JP2004279412A

JP2004279412A - 低分子化合物の免疫学的測定・検出方法

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Publication number: JP2004279412A
Application number: JP2004046747A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Okada; 宏岡田; Hiroshi Azuma; 洋東
Original assignee: Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd
Current assignee: Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd
Priority date: 2003-02-24
Filing date: 2004-02-23
Publication date: 2004-10-07

Abstract

【課題】
高感度な低分子化合物の免疫学的測定方法を提供する。
【解決手段】
本発明は、被検液中に存在する測定対象の低分子化合物に前処理として架橋剤を結合させ、測定対象低分子化合物に前記前処理に使用したのと同じ架橋剤を介して蛋白質を結合させた免疫原を用いて作製された測定対象低分子化合物に対する抗体を用いて、免疫学的測定法により被検液中に存在する前記測定対象低分子化合物を検出することを特徴とする、低分子化合物の検出方法である。

Description

本発明は、免疫測定、免疫診断分野等に属するもので、低分子化合物を免疫学的測定方法により検出する方法に関する。

低分子化合物は分子量が小さいため、抗原決定基を通常１〜２ケ所しか持たない。また、２つある場合も、それぞれの抗原決定基が隣接しているため、通常は、蛋白質等を測定する際に一般的に用いられているサンドイッチアッセイ法を用いることが出来ない。そのため低分子化合物を測定する場合には、抗体を固相に固定化して、固定化抗体に対して低分子化合物と標識抗原（競合物質）を競合させるか、競合物質を固相に固定化して、固定化した競合物質と低分子化合物とを競合させて標識抗体と反応させることによって測定を行う。

低分子化合物を測定することのできる競合法は、サンドイッチ法と異なり抗原と反応する抗体を１種類のみ用いることにより測定するため、抗体の特異性が非常に厳格に要求される。また、低分子化合物を測定する競合法は、被検液中の低分子化合物、競合物質、および抗体の３者の濃度関係により、測定感度が大きく影響を受けていた。例えば、固相化抗原と標識化抗体を用いる「標識抗体法」の場合で説明すると、被検液中の低分子化合物を測定する上で、固相化抗原、標識化抗体の濃度は、いずれも高すぎると測定対象低分子化合物の検出感度は低下する。また、競合反応がバランス良く進行する必要最小限の固相化抗原濃度と標識化抗体濃度を決定する必要があった（酵素免疫測定法、蛋白質核酸酵素別冊３１号、共立出版株式会社、１４−１７（１９８７））。即ち、従来法においては、常に至適条件下で安定した測定を行う上で問題があった。

一方、低分子化合物の測定にサンドイッチアッセイ法を適用した例として、低分子化合物に対する抗体Ａと、低分子化合物と抗体Ａの免疫複合体に対する抗体Ｂを用いて低分子化合物を測定する免疫測定法が挙げられる（特開平８−２１１０５４号）。この方法によると、低分子化合物の２抗体測定法（サンドイッチ法）による測定が可能で、固相化抗体に抗体Ａを用い、低分子化合物を反応させて標識化した抗体Ｂで挟み込むか、低分子化合物と標識化した抗体Ａを反応させた後に、固相化された抗体Ｂに反応させて低分子化合物を挟み込む方法がとられている。この方法によれば、各抗体の特異性はそれほど厳格に要求されることはないが、測定系を確立する上で２種類の抗体が必要となる。通常、免疫原が低分子でない場合は抗原決定基が複数存在し、１回の抗体作製工程で複数の抗体が得られ、それらの一番好ましい組み合わせを見つけることで測定系を組むことができた。しかし、上述の方法では、低分子化合物に対する抗体Ａを作製した後に、再度抗体Ａと低分子化合物の免疫複合体を免疫原として抗体Ｂを作製するという、非常に時間と労力を要するといった問題があった。
特開平８−２１１０５４号酵素免疫測定法、蛋白質核酸酵素別冊３１号、共立出版株式会社、１４−１７（１９８７）

