗原として用いて動物を免疫する工程を含む、内因性低分子化合物認識抗体の製造方法。
（１１）（２）に記載の含硫黄アミノ酸誘導体を抗原として用いることにより得られることを特徴とする、内因性低分子化合物認識抗体。
（１２）前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする、（１１）に記載の内因性低分子化合物認識抗体。
（１３）以下の工程（Ａ）～（Ｃ）を含むことを特徴とする、内因性低分子化合物の測定方法：
（Ａ）（３）に記載の含硫黄アミノ酸誘導体と被験試料とを反応させ、該含硫黄アミノ酸誘導体と被験試料中に存在する内因性低分子化合物との複合体を形成させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）により形成した複合体と、（１１）又は（１２）に記載の内因性低分子化合物認識抗体とを接触させる工程、
（Ｃ）前記内因性低分子化合物認識抗体に結合した複合体の標識を測定する工程。
　本発明における特定の含硫黄アミノ酸誘導体により、内因性低分子化合物を高感度で特異的且つ簡便に測定する方法を提供できるようになった。
図１は、BSA又は各種ハプテンとBSAとの結合体におけるMALDI-TOF MSスペクトルを示す図である。１は非化学修飾BSA、２はマレイミド活性化BSA、３はマレイミド活性化BSAとFmoc-Cys[H]-Glyとの結合体のスペクトルをそれぞれ示す。 図２は、内因性低分子化合物を測定するELISAの一例を示す図である。１はマイクロプレート、２はプロテインA/G、３は抗ハプテン抗体、４はハプテン、５はビオチン、６はアビジン又はストレプトアビジン、７は西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）をそれぞれ示す。 図３は、抗Fmoc-Cys-Gly抗体の反応性を調べた結果を示す図である。Ａは、biotin-[Fmoc-Cys-Gly]標準液に対する反応性を示す用量作用曲線である。グラフの横軸は標準液の濃度を示し、縦軸は測定波長492nmにおける相対吸光度を示す。Ｂは、抗Fmoc-Cys-Gly抗体の各種アミノ酸の標準液に対する交差反応性を示すグラフである。グラフの横軸は各種アミノ酸標準液の濃度を示し、縦軸は測定波長492nmにおける相対吸光度を示す。 図４は、実試料におけるGly濃度の測定評価を行った結果を示す図である。Ａは、日本酒（四角）、FCS（三角）及びラット血漿サンプル（丸）におけるGly濃度を測定したグラフであり、横軸は図２に示した原理に基づくELISAにより測定されるGly濃度を示し、縦軸は高速液体クロマトグラフィー－質量分析計（LC-MS）により測定されるGly濃度を示す。両者の測定法により得られたGly濃度の近似曲線に基づくR２値は、0.9945であった。Ｂは、ラット血漿サンプルにおけるGly濃度を測定したグラフであり、横軸はＡと同様にELISAにより測定されるGly濃度を示し、縦軸はLC-MSにより測定されるGly濃度を示す。両測定法により得られた近似曲線に基づくR２値は、0.9642であった。 図５は、内因性低分子化合物を測定するELISAの別の一例を示す図である。１はマイクロプレート、２はアビジン又はストレプトアビジン、３はビオチン、４はハプテン、５は抗ハプテン抗体、６は抗ハプテン抗体を認識する抗体、７は標識化合物をそれぞれ示す。 図６は、実試料におけるPhe濃度の測定評価を行った結果を示す図である。ELISAにより測定されるPhe濃度を白い棒で、高速液体クロマトグラフィー－質量分析計（LC-MS）により測定されるPhe濃度を黒い棒でそれぞれ表す。縦軸はPhe濃度を表す。
＜１．含硫黄アミノ酸誘導体＞
　本発明は、新規化合物、特に内因性低分子化合物を測定するために利用され得る化合物として含硫黄アミノ酸誘導体を提供するものである。本発明の含硫黄アミノ酸誘導体は、硫黄原子を含有するアミノ酸を母体として、該母体の構造や性質を大幅に変えない程度に官能基の導入や原子の置き換え等の改変がなされた化合物であり、より詳細には、下記一般式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（式中、Ｘは免疫応答性疎水基、Ｙは内因性低分子化合物反応活性基又は内因性低分子化合物が結合した基、Ｚは水素原子、高分子量付与基又は標識化合物修飾基を表し、Ａは単結合又は炭素数１～６、好ましくは１～５、より好ましくは１～４、さらにより好ましくは１～３、最も好ましくは１又は２のアルキレン基である。）
で表される構造を有する化合物である。
　また、上記一般式（Ｉ）で表される構造は、下記一般式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（式中、Ｘは免疫応答性疎水基、Ｙ’は内因性低分子化合物が結合した基、Ｚ’は水素原子又は高分子量付与基であり、Ａは単結合又は炭素数１～６、好ましくは１～５、より好ましくは１～４、さらにより好ましくは１～３、最も好ましくは１又は２のアルキレン基である。）
で表される構造とすることもできる。
　上記一般式（ＩＩ）で表される構造を有する化合物は、Ｚ’が水素原子の場合、内因性低分子化合物を認識する抗体に結合するハプテン又は抗原として使用することができ、Ｚ’が高分子量付与基の場合、該抗体を作製するための抗原（免疫原）として使用することができる。
　さらに、上記一般式（Ｉ）で表される構造は、下記一般式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
（式中、Ｘは免疫応答性疎水基、Ｙ’’は内因性低分子化合物反応活性基、Ｚ’’は標識化合物修飾基であり、Ａは単結合又は炭素数１～６、好ましくは１～５、より好ましくは１～４、さらにより好ましくは１～３、最も好ましくは１又は２のアルキレン基である。）
で表される構造とすることもできる。
　上記一般式（ＩＩＩ）で表される構造を有する化合物は、測定対象とする内因性低分子化合物と結合体を構築することができ、さらに該内因性低分子化合物を検出することのできるシグナルプローブとして使用することができる。該化合物は、後述する内因性低分子化合物の測定方法に主に用いることができる。
　上記一般式（Ｉ）、一般式（ＩＩ）及び一般式（ＩＩＩ）で表される構造を有する本発明の含硫黄アミノ酸誘導体は、上述の通り、内因性低分子化合物の測定、特に免疫学的測定に用いる試薬として有用であり、本発明はこのような試薬もまた提供する。
　上記式（Ｉ）～（ＩＩＩ）の中には、不斉炭素による（Ｒ）－体及び（Ｓ）－体の光学異性体が存在しており、本発明の化合物には、考えられるすべての光学活性体及びその混合物（例えば、ラセミ体、エナンチオマー混合物、ジアステレオマー混合物等）が含まれる。
　上記式（Ｉ）～（ＩＩＩ）において、Ｘは免疫応答性疎水基であり、外因性化合物に由来する構造として免疫応答性を向上させることができる疎水基である。本明細書において、疎水基とは、極性が小さく、水分子との親和性が小さい基を意味し、具体的には、アルキル基等の炭化水素基である。本発明において、免疫応答性疎水基を導入する目的は３点ある。まず１点目は、本発明の含硫黄アミノ酸誘導体の分子量を増大させることである。ハプテンが単独のアミノ酸である場合、抗原決定基としての大きさが充分ではなく親和性の高い抗体作製が期待できないからである。本発明において増大される分子量としては、特に限定されないが、例えば７０以上であり、好ましくは１２０以上である。次に２点目は、抗原抗体反応の親和性を向上させることである。Ｘの部位に導入される免疫応答性疎水基が芳香環あるいはアルキル基等を有している場合、抗体がＸ部分を含めて認識したとき、疎水性相互作用効果により抗原抗体反応の親和性が増大され得る。そして３点目は、免疫応答を増大させることである。内因性化合物は元来生体内に存在している物質であるため、当該化合物に対する免疫応答性は一般に低い。これに対し、外因性化合物としての構造を有する免疫応答性疎水基を付加させると、免疫原性が高まり、免疫応答を促進して抗体産生能を向上させることができる。
　免疫応答性疎水基としては、本発明の含硫黄アミノ酸誘導体の分子量を増大させ、抗原抗体反応の親和性を向上させ、且つ本発明の含硫黄アミノ酸誘導体を抗原として投与された被験動物の免疫応答性を向上させるものであれば特に制限されないが、環状構造を有する基であることが好ましい。環状構造を有する基としては、炭化水素環含有基が挙げられる。炭化水素環含有基とは、炭素原子が環状に結合している構造を含有する基であって、該構造は単環系炭化水素であってもよく、また縮合多環炭化水素であってもよい。単環系炭化水素としては、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロブテン、シクロペンタ－２，４－ジエン等が、縮合多環炭化水素としてはペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ビフェニレン、フルオレン、アントラセン、テトラセン、トリフェニレン等が挙げられる。また、環状構造を有する基としては、ヘテロ原子を含むもの（複素環）であってもよい。複素環としては、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、イソオキサゾール、イソチアゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ピペリジン、モルホリン等の単環の複素環、イソベンゾフラン、１，３－ジヒドロイソベンゾフラン、フタラン、フタリド、フタリジル、ベンゾフラン、イソクロメン、イソクロメニリウム、２Ｈ－クロメン、９Ｈ－キサンテン、キサンチリウム、オキサトレン等の縮合複素環が挙げられる。当該環状構造を有する基は、芳香環あるいは炭素数１～１０のアルキル基等を含む基であることがより好ましい。芳香環としてはベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フラン、ベンゾフラン等が挙げられる。炭素数１～１０のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デカニル基等が挙げられる。上記アルキル基は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、好ましくは炭素数３～１０、より好ましくは炭素数５～１０のアルキル基である。本発明では、分子量を増大させ、抗原抗体反応の親和性を向上させ、且つ被験動物の免疫応答性を向上させるという観点から、免疫応答性疎水基は縮合環を有することが好ましい。免疫応答性疎水基としては、例えば、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）基、キノリニルアミノカルボニル基、4-N,N-dimethylaminosulfonyl-7-piperazino-2,1,3-benzoxadiazole（DBD-PZ基）、4-fluoro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole（NBD-F基）、5-N,N-dimethylaminonaphthalenesulfonyl chloride（DNS-Cl基)、o-phthalaldehyde（OPA基）及び4-phenylspiro[furan-2(3H),1'-phthalan]-3,3'-dione（fluorescamine基）、N,N,N-trimethylammonioanilyl N'-hydroxysuccinimidyl carbamate iodide（TAHS基）、フルオレセイン基、ダンシルクロライド基等を挙げることができる。これらのうち本発明では、Fmoc基、キノリニルアミノカルボニル基が好ましい。