そこで、本発明者は、前述のような従来技術の問題を鑑み、高感度な低分子化合物の免疫学的測定方法を提供することを目的として、鋭意研究を続けた。

本発明者は、低分子化合物に対する抗体の結合性が、低分子化合物の分子量が小さいために弱い場合であっても、低分子化合物が架橋剤と結合した状態であれば、その結合している低分子化合物に対して抗体が強く反応することができることに着目し、被検液中に存在する測定対象の低分子化合物に、抗体作製時と同じ架橋剤を結合させる前処理を行った上で免疫学的測定方法を行うことにより、低分子化合物を高感度に検出することができることを見出し、本発明を完成させた。即ち、本発明は、被検液中に存在する測定対象の低分子化合物に前処理としてグルタルアルデヒド等の架橋剤を結合させ、測定対象低分子化合物に前記前処理に使用したのと同じ架橋剤を介して蛋白質を結合させた免疫原を用いて作製された測定対象低分子化合物に対する抗体を用いて、免疫学的測定法により被検液中に存在する前記測定対象低分子化合物を検出することを特徴とする、低分子化合物の検出方法である。

本発明においては、被検液中に存在する測定対象低分子化合物に、前処理として架橋剤を介して牛血清アルブミン等の蛋白質を結合させることもできる。また、免疫学的測定法として競合法を用いる場合は、測定対象低分子化合物に架橋剤又は架橋剤を介してタンパク質を結合させた競合物質を使用する。ここでは、競合物質に結合させる架橋剤は、被検液中に存在する測定対象低分子化合物の前処理に用いる架橋剤とは異なる物質を使用するのが好ましい。

本発明により、低濃度の低分子化合物を効率よく定量的に測定することができる。

本発明は、被検液中に存在する測定対象の低分子化合物に前処理として架橋剤を結合させ、測定対象低分子化合物に前記前処理に使用したのと同じ架橋剤を介して蛋白質を結合させた免疫原を用いて作製された測定対象低分子化合物に対する抗体を用いて、免疫学的測定法により被検液中に存在する前記測定対象低分子化合物を検出することを特徴とする、低分子化合物の検出方法である。以下に、本発明を更に詳細に説明する。

本発明においては、測定対象の低分子化合物としてはどのようなものでも可能であり、例えばアミノ酸の一つであるアルギニンや、その誘導体で動脈硬化の危険因子と考えられているmonomethyl arginine、asymmetrical dimethylarginine（ＡＤＭＡ）などが挙げられる。尚、ここで述べる低分子化合物とはハプテンである。

被検液中に存在する測定対象低分子化合物の前処理に使用する架橋剤としては、特に限定されるものではないが、後述の抗体作製時に使用する架橋剤と同一の架橋剤を使用する必要がある。架橋剤としては、グルタルアルデヒド、ジメチルアジピミデートやジメチルスベルイミデート等のビスイミドエステル、又は、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル等を例示することができる。この前処理においては、架橋剤のみを結合させることもできるが、架橋剤を介して蛋白質を結合させる方が好ましい。結合させる蛋白質としては、特に限定されるものではないが、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、イムノグロブリンをはじめとする一般的なタンパク質等を例示することができ、中でも、牛血清アルブミンが好ましい。当該蛋白質は、後述の抗体作製時に使用するキャリアー蛋白質とは、必ずしも、同一である必要はない。

次に、使用する抗体であるが、低分子化合物に対する抗体は通常の方法で作製することができる。即ち、低分子化合物を架橋剤を介してキャリアー蛋白質に結合させて免疫複合体を形成させ、該免疫原を動物に感作して、抗血清からポリクローナル抗体を分離するか、または、脾臓細胞を取り出して同種動物のミエローマ細胞と融合してモノクローナル抗体を分離する。ここで重要なのは、使用する架橋剤であり、前述の、被検液中に存在する測定対象低分子化合物の前処理に使用する架橋剤と同一の架橋剤を使用する必要がある。この抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であっても良いが、モノクローナル抗体が好ましく用いられる。また、キャリアー蛋白質としては、牛血清アルブミン、キーホール・リンベット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、グロブリン、オボアルブミン等を例示することができ、中でも、キーホール・リンベット・ヘモシアニンが好ましい。