　上記式（Ｉ）～（ＩＩＩ）におけるＹ、Ｙ’、Ｙ’’は内因性低分子化合物反応活性基（以下、「ｙ１基」と称する場合がある）又は内因性低分子化合物が結合した基（以下、「ｙ２基」と称する場合がある）であり、このうち内因性低分子化合物反応活性基（ｙ１基）は、測定対象である内因性低分子化合物と反応し得る活性基が導入される基を示す。特に限定されないが、ｙ１基が、例えばアルデヒド基、Ｎ－スクシンイミジル基、ハロゲン基（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ等）、イソチオシアネート基等を含有していれば、アミノ基反応活性基として、アミノ基を含有する内因性低分子化合物と容易に反応し、該内因性低分子化合物を本発明の含硫黄アミノ酸誘導体に結合させることができる。また、ｙ１基が、例えばアミノ基（－ＮＨ２）を含有していれば、カルボキシル基反応活性基として、カルボン酸（カルボキシル基）を含有する内因性低分子化合物と容易に反応し、該内因性低分子化合物を本発明の含硫黄アミノ酸誘導体に結合させることが可能となる。また、ｙ１基が、例えばマレイミド基を含有していれば、チオール基反応活性基として、チオール基を含有する内因性低分子化合物と容易に反応し、該内因性低分子化合物を本発明の含硫黄アミノ酸誘導体に結合させることができる。また、ｙ１基が、例えばヒドラジン基を含有していれば、糖構造含有内因性低分子化合物と容易に反応し、該内因性低分子化合物を本発明の含硫黄アミノ酸誘導体に結合させることができる。結果として、本発明の含硫黄アミノ酸誘導体におけるｙ１基の部位にはアミノ酸、ペプチド、有機酸、遊離脂肪酸、糖、糖リン酸、核酸等の多様な内因性低分子化合物の導入が可能となる。本発明におけるｙ２基とは、上記の通りｙ１基と内因性低分子化合物とが反応することによって形成された基を示し、測定対象とする内因性低分子化合物を化学構造として含有させたものである。これにより、該内因性低分子化合物に対する抗体の作製に利用することができる。
　上記式（Ｉ）～（ＩＩＩ）におけるＺ、Ｚ’、Ｚ’’は、水素原子、高分子量付与基又は標識化合物修飾基である。高分子量付与基は上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）の分子量を増加させるために導入される基であり、免疫対象の動物にとって免疫原性が低いものが好ましい。標識化合物修飾基は上記式（Ｉ）又は（ＩＩＩ）を標識するために導入される基である。Ｚ又はＺ’が水素原子である場合は、本発明の含硫黄アミノ酸誘導体自体がハプテンとなり得る。また、Ｚ又はＺ’が高分子量付与基である場合は、かかる含硫黄アミノ酸誘導体は抗体作製のための免疫原として使用することができる。調製した該免疫原をマウス、モルモット、ラット、ヤギ、サル、アカゲザル、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ネコ、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ラクダ等の動物に定期的に複数回投与することにより免疫応答が発生し、免疫原の立体構造上表面にある分子領域の一部、即ち、本発明の含硫黄アミノ酸誘導体における免疫応答性疎水基及び内因性低分子化合物の部分を認識する抗体を産生することができる。高分子量付与基として用いられる物質は、いわゆるキャリアタンパク質と呼ばれるものを用いることができ、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン（ＴＧ）、免疫グロブリン等を挙げることができる。これらの物質を用いた場合、本発明における高分子量付与基は「キャリアタンパク質結合基」とも言うことができる。また、高分子量付与基として合成高分子を用いることも可能であり、例えば、ポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類等の重合物又は共重合物等の各種ラテックス等が挙げられる。これらの物質を用いた場合、本発明における高分子量付与基は「合成高分子結合基」とも言うことができる。１つの高分子量付与基（Ｚ又はＺ’）には、下記一般式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
（式中、Ｘは免疫応答性疎水基、Ｙは内因性低分子化合物反応活性基又は内因性低分子化合物が結合した基、Ａは単結合又は炭素数１～６のアルキレン基である。）
で表される部分、又は下記一般式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
（式中、Ｘは免疫応答性疎水基、Ｙ’は内因性低分子化合物が結合した基、Ａは単結合又は炭素数１～６のアルキレン基である。）
で表される部分と結合し得る部位が１又は２以上存在する。２以上の上記部分と結合するような態様も本発明に包含される。
　また、高分子量付与基は上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）において、リンカーを介して硫黄原子に結合されていることが好ましい。リンカーを介して高分子量付与基を結合させることによって、高分子化合物と硫黄原子とを直接結合させた場合よりも抗原部分の表面提示能が高まり、より特異性の高い抗体を作製することができる。本発明におけるリンカーとしては、抗原提示能の向上に利用され得るものであれば特に限定されないが、例えば、アミノ基と硫黄原子を架橋するものが好ましい。例えば、マレイミドブチリルスクシンイミド（ＭＢＳ）、マレイミドカプロイルスクシンイミド（ＭＣＳ）、マレイミドウンデカノイルスクシンイミド（ＭＵＳ）、スルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン-１－カルボキシレート（ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ）等が知られる。
　一方、Ｚ又はＺ’’が標識化合物修飾基である場合は、本発明の含硫黄アミノ酸誘導体は内因性低分子化合物の存在を検出し得るシグナルプローブとして利用することができる。標識化合物修飾基は、上記式（Ｉ）又は（ＩＩＩ）において、上記高分子量付与基と同様にリンカーを介して結合されていてもよい。標識化合物修飾基とは、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等）、蛍光物質（フルオレスカミン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等）、放射性同位体（１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、３２Ｓ、１４Ｃ等）、安定同位体、色素、金属、コロイド、磁性物質等の標識化合物を上記式（Ｉ）又は（ＩＩＩ）に導入するための基である。また本発明では、標識化合物修飾基を直接導入する代わりにビオチン又はレクチン等を介して導入するようにしてもよい。ビオチンはアビジン又はストレプトアビジンと選択的に反応を起こす分子であるため、ビオチンを導入した場合、アビジン又はストレプトアビジンを事前に標識しておけばよい。レクチンの場合も選択的に反応する糖類を事前に標識することで同様な効果を得ることができる。
　上記式（Ｉ）～（ＩＩＩ）におけるＡは、単結合又は炭素数１～６のアルキレン基である。炭素数１～６のアルキレン基は、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１～６のアルキレン基であり、好ましくは炭素数１～５、より好ましくは１～４、さらにより好ましくは１～３、最も好ましくは１又は２のアルキレン基である。具体的にはメチレン、エチレン、トリメチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ペンチレン、ｎ－ヘキシレン等が挙げられる。
　本発明の測定対象となる内因性低分子化合物は、生体に由来する低分子化合物であって、通常、分子量が１０００以下の化合物を示す。なお、本発明でいう内因性低分子化合物とは、生体内に存在する低分子化合物であればよく、例えば合成法等で人工的に製造された低分子化合物であっても、その低分子化合物が生体内に存在しているものであれば、本発明における内因性低分子化合物に包含される。内因性低分子化合物としては、例えば、アミノ酸、有機酸、糖、糖リン酸、核酸、遊離脂肪酸、オリゴペプチド（ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド等）等が挙げられる。
　アミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、フェニルグリシン、フェニルアラニン、メチオニン、システイン、シスチン、ホモシステイン、ホモシスチン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、オルニチン、ハイドロキシリジン、アルギニン、ヒスチジン、1－メチルヒスチジン、３－メチルヒスチジン、プロリン、ヒドロキシプロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、シトルリン、β－アラニン、チロキシン、サルコシン、クレアチニン、γ－アミノ酪酸又はこれらの誘導体等が挙げられる。
　有機酸としては、例えば、乳酸、クエン酸、ｃｉｓ－アコニチン酸、イソクエン酸、２－オキソグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、マレイン酸、無水マレイン酸、又はこれらの誘導体等が挙げられる。
　糖としては、例えば、グルコース、スクロース、フルクトース、ラクトース、マルトース、トレハロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、ラフィノース、アカルボース等が挙げられる。
　糖リン酸としては、例えば、グルコース－１－リン酸、グルコース－６－リン酸、フルクトース－６－リン酸、１，３－ビスホスホグリセリン酸、フルクトース－１，６－ビスリン酸、グリセルアルデヒド－３－リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、３－ホスホグリセリン酸、２－ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸等が挙げられる。
　核酸としては、例えば、アデニン、アデノシン、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシアデノシン二リン酸、デオキシアデノシン三リン酸、グアニン、グアノシン、グアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、グアノシン三リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシグアノシン二リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、チミン、チミジン、５－メチルウリジン一リン酸、５－メチルウリジン二リン酸、５－メチルウリジン三リン酸、チミジン一リン酸、チミジン二リン酸、チミジン三リン酸、シトシン、シチジン、シチジン一リン酸、シチジン二リン酸、シチジン三リン酸、デオキシシチジン一リン酸、デオキシシチジン二リン酸、デオキシシチジン三リン酸、ウラシル、ウリジン、ウリジン一リン酸、ウリジン二リン酸、ウリジン三リン酸、デオキシウリジン一リン酸、デオキシウリジン二リン酸、デオキシウリジン三リン酸等が挙げられる。
　遊離脂肪酸としては、例えば、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレン酸、エレオステアリン酸、ツベルクロステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸、又はこれらの誘導体等が挙げられる。
　オリゴペプチドとしては、例えば、カルノシン（β-アラニル-L-ヒスチジン）、アンセリン（β-アラニル-N-メチルヒスチジン）、ホモアンセリン（N－(4-アミノブチリル)-L-ヒスチジン）等が挙げられる。
　これらの内因性低分子化合物のうち、動物の健康状態を簡便に把握し得る材料になるという観点からアミノ酸が好ましい。アミノ酸としては、中性アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸が挙げられるが、動物の健康指標になるという観点から中性アミノ酸が好ましく、分岐鎖アミノ酸（ロイシン、イソロイシン若しくはバリン）又は芳香族アミノ酸（フェニルアラニン又はチロシン）がより好ましく、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン又はチロシン）がさらに好ましい。なお、アミノ酸はＬ体、Ｄ体及びＤＬ体を包含するものであり、またアミノ酸の不斉中心はＲ配置、Ｓ配置又はＲＳ配置のいずれであってもよい。
　本発明の含硫黄アミノ酸誘導体の製造方法は、特に制限されず、出発物質ごとに製造方法が異なり得る。本発明の含硫黄アミノ酸誘導体の合成における基本化合物は、アミノ基、カルボキシル基、チオール基を有するものであれば特に限定されず、例えばシステイン又はシステインに類する化合物を用いることができる。出発物質としては、例えば、（Ａ）基本化合物のカルボキシル基に内因性低分子化合物が既に結合されているもの、（Ｂ）基本化合物のアミノ基に免疫応答性疎水基が既に結合されているもの、（Ｃ）基本化合物のアミノ基、カルボキシル基、チオール基のいずれも未修飾のもの、のいずれかとすることができる。
　（Ａ）を出発物質とした場合、例えば、アミノ基と容易に反応する反応活性基を有する炭酸９－フルオレニルメチルＮ－スクシンイミジルや６－アミノキノリル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート等の化合物（以下、免疫応答性疎水基含有化合物という）を、中性～塩基性（ｐＨ７～１１）の条件下、４～８０℃で混合し、１分間～２４時間反応させる。これにより、免疫応答性疎水基を出発物質に導入することができる。
　（Ｂ）を出発物質とした場合、例えば、該出発物質を水又は有機溶媒に溶解した後、検出対象の内因性低分子化合物を結合し得るＮ－ハイドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等を、非水溶媒下で混合し、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣ、ＤＩＰＣＤＩ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＤＭＴ－ＭＭ等の縮合剤存在下で、４～６０℃、３０～２４０分間の縮合反応を行う。これにより、出発物質のカルボキシル基に、内因性低分子化合物反応活性基（ｙ１基）としてＮ－スクシンイミジル基を導入することができる。その後、アミノ基を含む内因性低分子化合物を、中性～塩基性（ｐＨ７～１１）条件下、４～８０℃で混合し、１分間～２４時間反応させる。これにより、内因性低分子化合物が結合した基（ｙ２基）を出発物質のカルボキシル基に導入することができる。Ｎ－スクシンイミジル基以外として、アルデヒド基、ハロゲン基（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ等）、イソチオシアネート基等をｙ１基の部分に導入する場合は、例えば、アルデヒド基、ハロゲン基、イソチオシアネート基等を含む化合物を出発物質に反応させればよい。また、ｙ１基にアミノ基（－ＮＨ２）を導入する場合は、例えば、エチレンジアミンのようなアミノ基を２個保有する化合物を反応させて、２個のアミノ基のうち一方を出発物質のカルボキシル基に結合させればよい。そうすることにより、もう一方の遊離な状態にあるアミノ基がカルボン酸を含有する内因性低分子化合物と反応することとなる。また、例えば、アミノ基及びマレイミド基を保有する化合物を出発物質に反応させれば、ｙ１基はマレイミド基を含有するようになる。また、例えば、アミノ基及びヒドラジン基を保有する化合物を出発物質に反応させれば、ｙ１基はヒドラジン基を含有するようになる。上記の各種化合物と出発物質との反応は、上記Ｎ－ハイドロキシスクシンイミドの場合と同様な条件で行うことができる。そして、各種ｙ１基に対応した、アミノ基、カルボキシル基又はチオール基等を含有する内因性低分子化合物を上記と同様な条件で反応させることにより、出発物質に種々のｙ２基を導入することができる。
　（Ｃ）を出発物質とした場合、例えば、アミノ基と容易に反応する反応活性基を有する免疫応答性疎水基含有化合物を、中性～塩基性（ｐＨ７～１１）条件下、４～８０℃で混合し、１分間～２４時間反応させる。その後の反応は（Ｂ）を出発物質とした場合と同様である。
　（Ａ）～（Ｃ）の化学反応後の目的化合物はクロマトグラフィー等により分離及び分取して精製することができる。分取した溶液は凍結乾燥処理又はエバポレーション処理等により溶液を揮発した後、目的化合物を取得する。なお、目的化合物の取得に際しては、酸化反応が進行してジスルフィド結合の形成によりチオール基が消失してしまうことがあるため、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）等を用いて、室温下で３０～３６０分間の還元処理を行うことが好ましい。
　高分子量付与基又は標識化合物修飾基を付する場合は、例えば上記化合物を、ＥＤＴＡを含む中性～塩基性（ｐＨ７～１１）の緩衝液に再溶解した後、高分子化合物又は標識化合物（いずれも架橋剤により化学修飾されたものを含む）を含有する溶液を、４～６０℃で５～２４０分間反応させる。高分子化合物は、上記した高分子量付与基（キャリアタンパク質結合基、合成高分子結合基等）を提供し得る化合物であり、分子量１００００以上のタンパク質又はポリマーであることが好ましい。標識化合物は、上記した標識化合物修飾基を提供し得る化合物である。架橋剤は、チオール基及びアミノ基と結合し得る活性基を有するものが好ましい。当該反応が終了した後、限外ろ過法（分子量サイズ１００００カットオフ）又はゲルろ過クロマトグラフィー等により、チオール基に高分子量付与基又は標識化合物修飾基（架橋剤を介したものを含む）を結合した化合物を精製することができる。
＜２．内因性低分子化合物認識抗体の製造方法＞
　本発明はまた、高分子量付与基と内因性低分子化合物とを有する含硫黄アミノ酸誘導体を抗原とする、内因性低分子化合物認識抗体の製造方法を提供する。
（ａ）抗原の作製
　内因性低分子化合物を認識し得る抗体を作製するために、該抗体の抗原（免疫原）が作製される必要がある。該抗原としては、主に上記一般式（ＩＩ）で表される構造を有する化合物を用いることができ、上述の方法又は後述の実施例の通り製造することができる。
　該抗原を用いて得られる抗体は、測定対象の内因性低分子化合物を認識し得る抗体であれば特に制限されないが、特に該抗原の立体構造の表面分子の一部を認識するものが好ましく、本発明の含硫黄アミノ酸誘導体における免疫応答性疎水基及び内因性低分子化合物の部分を認識するものがより好ましい。また、得られた抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体の何れであってもよい。ポリクローナル抗体としては、目的とするハプテン部位を認識する抗体に加えて、ハプテン及びタンパク質のそれぞれ一部を認識する抗体のような様々な種類のものを用いることができる。また、モノクローナル抗体としては、ハプテンを認識する選択性、感度、再現性の点において良好なものを用いることができる。これらのモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、特に限定されないが、例えば以下のようにして製造することができる。
（ｂ）モノクローナル抗体の製造方法
　上記抗原を、動物に対して、それ自体又は希釈剤若しくはアジュバントとともに抗体産生が可能な部位に投与することができる。希釈剤としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝液等が用いられる。抗体産生能を高めるアジュバントとしては、フロイント完全アジュバントやフロイント不完全アジュバント等が用いられる。投与は通常１～６週毎に１回ずつ、計２～１０回行われる。用いられる動物としては、例えば、マウス、モルモット、ラット、ヤギ、サル、アカゲザル、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ネコ、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ラクダ等が挙げられ、本発明ではマウス及びラットが好ましい。
　例えば、抗原で免疫された動物、その中でも抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の２～５日後に脾臓又はリンパ節を採取し、それらに含まれる細胞を同種又は異種動物の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）と融合させることにより、ハイブリドーマを調製することができる。融合操作は、既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法［Nature, 256:495(1975)］に従って実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルス等が挙げられ、好ましくはＰＥＧが用いられる。
　骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ－１、Ｐ３、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ－１、ＭＰＣ－１１等が挙げられ、Ｐ３が好ましく用いられる。用いられる細胞（脾臓細胞）の数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は、１：１～２０：１であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００～ＰＥＧ６０００）が１０～８０％の濃度で添加され、２０～４０℃、好ましくは３０～３７℃で１～２０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
　ハイブリドーマの培養は、例えば、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行うことができる。培地としては、例えば、１～２０％、好ましくは１０～２０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地、１～１０％のウシ胎仔血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業社製）あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ－１０１、日水製薬社製）等を用いることができる。培養温度は、通常２０～４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日間～３週間、好ましくは１週間～２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行うことができる。
　モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、培養上清の抗体価を自体公知の方法で測定することによりスクリーニングすることができる。例えば、抗原又はハプテンを吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素等で標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）又は所定のタンパク質（プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＡ／Ｇ等）を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出又は定量する方法；抗免疫グロブリン抗体又はプロテインＡ等を吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素等で標識した抗原を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出又は定量する方法；等によりスクリーニングすることができる。
　モノクローナル抗体は、スクリーニングされたハイブリドーマの培養上清から取得することができる。また、該ハイブリドーマを用いて、動物の腹水からモノクローナル抗体を取得することもできる。例えばマウスを用いて、その腹水を取得する場合、通常、予めプリスタン（２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン）等の免疫抑制作用を有する物質を投与したマウス（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス等）の腹腔内へハイブリドーマ（例えば、１０６個以上）を移植し、約１～３週間後に貯留した腹水を採取すればよい。