免疫学的測定法としては、競合法とサンドイッチ法がある。例えば、本発明法を競合法で行う場合、被検液中に存在する測定対象低分子化合物に前処理として架橋剤を結合させた前処理複合体（以下前処理複合体と略す）と競合物質との間で抗体を競争反応させ、前処理複合体を検出することにより低分子化合物を定量する。ここで、競合物質は、測定対象低分子化合物に架橋剤又は架橋剤を介してタンパク質を結合させたものである。競合物質に結合させる架橋剤としては、前記前処理複合体の作製に用いる架橋剤と同様のものを例示することができるが、前処理複合体の作製に用いる架橋剤とは異なる架橋剤を使用することにより、より測定感度を高めることができる。即ち、例えば、競合物質の作製に用いる架橋剤をビスイミドエステルとし、前処理複合体の作製に用いる架橋剤をグルタルアルデヒドとする。

この競合法の第１の方法としては、抗体を固相に固定化して、前処理複合体と競合物質を競合させる。ここでは、競合物質を直接または間接に標識化しておくことにより、通常の方法で固相化抗体に結合した競合物質を定量することにより、間接的に前処理複合体を定量することが出来る。

競合法の第２の方法としては、競合物質を固相に固定化して、該競合物質と前処理複合体とを競合させて抗体と反応させる。抗体を直接または間接に標識化しておくことにより、通常の方法で固相に結合した抗体を定量することにより、間接的に前処理複合体を定量することができる。

競合法においては、標識は競合物質か抗体のうちで、固相に固定化されていない方に結合される。標識物の結合方法としては、直接結合させるか、ビオチン・アビジン系を用いて結合させる以外にも、反応する抗体に標識を結合させることにより、間接的に標識物を結合させることもできる。標識物としては、ＨＲＰなどの酵素を用いても良いし、放射性元素を用いても良いし、蛍光物質、発光物質等を使用することもできる。標識をシグナルに変換する方法も、当業者に知られているところである。本発明においては、標識物（ＨＲＰ）を直接結合するよりも、ビオチン・アビジン系（競合物質にビオチンを結合しておき、後でアビジン−ＨＲＰを反応させる）を用いる方が良好な結果が得られている。

サンドイッチ法で行う場合、測定対象低分子化合物に対する抗体と、前処理複合体を作製する際に用いたタンパク質に対する抗体とで、前処理複合体を挟み込み、前処理複合体を検出することにより低分子化合物を定量する。そのため、前処理複合体の作製において、架橋剤のみの結合ではなく、架橋剤を介して蛋白質を結合させる必要がある。

このサンドイッチ法の第１の方法としては、測定対象低分子化合物に対する抗体を固相に固定化して、１次反応として前処理複合体を結合させる。２次反応として、前処理複合体に用いた蛋白質に対する抗体を結合させることで前処理複合体を挟み込む。２次反応に用いる抗体は、直接または間接に標識化しておくことにより、通常の方法で固相化抗体に結合した前処理複合体を定量することにより、直接的に前処理複合体を定量することが出来る。

第２の方法としては、前処理複合体に用いたタンパク質に対する抗体を固相に固定化して、１次反応として前処理複合体を結合させる。２次反応として測定対象低分子化合物に対する抗体を結合させることで前処理複合体を挟み込む。２次反応に用いる抗体を標識化しておくことにより、前法と同様に、直接的に前処理複合体を定量することが出来る。