　ハイブリドーマの培養上清又は腹水からのモノクローナル抗体の精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法（例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ等）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相、又はプロテインＡ、プロテインＧもしくはプロテインＬ等の活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法）に従って行うことができる。
　本発明におけるモノクローナル抗体の製造方法の好ましい態様としては、例えば、以下の工程を含む製造方法を挙げることができる。
［ａ］測定対象の内因性低分子化合物に対応する上記一般式（ＩＩ）の抗原を動物に免疫処理する工程、
［ｂ］測定対象の内因性低分子化合物に対応する上記一般式（ＩＩ）のハプテンをプレートに固相化し、抗体価評価用プレートを作製する工程、
［ｃ］工程［ａ］により免疫処理した動物から血清を採取し、該血清を上記抗体価評価用プレートに添加し、抗原抗体反応を測定する工程、
［ｄ］工程［ｃ］の反応結果が陽性である動物から細胞を採取し、該細胞とミエローマ細胞とを混合し、細胞融合させてハイブリドーマを作製する工程、
［ｅ］工程［ｄ］により得られたハイブリドーマのうち、上記一般式（ＩＩ）のハプテンを認識する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする工程、
［ｆ］工程［ｅ］により選別されたハイブリドーマをクローニングする工程。
　上記工程［ｅ］においては、工程［ｂ］により作製された抗体価評価用プレートを用いてスクリーニングを行うことができ、該スクリーニングにより抗体産生能の高いハイブリドーマを選別することができる。選別されたハイブリドーマを用いて、上記のとおりハイブリドーマの培養上清又は動物の腹水から所望のモノクローナル抗体を取得することができる。
　本発明においては、上記［ａ］～［ｆ］の工程に加え、さらに以下の工程を含むモノクローナル抗体の製造方法であることが好ましい。
［ｇ］得られた２種類以上のモノクローナル抗体に対し、非測定対象の内因性低分子化合物に対応する上記一般式（ＩＩ）のハプテンを反応させる工程、
［ｈ］工程［ｇ］の反応結果が陰性であるモノクローナル抗体を選別する工程。
　上記工程［ｇ］においては、非測定対象の内因性低分子化合物として、測定対象の内因性低分子化合物とは官能基や構造が相違する化合物を用いて、モノクローナル抗体の選別の程度を調整することができる。即ち、測定対象の内因性低分子化合物と官能基や構造が近似している化合物であるほど、より抗原認識特異性の高いモノクローナル抗体を選別することができる。例えば、測定対象の内因性低分子化合物がグリシンである場合は、非測定対象の内因性低分子化合物としてフェニルアラニンよりもアラニンを用いた方がより抗原認識特異性の高いモノクローナル抗体を選別することができる。本発明では、非測定対象の内因性低分子化合物を使い分けながら、より抗原認識特異性の高いモノクローナル抗体を入手することが好ましい。ただし、使用状況に応じて、抗原認識特異性が調整されたモノクローナル抗体を採用することもできる。
　本発明のモノクローナル抗体としては、例えば、測定対象がグリシンの場合は、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１９４７で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を用いることができる。また、例えば、測定対象がフェニルアラニンの場合は、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１９４８で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を用いることができる。また、これらのハイブリドーマはいずれも国際寄託へ移管申請されており、受領番号ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１３８４及び受領番号ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１３８５がそれぞれ付与されている。
（ｃ）ポリクローナル抗体の製造方法
　上記抗原に対するポリクローナル抗体は、当業者に公知の方法により製造することができ、例えば、上記のモノクローナル抗体の製造方法と同様に動物に免疫を行い、該免疫動物から所望の抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。本発明におけるポリクローナル抗体の製造方法は、特に限定されないが、より詳細には以下の通り説明することができる。
　免疫方法としては、動物に対して、抗体産生が可能な部位に抗原自体又は希釈剤若しくはアジュバントとともに投与される。希釈剤及びアジュバントは、上記（ｂ）モノクローナル抗体の製造方法で用いるものと同様なものが挙げられる。投与は、通常１～６週毎に１回ずつ、計３～１０回程度行われる。
　ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された動物の血液を採取して抗血清として得られる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定方法は、上記（ｂ）モノクローナル抗体の抗体価の測定方法と同様である。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
＜３．内因性低分子化合物の測定方法＞
　上記１に示した含硫黄アミノ酸誘導体及び上記２により得られた抗体を用いることにより、被験試料中の内因性低分子化合物を測定することができる。即ち、本発明は、以下の工程（Ａ）～（Ｃ）：
（Ａ）上記１の含硫黄アミノ酸誘導体と被験試料とを反応させ、該含硫黄アミノ酸誘導体と被験試料中に存在する内因性低分子化合物との複合体を形成させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）により得られた複合体と、上記２により得られた内因性低分子化合物認識抗体とを接触させる工程、
（Ｃ）前記内因性低分子化合物認識抗体に結合した複合体の標識を測定する工程、
を含む、内因性低分子化合物を測定し得る方法を提供することができる。
　内因性低分子化合物の測定を行うためには、その測定用試料として、標識化合物修飾基を有する本発明の含硫黄アミノ酸誘導体（主に、上記一般式（ＩＩＩ）で表される構造を有する化合物が用いられる）と、測定対象の内因性低分子化合物との複合体を調製する。該複合体は、該内因性低分子化合物を含む被験試料と本発明の含硫黄アミノ酸誘導体とを接触させることにより得ることができる。両者の接触は、内因性低分子化合物が本発明の含硫黄アミノ酸誘導体と複合体を形成し得る条件であれば特に制限されないが、１５～４０℃において１～１２０分間接触（反応）をさせておけばよい。その際に使用される溶液としては、例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられ、測定手段に応じて公知のものを用いることができる。また、本発明の含硫黄アミノ酸誘導体は内因性低分子化合物に比して過剰量としておけばよく、例えば濃度として１～１００μｍｏｌ／ｍＬの溶液を被験試料に加えればよい。なお、上記複合体には両者が結合していないものも含まれるが、実際には結合しているものが好ましい。
　本発明に用いられる被験試料は、内因性低分子化合物を含有しているか、あるいはその内因性低分子化合物の測定が求められるものであれば特に限定されないが、抗体作製が困難である生体内の低分子化合物を測定対象とするという観点から生体由来の試料であることが好ましい。生体由来の試料としては、動物由来の試料であっても植物由来の試料であってもよく、また動物及び／又は植物由来の試料の加工品（食品、飲料等）であってもよい。動物由来の試料の具体的な例としては、例えば、血液、血漿、血清、血管外液、間質液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、リンパ液、唾液、精液、涙、尿等を挙げることができる。これらのうち本発明においては、動物への侵襲が少ないという観点から、血液、血清、血漿、唾液、精液、涙、尿が好ましく、血液、血清、血漿がより好ましく、血漿又は血清がさらに好ましい。植物由来の試料としては、例えば、果汁、糖蜜等が挙げられる。
　本発明においては、標識化合物修飾基を有する本発明の含硫黄アミノ酸誘導体と内因性低分子化合物との複合体に対し、上記２により得られた抗体を用いることにより該内因性低分子化合物を測定することができる。該測定方法の実施態様は特に限定されないが、例えば、まず、上記の通り標識付与された測定用試料を準備する。次に、上記２により得られた抗体を担体上に固相化する。このとき、該抗体は上記複合体の構造の一部（免疫応答性疎水基及び内因性低分子化合物の部分）を認識することができる。そして、固相化した抗体で該複合体を捕捉する。最後に、捕捉された複合体に含まれる標識量を計測し、内因性低分子化合物の測定を行う。シグナルプローブとしては、上記の通り、酵素、放射性同位体、蛍光物質、色素、磁性素子等を採用することにより、測定対象物の量に応じてシグナルが検出される。本原理によれば、測定対象物が内因性低分子化合物であっても単一の抗体で非競合法のイムノアッセイを行うことが可能となり、競合法に比べて短時間での測定が可能となる。獲得した抗体を活用して内因性低分子化合物を測定する方法としては、感度、迅速性、正確性、安全性、自動化等の観点から、イムノアッセイの中でも、特にＥＬＩＳＡが好ましい。上記の内因性低分子化合物の測定方法は、より詳細には以下の通り説明することができる。
（ａ）抗体の固相化
　上記２により得られた内因性低分子化合物認識抗体を、担体に固相化する。使用する担体は、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリジビニルベンゼン、シリコン等の合成樹脂又はガラス等が挙げられ、具体的には、合成樹脂で成形された４８穴、９６穴、１９２穴、３８４穴等のマイクロタイタープレートが好ましい。抗体の固相化は、例えば、固相化用抗体を含む緩衝液を担体上に乗せ、インキュベーションすればよい。好ましくは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、又は当該抗体を獲得するために免疫した動物種由来の抗体を認識する抗体、例えば、当該抗体がマウスから得たものであれば、ウサギ又はヤギ由来の抗マウス抗体を事前に担体に吸着及びコーティングさせた後、当該抗体を添加すれば固相化効率が増大する。また、抗体はアミノ基を含む分子であるため、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド活性エステルが固相化されている担体を用いることで、抗体を直接担体に固相化することが可能になる。緩衝液中の抗体濃度は、通常０．０１μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬであり、緩衝液としては、測定手段に応じて公知のものを使用することができる。
　また、固相化に用いられる抗体は、上記２に示された方法により作製された抗体であれば如何なるものであってもよいが、本発明の含硫黄アミノ酸誘導体における免疫応答性疎水基及び内因性低分子化合物の構造部分を認識し得る抗体であることが好ましい。該抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、またＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメント、当該抗体の可変部だけを遺伝子発現させたポリペプチド（ｓｃＦｖ（シングル鎖可変部）又は超可変部（ＣＤＲ）等）のように抗原結合性を有する抗体の一部であってもよい。
（ｂ）ブロッキング
　担体の固相表面へのタンパク質の非特異的吸着を防止するため、固相化用抗体が吸着していない固相表面部分を、抗体とは無関係なタンパク質等によりブロッキングする。ブロッキング剤としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）もしくはスキムミルク溶液、又は市販のブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、Applie Block（生化学工業社製）、Ｎ１０１／Ｎ１０２（日本油脂社製）等を使用することができる。ブロッキングは、前記ブロッキング剤を担体に添加し、例えば、約４℃で１時間～一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、上記（ａ）と同じ緩衝液を使用することができる。
（ｃ）抗原抗体反応
　上記（ａ）及び（ｂ）で処理された固相表面に、標識化合物修飾基を有する本発明の含硫黄アミノ酸誘導体と内因性低分子化合物との複合体を含有する試料（測定用試料）を加え、担体に固相化された抗体と該複合体との抗原抗体反応を行う。また、測定用試料とは別に、標識化合物修飾基を有する本発明の含硫黄アミノ酸誘導体と内因性低分子化合物との複合体を標準試料として予め調製しておき、測定用試料と並行して各種濃度の標準試料を加え、同様に抗原抗体反応を行う。いずれも抗原抗体反応は、通常１０～４０℃、好ましくは２５～３７℃において、１分間～数時間で行うことができる。
（ｄ）Ｂ／Ｆ分離
　上記（ｃ）の抗原抗体反応を行った後、固相化抗体と結合した該複合体（Ｂ）及び該抗体に結合していない未反応の該複合体（Ｆ）を分離させる。分離自体は、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、上記（ａ）と同じ緩衝液を使用することができる。
（ｅ）内因性低分子化合物の測定
　上記（ｄ）の処理の後、固相化抗体に結合した該複合体が有する標識化合物の量を調べることにより、対象とする内因性低分子化合物を測定することができる。ここで、上記（ｃ）において並行して抗原抗体反応を行った各種濃度の標準試料を利用して、検量線を予め作成することができる。該検量線を用いることによって、被験試料に含まれる内因性低分子化合物の量を決定することができる。
　標識化合物として酵素を用いた場合は、該酵素と反応する発色基質溶液を加え、その後に所定の吸光度を測定することによって標識化合物の量を調べることができる。該酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン又はｏ－フェニレンジアミンを含む発色基質溶液を使用することができる。通常、発色基質溶液を加えて室温で５～３０分程度反応させた後、硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。また、ｏ－フェニレンジアミンを使用する場合は、４９２ｎｍの吸光度を測定する。なお、バックグラウンド値を補正するため、６３０ｎｍの吸光度も同時に測定することが望ましい。
　該酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ－ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、ＮａＯＨ溶液を加えて酵素反応を停止させ、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が挙げられる。また、該酵素としてβガラクトシダーゼを使用する場合には、例えば４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを基質として発色させ、０．１Ｍグリシン－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．３）溶液を加えて酵素反応を停止させ、励起波長３６０ｎｍ、検出波長４５０ｎｍでの蛍光検出強度を測定する方法があげられる。
　標識化合物として放射性物質を用いた場合であれば、オートラジオグラフィーやシンチレーション計測器等を用いて、その放射線量を測定することができる。また、標識化合物に代えてビオチン又はレクチン等の結合分子を用いた場合は、ビオチンであれば標識化アビジン又は標識化ストレプトアビジンと反応をさせて、レクチンであれば標識化糖類を反応させて、その後の標識化合物の量を上記と同様に調べることができる。なお、結合分子の反応は当業者に公知の方法により行うことができる。
　また、本発明において内因性低分子化合物を測定する別の実施態様としては、図５に示した構成を用いることもできる。ここでは、標識化合物修飾基を持たない上記１の含硫黄アミノ酸誘導体を用いて目的の内因性低分子化合物を測定することができる。具体的には、アビジン又はストレプトアビジン等が固相化されたプレートに、ビオチン等が付された含硫黄アミノ酸誘導体と内因性低分子化合物との複合体を含有する試料を加え、アビジン又ストレプトアビジンとビオチン等の結合分子とを介して、プレート上に該複合体を固相化させる。その後、該複合体を認識する抗体を添加して所定の条件下で抗原抗体反応を行い、さらに該抗体を認識する標識付与抗体（ＨＲＰ抗マウスＩｇＧ抗体等）を添加して、標識量の計測により目的の内因性低分子化合物を測定することができる。なお、上記の方法においては、各工程の間に洗浄液を用いて適宜洗浄を行うことができる。
　また、内因性低分子化合物を測定する更なる別の実施態様としては、例えば、次の方法が挙げられる。なお、本実施態様でも、標識化合物修飾基を持たずに代わりにビオチン等が付された本発明の含硫黄アミノ酸誘導体を用いて目的の内因性低分子化合物を測定することができる。具体的には、測定対象である内因性低分子化合物に本発明の含硫黄アミノ酸誘導体を結合させた後、上記２により得られた抗体を同一容器内で接触させて抗原抗体反応を成立させる。該反応により得られた抗原抗体複合体をプレート等の担体上に固相化させ、標識付与されたアビジン又はストレプトアビジンをその上に添加する。そうすると、固相化された抗原抗体複合体に含まれるビオチン等によりアビジン又はストレプトアビジンが捕捉されることになり、捕捉されたアビジン等に付されている標識の量を測定することにより、目的の内因性低分子化合物を測定することができる。上記の実施態様においても、各工程の間に洗浄液を用いて適宜洗浄を行うことができ、また固相化に際してブロッキングの処理も適宜行うことができる。
　以下に実施例を示し本発明の詳細な説明を行うが、本発明はこれにより限定されるものではなく、本技術分野において行われるこれらに対する通常の改変及び修飾を含むものとする。
［１．免疫原の調製］
　抗体作製用の抗原（免疫原）は、合成したハプテンに架橋剤を介してキャリアタンパク質を結合したものを使用した。一般式（Ｉ）のＸ部分に導入した免疫応答性疎水基は、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）基又はキノリニルアミノカルボニル基、Ｙ部分に導入した測定対象抗原（内因性低分子化合物）はグリシン（Gly）、フェニルアラニン（Phe）又はイソロイシン（Ile）、Ｚ部分に導入した高分子化合物であるキャリアタンパク質はウシ血清アルブミン（BSA）を採用し、架橋剤としてスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（sulfo-SMCC）を適用した。
１－１．ハプテン合成法１：Fmoc-Cys[H]-Gly
　出発物質(Cys-Gly)2（BACHEM社製）を20mmol/Lとなるようにジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した。この溶液を50%アセトニトリル溶液で10倍希釈し、2mmol/L (Cys-Phe)2溶液を5mL調製した。また、9-Fluorenylmethyl Succinimidyl Carbonate（Fmoc-OSu）（和光純薬社製）を0.25mol/Lとなるようにアセトニトリルに溶解した。
　2mmol/L (Cys-Gly)2溶液5mLと0.25mol/L Fmoc-OSu溶液0.5mLを混合し、55℃で30分間放置した。次いで、還元剤として（±）ジチオスレイトール（DTT）（和光純薬社製）を3mol/Lとなるようにイオン交換水に溶解し、3mol/L DTT溶液1mLを上記反応溶液中に添加した。該反応溶液を55℃で2時間以上放置した後、HPLCにより目的化合物Fmoc-Cys[H]-Glyを分離及び分取した。
　HPLC装置は島津製作所製CLASS-VPシリーズ、カラムは逆相系カラムであるCadenza（内径4.6mm x 長さ250mm、インタクト社製)を使用し、分析条件は、移動相A：水／アセトニトリル（95/5）に0.1%ギ酸を加えたもの、移動相B：水／アセトニトリル（10/90）に0.1%ギ酸を加えたもの、流速：1mL/min、カラムオーブン：40℃、UV検出波長：265nm、溶出条件：移動相B 45%一定（測定開始時間0-10分）、移動相B 45-100%（10-30分）、とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　Fmoc-Cys[H]-Glyを含む反応溶液をHPLCに導入し、クロマトグラムをモニタリングしながら、Fmoc-Cys[H]-Glyに由来するピークを回収した。サンプル注入量は1回あたり400μLとしたため、上述の反応溶液（計6.5mL）について回収作業を繰り返した。回収した画分は同一容器に集めて液体窒素下において凍結し、凍結乾燥機により乾燥した。凍結乾燥によって得られた粉末を秤量した結果、4.79mg（収率49%）であった。凍結乾燥した化合物は一部を再溶解し、残りは必要時まで-20℃で保存した。再溶解した化合物を質量分析計により質量測定を実施した結果、Fmoc-Cys[H]-Glyに相当する質量が得られ、合成したハプテンが目的化合物であることが示された。
１－２．ハプテン合成法２：Fmoc-Cys[H]-Phe
　出発物質(Cys-Phe)2（BACHEM社製）を20mmol/Lとなるようにジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した。溶解以降の操作、Fmoc-OSu試薬との反応、DTTによる還元処理条件及び目的化合物Fmoc-Cys[H]-PheのHPLC分離条件は上述のFmoc-Cys[H]-Glyと同じ条件で実施した。目的化合物Fmoc-Cys[H]-Pheを回収し、凍結乾燥により必要時まで-20℃で保存した。再溶解した化合物を質量分析計により質量測定を実施した結果、Fmoc-Cys[H]-Pheに相当する質量が得られ、合成したハプテンが目的化合物であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
１－３．ハプテン合成法３：Fmoc-Cys[H]-Ile
　出発物質(Fmoc-Cys)2（BACHEM社製）を200mmol/LとなるようにDMSOに溶解した。また、縮合剤N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC、東京化成社製）を500mmol/LとなるようにDMSOに溶解した。さらにN-ハイドロキシスクシンイミド（NHS、東京化成社製）を500mmol/LとなるようにDMSOに溶解した。3種の溶液について各1mLずつ混合し（計3mL）、室温振盪下で120分間反応させた。反応中は時間経過とともに反応物の一部が析出した。また、Ileを200mmol/Lとなるように0.1N 塩酸／ホウ酸緩衝液（pH11.0）（50/50）混合液に溶解した。反応終了後にDMSO 1mLを加え、Ile溶液1mLを少量ずつ添加した。反応溶液を室温下で15分放置した後、5%酢酸を0.5mL添加した。析出した化合物は0.45μmフィルターにより限外ろ過し、ろ過液をHPLCに導入して(Fmoc-Cys-Ile)2を分離及び分取した。HPLC装置は島津製作所製CLASS-VPシリーズ、カラムは逆相系カラムであるCadenza（内径4.6mm x 長さ250mm、インタクト社製）を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　HPLC装置及び分離用カラムは上記と同様のものを使用し、Fmoc-Cys[H]-Ileの分析条件は、移動相A：水／アセトニトリル（95/5）に0.1%ギ酸を加えたもの、移動相B：水／アセトニトリル（10/90）に0.1%ギ酸を加えたもの、流速：0.9-1.0mL/min（測定開始0-5分）、1.0-1.0mL/min（5-25分）、カラムオーブン：40℃、UV検出波長：265nm、送液条件：移動相B 72%一定、とした。