以下に実施例を示し本発明の詳細な説明を行うが、本発明の技術的範囲は、これにより限定されるものではない。

[実施例１]
１，免疫感作
ＫＬＨ（シグマ社製）18mgを 4.0mlの0.1Ｍリン酸緩衝液、pH7.4に溶解し、50％グルタルアルデヒド（ＧＡ）溶液25μlを加えて、室温で３時間撹拌して反応させた。これをＡＤＭＡ（シグマ社製）50mgと混合して、室温で３時間撹拌して反応させた。反応終了後、0.2mM水素化ほう素ナトリウム水溶液250μl添加して更に３時間放置後、リン酸緩衝液で充分に透析してＫＬＨ−ＧＡ−ＡＤＭＡを得た。このＫＬＨ−ＧＡ−ＡＤＭＡを1mg／mlのリン酸緩衝液として完全フロイントアジュバントと等量混合し、エマルジョンにしてＢＡＬＢ／ｃ系マウス（雌、８週令）に腹腔投与し、再度２週間後に、同一免疫原と不完全フロイントアジュバントを用いて、同様に腹腔投与により免疫感作を行った。この投与を２週間間隔で２回繰り返し、さらに最終投与から２週間後に採血して、後述の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により抗体価を測定して陽性であることを確認した後、リン酸緩衝液に溶解したＫＬＨ−ＧＡ−ＡＤＭＡ試料100μgを静脈注射した。３日後、当該マウスより脾臓を無菌的に摘出し、細胞融合を行った。

２，細胞融合
免疫されたマウスから脾臓を無菌的に摘出し、ステンレスメッシュにより単細胞にほぐし、脾細胞の1／5量のマウスミエローマ細胞株Ｐ３×63−Ag８−653細胞とＲＰＭＩ1640培地（免疫生物研究所製）を混合し遠心分離後、細胞のペレットに45％ポリエチレングリコール4000（免疫生物研究所製）を加え、融合操作を行った。その後除々にＲＰＭＩ1640液で希釈し遠心分離により上清を除去した融合細胞を、15％牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えたＨＡＴ培地（0.01mMヒポキサンチン、1.6μＭチミジン、0.04μＭアミノプリテンを含むＲＰＭＩ1640培地）に懸濁し、96穴マイクロプレートに１ウェルあたり１×10^５個の細胞をまき込み５％CO_２下37℃で培養した。２週間後、コロニー生育ウェル培養上清を用いて、ＥＬＩＳＡ法によりＡＤＭＡに反応するウェルをスクリーニングした。スクリーニングした抗体産生コロニーのうち一つを限界希釈法によりクローニングを２回行い、安定した抗体産生クローンF12H10を得た。

３，モノクローナル抗体の精製
クローン化したハイブリドーマF12H10について、15％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ1640培地で２週間かけて継代培養し、培養液の量を800mlまで拡大した。これを３Ｍ塩化ナトリウムを含む1.5Ｍグリシン緩衝液（pH8.9）で10倍に希釈し、プロテインＡカラム（５ml）（ファルマシア社製）にアプライして充分に吸着させた後、0.1Ｍクエン酸緩衝液で溶出した。

４，モノクローナル抗体の特徴づけ
モノクローナル抗体の抗体クラスとサブクラスは、マウスモノクローナル抗体・アイソタイピングテストキット（セロテック社製）を使用して決定した。その結果、得られたモノクローナル抗体F12H10はIgG１と決定された。

５，ＥＬＩＳＡ法
ＫＬＨの代わりにＢＳＡ（生化学工業社製）を用いて、免疫感作の項と同様にして調製したＢＳＡ−ＧＡ−ＡＤＭＡを、96穴マイクロタイタープレートに10μg／mlの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液として50μlづつ添加し、４℃で一晩静置した。その後当該液を除去して、１％ＢＳＡ・ＰＢＳを180μlづつ添加して37℃で１時間ブロッキングを行った。ＰＢＳで洗浄後、採血したマウスの抗血清を１％ＢＳＡ・ＰＢＳにより1000倍から段階希釈して（細胞融合の結果得られたハイブリドーマの培養上清の抗体価を測定する場合は、培養上清を原液または適当倍率に希釈して）、50μlづつ添加して室温で１時間反応させた。反応終了後ＰＢＳで洗浄し、ＨＲＰ標識化ヤギ抗マウスＩｇ（カッペル社製）を１％ＢＳＡ・ＰＢＳにより希釈して添加し、室温で１時間反応させた。その後、溶液を除去し、ＰＢＳで充分に洗浄した後、基質として濃度1mg／mlのO-フェニレンジアミンを溶解したクエン酸・リン酸緩衝液（pH5.5）（0.015％Ｈ_２Ｏ_２を含む）を各ウェルに100μlづつ添加し発色させた。３Ｎ硫酸100μlを各ウェルに加えて発色反応を停止し、波長492nmの吸光度をマイクロプレートリーダーＭｏｄｅｌ３５５０（バイオラッド社製）を用いて測定した。