　(Fmoc-Cys-Ile)2を含む反応溶液をHPLCに導入することにより得られたクロマトグラムを調べたところ、試料導入点から12～14分付近に観測されたピークが(Fmoc-Cys-Ile／Fmoc-Cys-OH)に由来し、27分付近に観測されたピークが(Fmoc-Cys-Ile)2に由来するものであった。クロマトグラムをモニタリングしながら、溶出される両画分をそれぞれ回収した。サンプル注入量は1回あたり400μLとしたため、上述の反応溶液（計5.5mL）について回収作業を繰り返した。回収した画分は同一容器に集めて液体窒素下において凍結し、凍結乾燥機により乾燥した。凍結乾燥によって得られた粉末を秤量した結果、15.5mg（収率13%）であった。凍結乾燥した化合物をDMSO 1mLにより再溶解し、3mol/L DTT溶液1.8mLを少量ずつ添加した。添加終了後、40℃で1時間以上放置し、HPLCにより目的化合物Fmoc-Cys[H]-Ileを分離及び分取した。
　HPLC装置は島津製作所製CLASS-VPシリーズ、カラムはCadenza（内径4.6mm x 長さ75mm、インタクト社製）を使用し、分析条件は、移動相A：水／アセトニトリル（95/5）に0.1%ギ酸を加えたもの、移動相B：水／アセトニトリル（10/90）に0.1%ギ酸を加えたもの、流速：1mL/min、カラムオーブン：40℃、UV検出波長：265nm、送液条件：移動相B 40-100%（0-30分）、とした。
　Fmoc-Cys[H]-Ileを含む反応溶液をHPLCに導入することにより得られたクロマトグラムを調べたところ、試料導入点から10.5分付近に観測されたピークがFmoc-Cys[H]-Ileに由来するものであった。クロマトグラムをモニタリングしながら、溶出されるこの画分を回収した。サンプル注入量は1回あたり400μLとしたため、上述の反応溶液（計2.6mL）について回収作業を繰り返した。回収した画分は同一容器に集めて液体窒素下において凍結し、凍結乾燥機により乾燥した。凍結乾燥によって得られた粉末を秤量した結果、1.8mg（収率24%）であった。
１－４．ハプテン合成法４：AQC-Cys[H]-Phe
　出発物質(Cys-Phe)2（BACHEM社製）を10mmol/Lとなるように0.1M塩酸に溶解した。また、AccQ・Tag Ultra Derivatization Kit（ウォーターズ社製）のAccQ・Ultra Derivatization Reagentをアセトニトリルによって100mmol/Lに調製した（AQC試薬）。調製した(Cys-Phe)2溶液500μL、AQC試薬1000μL、0.1mol/Lのホウ酸緩衝液1000μLを混合し、55℃で20分間加熱した。次いで、2mol/L DTT水溶液を250μL加えて40℃で2時間反応した。その後、0.2%の酢酸を2.25mL加えて反応を停止させ、HPLCにより目的化合物AQC-Cys[H]-Pheを分離及び分取した。なお、本ハプテンはキノリニルアミノカルボニル基が付与されているが、AQCに由来する基であるため上記名称を用いた。
　HPLC装置は島津製作所製CLASS-VPシリーズ、分離用カラムは逆相系カラムであるCadenza（内径4.6mm x 長さ250mm、インタクト社製）を使用し、AQC-Cys[H]-Pheの分析条件は、移動相A：水／アセトニトリル（95/5）に0.1%ギ酸を加えたもの、移動相B：水／アセトニトリル（10/90）に0.1%ギ酸を加えたもの、流速：1mL/min、カラムオーブン：40℃、UV検出波長：265nm、送液条件：移動相B 15-60%（0-10分）、とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
１－５．ハプテン合成法５：Cys[H]-Phe
　出発物質(Cys-Phe)2（BACHEM社製）を10mmol/Lとなるように0.1M塩酸に溶解した。次いで、2mol/L DTT水溶液を250μL加えて40℃で2時間反応した。その後、HPLCにより目的化合物Cys[H]-Pheを分離及び分取した。
１－６．ハプテンとキャリアタンパク質の結合
　合成したハプテンFmoc-Cys[H]-Gly、Fmoc-Cys[H]-Phe、Fmoc-Cys[H]-Ile、AQC-Cys[H]-Phe及びCys[H]-PheとBSAをそれぞれ結合させるため、Imject（登録商標） Maleimide Activated BSA（ピアス社製）を用いた。このマレイミド活性化BSAは既にBSAの表面上のLys残基由来のアミノ（ε－NH2）基を介して架橋剤Sulfo-SMCC－マレイミド基が導入されたBSAである。2mgのマレイミド活性化BSAを50mM リン酸緩衝液（pH7.3）（0.1M エチレンジアミン-N,N,N’,N’-テトラ酢酸4ナトリウム塩4水和物を含む）（同仁化学社製）1mLに加えて溶解した。合成した0.5mgの各種ハプテンを200μLのジメチルスルホキシドに溶解し、マレイミド活性化BSA溶液にゆっくりと滴下した。滴下後は室温下で2時間静置した。反応終了後、Amicon（登録商標） Ultra-4 (分子量10,000 Da cut-off、ミリポア社製)を用いて遠心による限外ろ過を行った。遠心処理後、50mM リン酸緩衝液（pH7.3）を6～7回程度繰り返し継ぎ足し、過剰のEDTAをできる限り除去した。その後、Bradford法によるタンパク質定量を行い、各ハプテン－BSA結合体の濃度を求めたところ、0.50-0.92mg/mLであった。
　1分子のマレイミド活性化BSAに結合したハプテンの量を確認するためにハプテン－BSA結合体を質量分析計マトリックス支援レーザー脱離イオン化法－飛行時間型質量分析計（MALDI-TOF MS）により測定した。図１は、非化学修飾BSA、マレイミド活性化BSA及びFmoc-Cys[H]-Gly/BSA結合体のMALDI-TOF MSスペクトルを示す。非化学修飾BSAとマレイミド活性化BSAの質量差は8186であった。ひとつのマレイミド活性基がBSA分子に導入されると220の分子量が増大することから、マレイミド活性化BSAは1分子あたり平均37残基のマレイミド基が導入されたものであることがわかった。また、マレイミド活性化BSAに各ハプテンを結合させた試料からは更に分子量が増加したピークが観測された。Fmoc-Cys[H]-Gly/BSA結合体については、マレイミド活性化BSAとの質量差は10248であった。Fmoc-Cys[H]-Glyは分子量386であることから、1分子のマレイミド活性化BSAにつき平均26残基のFmoc-Cys[H]-Glyが導入されていることがわかった。また、Fmoc-Cys[H]-Phe、Fmoc-Cys[H]-Ile、AQC-Cys[H]-Phe、及びCys[H]-Pheをマレイミド活性化BSAと反応させた場合も同様に質量増大が観測され、1分子のマレイミド活性化BSAにつき10残基以上のハプテンがそれぞれ導入されたことがわかった。
［２．抗体の作製］
２－１．免疫作業から抗血清評価まで
　免疫処理を行う前に、BALB/cマウス（メス4週齢）を1週間予備飼育しておいた。調製したFmoc-Cys[H]-Gly/BSA結合体溶液（50μg/100μL/匹）をフロイント完全アジュバント（DIFCO社製）と等量混合し、エマルジョンを形成させた。この懸濁液を、毛刈りしたマウスの背中に数箇所皮下投与し、これを初回免疫とした。その2週間後に2回目の免疫処理として、フロイント完全アジュバントに代えてフロイント不完全アジュバント（DIFCO社製）を用いて同様な操作を行った。さらに2週間後に3回目の免疫処理として、2回目の免疫処理と同様な操作を行った。3回目の免疫処理から1週間後、マウス部分採血を行い、酵素免疫測定法（ELISA）により抗体価を測定して該マウスが抗体産生を行っていることを確認した上で、その翌日に、2回目の免疫処理と同様な方法で最終の免疫処理を行った。最終の免疫処理から3日後、該マウスより脾臓を無菌的に摘出し、脾臓細胞を調製し、該脾臓細胞を細胞融合に供した。なお、他のハプテン－BSA結合体についても同様な処理を行った。
２－２．抗体価評価用プレート作製
　Reacti-Bind（商標） Maleimide Activated Plates（ピアス社製）の96ウェルマイクロプレート上にFmoc-Cys[H]-Glyを固相化した。Fmoc-Cys[H]-Glyは50mMリン酸緩衝液（10mM EDTAを含む）を用いて2μg/mLに調製し、該溶液を上記プレートの各ウェルに100μLずつ添加し、4℃で終夜放置した。次いで、PBS（0.05% Tween20を含む）によりウェル内を3回洗浄した。洗浄後、10μg/mLシステイン溶液を各ウェルに200μLずつ加えて、室温にて1時間放置し、プレート上の未反応マレイミド基のクエンチング処理を行った。続けて、PBS（0.05% Tween20を含む）によりウェル内を3回洗浄して、Fmoc-Cys[H]-Gly固相化プレートを作製した。該プレートは4℃にて必要時まで保管した。なお、他のハプテンについても同様な処理を行い、抗体価評価用プレートを作製した。
２－３．抗体価評価
　免疫処理したマウスから部分採血した血液を室温にて1時間以上放置した後、パスツールピペット等で凝固した血液をほぐし、遠心処理（3000rpm、15分間）をして血清を得た。得られた血清は、0.1%ゼラチン（ナカライテスク社製）を含むPBS緩衝液により段階希釈した（103～106倍希釈）。段階希釈した血清を上記抗体価評価用プレートの所定のウェルに100μLずつ添加し、室温下で1時間放置した。次いでPBS（0.05% Tween20を含む）によりウェル内を3回洗浄した後、Peroxidase Conjugated Affinity Purified Anti-Mouse IgG Fc specific antibody(Goat)（Jackson Immuno Research社製）を添加し、室温下で1時間放置した。その後、PBS（0.05% Tween20を含む）によりウェル内を3回洗浄した。抗原抗体反応は、OPD溶液（0.04%[w/v]オルトフェニレンジアミンを含む20mMクエン酸緩衝液（pH5.0）に0.018%[v/v]の過酸化水素液を反応直前に加えたもの）又はTMB one solution（プロメガ社製）を用いて確認した。各種溶液を各ウェルに100μLずつ添加して発色反応を10分間行い、1N硫酸溶液により発色反応を停止した。発色反応停止後、OPD発色では波長492nm、TMB発色では波長450nmによる吸光度をマイクロプレートリーダーSpectraMax M2e（モレキュラーデバイス社製）を用いて測定した。
２－４．細胞融合
　上記の通り、マウスから無菌的に摘出した脾臓を、セルストレイナー（ファルコン社製）によりMEM-α培地（Gibco社製）内でほぐした。マウスミエローマ細胞株P3-Ag-X3細胞は事前に充分量を培養しておき、回収したのち、細胞数をカウントした。脾臓1個あたりに含まれる細胞数を1x108個として、細胞数が脾細胞：ミエローマ細胞＝5：1となるように両者を混合した。遠心分離により培養上清を除去し、細胞ペレットをほぐした。細胞ペレットの容器は37℃水浴下に浸し容器を回転させながら、PEG1500（ロシュダイアグノスティックス社製）溶液1mLを1分間かけて少しずつ加えて細胞融合を開始した。PEG溶液添加1分後からの1分間は激しくピペッティングした。次いで、それから4分間、MEM-α培地を合計4mL添加した。さらにそれから2分間、MEM-α培地を10mL添加した。室温下で5分間放置した後、遠心分離により上清を除去した融合細胞をHAT培地（0.01mMヒポキサンチン、0.04μMアミノプテリン、1.6μMチミジンを含むMEM-α培地に10% FCS液を加えたもの）160mLにより懸濁した。最後に、この懸濁液を96ウェルマイクロプレートの各ウェルに200μLずつまきこみ、5% CO2下37℃で培養した。以降3日毎に各ウェルの培地を半分量除去し、新たにHAT培地を半分量加えた。細胞融合後10日目以降、HT培地（0.01mMヒポキサンチン、1.6μMチミジンを含むMEM-α培地に10% FCS液を加えたもの）によってHAT培地と同様な培地交換を行った。
２－５．スクリーニング
　細胞融合後、成育したハイブリドーマから目的抗体が分泌されているかどうかを判断するためにスクリーニングを行った。細胞融合後10日目乃至16日目の培養上清を各ウェルから50μLずつ採取した後、該上清を上記抗体価評価用プレートに添加し、1時間放置した。PBS（0.05% Tween20を含む）によりウェル内を3回洗浄後、Peroxidase Conjugated Affinity Purified Anti-Mouse IgG Fc specific antibody(Goat)（Jackson Immuno Research社製）を添加し、室温下で1時間放置した。その後、PBS（0.05% Tween20を含む）によりウェル内を3回洗浄した。抗原抗体反応はOPD溶液（0.04%[w/v]オルトフェニレンジアミンを含む20mMクエン酸緩衝液（pH5.0）に0.018%[v/v]の過酸化水素液を反応直前に加えたもの）を各ウェルに100μLずつ添加して吸光度測定（測定波長492nm）を行った。吸光度0.5以上を示したウェルを陽性ウェルと判定し、陽性ウェル内の細胞培養液を別の96ウェルマイクロプレートに移して培養を継続した。1次スクリーニングで陽性と判定されたウェルは疑陽性も含まれるため、1週間培養継続後、同様な操作で培養上清を2次スクリーニングに供して、吸光度3.0以上を示したウェルを陽性ウェルとした。
２－６．クローニング
　細胞のモノクローン化は以下の限界希釈法により行った。2次スクリーニング後、陽性判定されたウェル内の細胞懸濁液を、10%[v/v]のBM condemned H1（Roche社製）を含む完全培地（BM培地）により100倍、1000倍、10000倍と段階希釈した。それぞれの希釈率で希釈した細胞懸濁液は32ウェルずつ1枚の96ウェルマイクロプレートに添加し、培養を継続した。培養は6日ごとにBM培地で半量を交換した。培養開始から10～15日後、顕微鏡によるコロニー観察を行った。1ウェル内に単コロニーが観察されたウェルの上清サンプルについて、抗体活性の有無を調べた。モノクローン化されたハイブリドーマを含む培養上清が陽性判定を示した後、再び限界希釈法によりクローニングした（リクローニング）。リクローニング後、同様に顕微鏡により単コロニーが観測されたウェルを限定し、培養上清が陽性判定を示すことを確認して、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。なお、得られたハイブリドーマは、2010年4月1日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1-1-1つくばセンター中央第6）に寄託しており、Fmoc-Cys-Glyに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマには受託番号FERM P-21947が付与され、Fmoc-Cys-Pheに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマには受託番号FERM P-21948が付与されている。また、これらのハイブリドーマはいずれも同センターにおいて国際寄託へ移管申請されており、Fmoc-Cys-Glyに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマには受領番号FERM ABP-11384が付与され、Fmoc-Cys-Pheに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマには受領番号FERM ABP-11385が付与されている（受領書の通知年月日：2011年5月16日）。
２－７．各種免疫原に対するモノクローナル抗体の獲得性
　以下の表１は免疫原ごとのモノクローナル抗体作製工程での陽性ウェル数又はハイブリドーマ株数を示した結果である。これより、Fmoc-Cys-Gly、Fmoc-Cys-Phe、Fmoc-Cys-Ile及びAQC-Cys-Pheについては最終的にモノクローナル抗体産生細胞株が5乃至10株樹立できた。一方、Cys-Pheを免疫原としたデザインでは1次スクリーニングの段階で陽性と判定されたウェル数が少なく、抗体作製工程を進めていくにつれ、細胞がドロップアウトしてしまった。この結果より、Cysのアミノ基部分にFmocやAQC構造をもった生体内に存在しない構造が導入されることで、免疫応答が高まり、抗体が得られやすくなったと考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
２－８．モノクローナル抗体の大量化及び精製
　培養上清由来の抗体量では充分な評価を行うことができないため、腹水による抗体の大量生成を行った。樹立したハイブリドーマ株を完全培地で培養し、MEM-α培地で1x107個/mLの濃度に懸濁した。該懸濁液を、7日前に予めプリスタン投与したBALB/cマウスの腹腔内に投与した（0.5mL/匹）。7～14日後、該マウスより腹水を採取し、遠心分離により細胞を除去した。
　得られた腹水はProtein Gカラム（GEヘルスケア社製）により精製した。Protein Gカラムは20mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化した後、該腹水を20mMリン酸緩衝液（pH7.0）を用いて10倍希釈後、Protein Gカラムに添加し、腹水中の抗体成分（免疫グロブリンG）を吸着させた。20mMリン酸緩衝液（pH7.0）溶液によりカラム内に残存している夾雑成分を洗浄除去後、グリシン緩衝液で抗体成分を溶出した。溶出した抗体成分は、1Mトリス緩衝液（pH9.0）により直ちに溶出液を中和した。精製した抗体溶液は必要時まで-20℃で凍結保存した。
［３．誘導体化試薬の調製］
３－１．誘導体化試薬の調製：biotin-[Fmoc-Cys]
　(Fmoc-Cys)2（BACHEM社製)を20μMとなるようにアセトニトリルに溶解した後、3mol/Lジチオスレイトールを添加し、40℃で1時間放置した。HPLC装置によりFmoc-Cys[H]画分を分取し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、該画分を50mMリン酸緩衝液（pH6.0）に溶解させ、Fmoc-Cys[H]溶液とした。Maleimide-PEG2-Biotin（PIERCE社製）を0.1% EDTA含有50mMリン酸緩衝液（pH7.3）に溶解し、Fmoc-Cys[H]溶液と混合し、室温下で2時間放置した。反応液をHPLCに導入し、biotin-[Fmoc-Cys]画分を分取後、凍結乾燥した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
３－２．誘導体化試薬の調製：biotin-[Fmoc-Cys-NHS]
　N,N-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）及びN-ハイドロキシスクシニルイミド（NHS）を0.1mol/Lとなるようにアセトニトリルにそれぞれ溶解させた。また上述で調製したbiotin-[Fmoc-Cys]凍結乾燥品を1μg秤量し、56μLのアセトニトリルに溶解させ、この溶液に0.1mol/L DCC液12μL及び0.1mol/L NHS液12μLを加えて室温下で2時間放置した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
３－３．誘導体化反応：biotin-[Fmoc-Cys-NHS]によるアミノ酸誘導体化
　調製したbiotin-[Fmoc-Cys-NHS]にアミノ酸溶液及び0.1Mホウ酸緩衝液（pH9.0）を添加し、室温下で15分間放置した。その後、0.2%酢酸を添加し、誘導体化反応を停止した。本反応液は測定時まで4℃で保存した。
［４．抗体評価：ELISA］
　ELISAによる測定原理を図２に示す。Fmoc-Cys-Glyを認識する抗体の溶液は、0.9%塩化ナトリウムを含む50mM リン酸緩衝液（pH7.3）（PBS）により0.1μg/mLに希釈した。この溶液をReacti-Bind（商標） Protein A/G Coated Plate（サーモサイエンティフィック社製）の各ウェルに100μLずつ添加し、室温下で2時間放置した。次いで0.05% Tween20含有リン酸緩衝液（PBST）でウェル内を3回洗浄した。biotin-[Fmoc-Cys-Gly]化合物を0.1%ゼラチン含有PBS液（GPB）により段階的に希釈し、該希釈液を各ウェルに100μLずつ添加し、抗原抗体反応を行った。室温下で60分間放置した後、PBST液によりウェル内を3回洗浄した。洗浄後、1μg/mL HRP標識ストレプトアビジン結合体溶液を各ウェルに100μLずつ添加し、室温下で60分放置した。さらに、PBSTによりウェル内を3回洗浄した後、OPD溶液（25mMクエン酸／50mMリン酸水素二ナトリウム（pH5.0）溶液10mLにオルトフェニレンジアミン4mg及び過酸化水素6μLを添加したもの）をHRP基質溶液として各ウェルに100μLずつ加えて呈色反応を行った。反応開始から10分後、1M 硫酸を反応停止液として各ウェルに100μLずつ添加し、各ウェルの吸光度を測定波長492nmで測定した。
　上記の通り得られた抗Fmoc-Cys-Gly抗体について、図２のELISA原理の成立可否を抗原標準液であるbiotin-[Fmoc-Cys-Gly]標準液を用いて確認した。その結果、抗原標準液の濃度に応じて吸光度も増大する用量作用曲線が得られた（図３Ａ）。これにより、抗Fmoc-Cys-Gly抗体によるELISA原理は成立していることが確認できた。
　ついで、抗Fmoc-Cys-Gly抗体の特異性を評価するためにGly以外の各アミノ酸に対する応答性を評価した。各アミノ酸は、グリシン、サルコシン、アラニン、βアラニン、γ-アミノ酪酸（GABA）、セリン、プロリン、バリン、タウリン、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アルギニン、トリプトファンを適用した。アミノ酸誘導体化試薬であるbiotin-[Fmoc-Cys-NHS]と1～1000μmol/Lの各アミノ酸を室温下で15分間反応させた後、0.2%酢酸を加えて反応を停止した。誘導体化反応液は0.1%ゼラチンを含むPBS溶液で1000倍希釈して、ELISA測定用サンプルとした。ELISA測定用プレート、としてProtein A/G Coated plate（サーモサイエンティフィック社製）を使用し、抗Fmoc-Cys-Gly抗体溶液（濃度0.1μg/mL）を各ウェルに100μLずつ添加した。室温で2時間静置して抗体の固相化を行った。次いで、PBSTにより各ウェル内を3回洗浄し、ELISA測定用サンプルを各ウェルに100μLずつ添加し、室温で1時間静置した。次いで、各ウェルを洗浄し、1μg/mLのストレプトアビジン－HRP結合体（Jackson Immuno Research社製）溶液（5%[v/v] Applie Block（生化学工業社製）を含むGPB溶液により1000倍希釈したもの）を各ウェルに100μLずつ添加し、室温で1時間静置した。その後、各ウェルを洗浄し、OPD溶液により呈色反応を行った。
　各アミノ酸の濃度に対応する吸光度をプロットしたものを図３Ｂに示す。これにより、抗Fmoc-Cys-Gly抗体はGlyに対してのみ選択的に応答し、その他のアミノ酸に対して応答性がほとんどないことが示された。
　同様に作製した抗Fmoc-Cys-Phe抗体及び抗Fmoc-Cys-Ile抗体についてもPhe及びIle以外のアミノ酸に対する交差反応性を調べた。その結果、抗Fmoc-Cys-Phe抗体では、交差反応性としてPheに対する応答性を100%としたときの他のアミノ酸の割合を求めたところ、Tyrが11%、Leuが10%であり、その他のアミノ酸は0.1%以下であった。また抗Fmoc-Cys-Ile抗体では、Ileに対する応答性を100%としたとき、Leuが16%、Pheが13%であり、その他のアミノ酸は1%以下であった。これらの結果により、抗Fmoc-Cys-Phe抗体及び抗Fmoc-Cys-Ile抗体も測定対象を選択的に検出するツールとして活用することができる抗体であることが示された。
［５．実試料を用いたアミノ酸の定量］
５－１．グリシン（Gly）の定量
　実試料として日本酒（益荒男、鹿野酒造社製）、ウシ胎児血清（FCS）（Fetal Bovine Serum、インビトロジェン社製）及びラット血漿サンプル（SD系、メス、20週齢、日本チャールズリバー社製）を用いて、抗Fmoc-Cys-Gly抗体及びアミノ酸誘導体化試薬による試料中のGly測定評価を行った。その評価は、図２の原理に基づいたELISAによって算出されたGly測定値と高速液体クロマトグラフィー－質量分析計（LC-MS；高速液体クロマトグラフィー装置；1100シリーズ（アジレントテクノロジー社製）、質量分析計；API3000（アプライドバイオシステムズ社製））から得られたGly測定値とを比較することにより行った。
　それぞれの実試料はアセトニトリルと1:1で混合させることにより試料中のタンパク質を沈殿させた。混合はボルテックス攪拌により15～30秒程度行い、遠心操作によりタンパク質を沈殿させた。処理後の上澄み液をPBS溶液により1～100倍に希釈後、biotin-[Fmoc-Cys-NHS]試薬による誘導体化反応に供した。誘導体化反応は、アセトニトリル11μL、0.1Mホウ酸緩衝液（pH9）4μL、上記タンパク質サンプル4μL、及び誘導体化試薬biotin-[Fmoc-Cys-NHS]を1μL混合した。混合はボルテックス攪拌により15～30秒程度行い、室温下で15分間放置した。次いで、0.2%酢酸溶液を20μL添加し誘導体化反応を停止させた。
　別途、検量線に用いるGly標準溶液についても0.1～1000μMの濃度範囲をPBSにより段階希釈により調製後、各濃度のGly標準溶液とアセトニトリルを1:1で混合させた。アセトニトリル混合後のGly標準溶液は、biotin-[Fmoc-Cys-NHS]試薬による誘導体化反応に処した。誘導体化反応は、アセトニトリル11μL、0.1Mホウ酸緩衝液（pH9）4μL、上記アセトニトリル混合Gly標準溶液4μL、及び誘導体化試薬biotin-[Fmoc-Cys-NHS]を1μL混合した。混合はボルテックス攪拌により15～30秒程度行い、室温下で15分間放置した。次いで、0.2%酢酸溶液を20μL添加し、誘導体化反応を停止させた。誘導体化反応後の実試料及びGly標準溶液は、0.1%ゼラチン含有PBS溶液により2000倍希釈した後、ELISA測定に供した。
　ELISA測定によるGly定量は以下の手順に従い実施した。まず、濃度0.1μg/mLの抗Fmoc-Cys-Gly抗体をProtein A/Gコーティングプレートの各ウェルに100μLずつ添加し、室温下で2時間放置した。次いで、PBST溶液によりウェル内を3回洗浄し、抗Fmoc-Cys-Gly抗体固相化プレートとした。本プレートの各ウェルに、誘導体化反応及び希釈処理済みの実試料又はGly標準溶液を100μLずつ添加し、室温下で1時間放置した。この間、プレートシールで全ウェルを密封状態とした。次いで、PBST溶液によりウェル内の洗浄を3回行い、Applie Block/GPB（5/95）混合液により濃度1μg/mLに希釈調製したストレプトアビジン－HRP結合体溶液を各ウェルに100μLずつ添加した。室温下で1時間放置した後（この間、プレートシールにより全ウェルを密封状態とした）、PBST溶液によりウェル内の洗浄を3回行った。その後、各ウェルを洗浄し、OPD溶液により呈色反応を行った。
　図４Ａに、日本酒、FCS及びラット血漿サンプルのGly濃度についてELISA及びLC-MSにより求めたそれぞれの測定値をプロットした結果を示す。また、図４Ｂにはラット血漿サンプルに限定してELISA及びLC-MSにより算出したGly測定値をプロットした結果を示す。これらの結果より、ELISAにより求めた実試料中のGly測定値はLC-MSにより求めたGly測定値とほぼ同一の値を示すことがわかり、さらに各種実試料に対する直線近似を調べたところ、図４Ａ及び図４Ｂの両方において正の相関性が示された（図４Ａ：Ｒ2値＝0.9945、図４Ｂ：Ｒ２値＝0.9642）。この結果からもELISAによるGly定量値は正確性が高いことが示された。
５－２．フェニルアラニン（Phe）の定量
　実試料としてウシ胎児血清（FCS）（Fetal Bovine Serum、インビトロジェン社製）及びラット血漿サンプル（SD系、メス、20週齢、日本チャールズリバー製）を用いて、抗Fmoc-Cys-Phe抗体及びアミノ酸誘導体化試薬による試料中のPhe測定評価を行った。その評価は、図２の原理に基づいたELISAによって算出されたPhe測定値と高速液体クロマトグラフィー－質量分析計（LC-MS；高速液体クロマトグラフィー装置；1100シリーズ（アジレントテクノロジー社製）、質量分析計；API3000（アプライドバイオシステムズ社製））から得られたPhe測定値とを比較することにより行った。
　それぞれの実試料はアセトニトリルと1:1で混合させることにより試料中のタンパク質を沈殿させた。混合はボルテックス攪拌により15～30秒程度行い、遠心操作によりタンパク質を沈殿させた。処理後の上澄み液をPBS溶液により1～100倍に希釈後、biotin-[Fmoc-Cys-NHS]試薬による誘導体化反応に供した。誘導体化反応は、アセトニトリル11μL、0.1Mホウ酸緩衝液（pH9）4μL、上記タンパク質サンプル4μL、及び誘導体化試薬biotin-[Fmoc-Cys-NHS]を1μL混合した。混合はボルテックス攪拌により15～30秒程度行い、室温下で15分間放置した。次いで、0.2%酢酸溶液を20μL添加し誘導体化反応を停止させた。
　別途、検量線に用いるPhe標準溶液についても0.1～1000μMの濃度範囲をPBSにより段階希釈により調製後、各濃度のPhe標準溶液とアセトニトリルを1:1で混合させた。アセトニトリル混合後のPhe標準溶液は、biotin-[Fmoc-Cys-NHS]試薬による誘導体化反応に処した。誘導体化反応は、アセトニトリル11μL、0.1Mホウ酸緩衝液（pH9）4μL、上記アセトニトリル混合Phe標準溶液4μL、及び誘導体化試薬biotin-[Fmoc-Cys-NHS]1μLを混合して行った。混合はボルテックス攪拌により15～30秒程度行い、室温下で15分間放置した。次いで、0.2%酢酸溶液を20μL添加し、誘導体化反応を停止させた。誘導体化反応後の実試料及びPhe標準溶液は、0.1%ゼラチン含有PBS溶液により2000倍希釈した後、ELISA測定に供した。
　ELISA測定によるPhe定量は以下の手順に従い実施した。まず、濃度0.1μg/mLの抗Fmoc-Cys-Phe抗体をProtein A/Gコーティングプレートの各ウェルに100μLずつ添加し、室温下で2時間放置した。次いで、PBST溶液によりウェル内を3回洗浄し、抗Fmoc-Cys-Phe抗体固相化プレートとした。本プレートの各ウェルに、誘導体化反応及び希釈処理済みの実試料又はPhe標準溶液を100μLずつ添加し、室温下で1時間放置した。この間、プレートシールで全ウェルを密封状態とした。次いで、PBST溶液によりウェル内の洗浄を3回行い、Applie Block/GPB（5/95）混合液により濃度1μg/mLに希釈調製したストレプトアビジン-HRP結合体溶液を各ウェルに100μLずつ添加した。室温下で1時間放置した後（この間、プレートシールにより全ウェルを密封状態とした）、PBST溶液によりウェル内の洗浄を3回行った。その後、各ウェルを洗浄し、OPD溶液により呈色反応を行った。
　図６に、FCS及びラット血漿サンプルのPhe濃度についてELISA及びLC-MSにより求めたそれぞれの測定値を比較したグラフを示す。この結果より、ELISAにより求めた実試料中のPhe測定値はLC-MSにより求めたPhe測定値とほぼ同一の値を示すことがわかった。
　本発明の含硫黄アミノ酸誘導体により、内因性低分子化合物を高感度で特異的且つ簡便に測定する方法を提供できるようになった。本発明の含硫黄アミノ酸誘導体を用いた測定方法は、検査、診断等に利用することができ、医療、食品、環境等の分野において有用である。特に、内因性低分子化合物であるアミノ酸は動物の健康指標でもあり、体内アミノ酸を測定することで健康状態の管理を行うことができる。また、体内アミノ酸のバランスを調べれば肝障害をも見出せる可能性がある。このように体内アミノ酸の測定を行うことによって、予防医学あるいは病気の早期発見、早期治療につなげることができる。
　本出願は、日本で出願された特願2010-114616（出願日：2010年5月18日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (13)

  1. 　下記一般式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    （式中、Ｘは免疫応答性疎水基、Ｙは内因性低分子化合物反応活性基又は内因性低分子化合物が結合した基、Ｚは水素原子、高分子量付与基又は標識化合物修飾基、Ａは単結合又は炭素数１～６のアルキレン基である。）
    で表される構造を有することを特徴とする、含硫黄アミノ酸誘導体。
  2. 　一般式（Ｉ）が下記一般式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    （式中、Ｘは免疫応答性疎水基、Ｙ’は内因性低分子化合物が結合した基、Ｚ’は水素原子又は高分子量付与基、Ａは単結合又は炭素数１～６のアルキレン基である。）
    で表される構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
  3. 　一般式（Ｉ）が下記一般式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    （式中、Ｘは免疫応答性疎水基、Ｙ’’は内因性低分子化合物反応活性基、Ｚ’’は標識化合物修飾基、Ａは単結合又は炭素数１～６のアルキレン基である。）
    で表される構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
  4. 　免疫応答性疎水基が環状構造を有することを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
  5. 　免疫応答性疎水基が、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基又はキノリニルアミノカルボニル基であることを特徴とする、請求項４に記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
  6. 　内因性低分子化合物反応活性基が、アルデヒド基、Ｎ－スクシンイミジル基、ハロゲン基、イソチオシアネート基又はマレイミド基を含有することを特徴とする、請求項１又は３に記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
  7. 　高分子量付与基又は標識化合物修飾基がリンカーを介して結合されていることを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の含硫黄アミノ酸誘導体。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の含硫黄アミノ酸誘導体を含むことを特徴とする、内因性低分子化合物を測定するための試薬。
  9. 　内因性低分子化合物がアミノ酸であることを特徴とする、請求項８に記載の試薬。
  10. 　請求項２に記載の含硫黄アミノ酸誘導体を抗原として用いて動物を免疫する工程を含む、内因性低分子化合物認識抗体の製造方法。
  11. 　請求項２に記載の含硫黄アミノ酸誘導体を抗原として用いることにより得られることを特徴とする、内因性低分子化合物認識抗体。
  12. 　前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１１に記載の内因性低分子化合物認識抗体。
  13. 　以下の工程（Ａ）～（Ｃ）を含むことを特徴とする、内因性低分子化合物の測定方法：
    （Ａ）請求項３に記載の含硫黄アミノ酸誘導体と被験試料とを反応させ、該含硫黄アミノ酸誘導体と被験試料中に存在する内因性低分子化合物との複合体を形成させる工程、
    （Ｂ）工程（Ａ）により形成した複合体と、請求項１１又は１２に記載の内因性低分子化合物認識抗体とを接触させる工程、
    （Ｃ）前記内因性低分子化合物認識抗体に結合した複合体の標識を測定する工程。
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