６，ビオチン−ＢＳＡ−ＤＭＳ−ＡＤＭＡの調製
ＢＳＡ（生化学工業社製）30mgをＰＢＳ3.0mlに溶解し、Sulfo-NHS-LC-Biotin（ピアス社製）３mgと混合して氷冷中で２時間反応させた。反応終了後、ＰＢＳで充分に透析してビオチン−ＢＳＡを得た。これをPD-10カラム（ファルマシア社製）を用いて0.1Ｍ炭酸水素ナトリウムpH8.5にバッファー交換し全量を15mlとし、これにＡＤＭＡ15mgを溶解した。さらにジメチルスベルイミデート（ＤＭＳ）（和光純薬工業社製）40mgを氷冷した精製水1mlに溶解し、上記に添加し室温で３時間撹拌して反応させた。反応終了後、ＰＢＳで充分に透析してビオチン−ＢＳＡ−ＤＭＳ−ＡＤＭＡを得た。

７，競合ＥＬＩＳＡによるＡＤＭＡの測定
モノクローナル抗体F12H10を96穴マイクロタイタープレートに10μg／mlのＰＢＳ溶液として50μlづつ添加し、４℃で一晩静置した。その後当該液を除去して、１％ＢＳＡ・ＰＢＳを180μlづつ添加して37℃で１時間ブロッキングを行った。
一方、前処理として既知濃度のＡＤＭＡを含有するＰＢＳ溶液に、0.5Ｍグルタルアルデヒド溶液50μlを加えて室温で30分反応させた。これに１％ＢＳＡ・ＰＢＳ50μlを加えて室温で２時間反応させ、被検液であるＢＳＡ−ＧＡ−ＡＤＭＡ溶液を作製した。
前述のプレートをＰＢＳで充分洗浄した後、当該プレートに被検液であるＢＳＡ−ＧＡ−ＡＤＭＡ50μlと、ＰＢＳで5000倍に希釈した競合物質であるビオチン−ＢＳＡ−ＤＭＳ−ＡＤＭＡ50μlとを同時に添加して、室温で90分間競合反応させた。反応液を除去しプレートをＰＢＳで充分洗浄した後、ＰＢＳにて4000倍に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（Oncogene社製）50μlを加えて室温で90分間反応させた。更に反応液を除去してプレートをＰＢＳで充分洗浄した後、基質として濃度1mg／mlのO-フェニレンジアミンを溶解したクエン酸・リン酸緩衝液（pH5.5）（0.015％Ｈ_２Ｏ_２を含む）を各ウェルに100μlづつ添加し発色させた。３Ｎ硫酸100μlを各ウェルに加えて発色反応を停止し、波長492nmの吸光度をマイクロプレートリーダーＭｏｄｅｌ３５５０（バイオラッド社製）を用いて測定した。その結果を図１に示す。

[実施例２]
モノクローナル抗体F12H10を96穴マイクロタイタープレートに10μg／mlのＰＢＳ溶液として50μlづつ添加し、４℃で一晩静置した。その後当該液を除去して、１％ＢＳＡ・ＰＢＳを180μlづつ添加して37℃で１時間ブロッキングを行った。
一方、前処理として既知濃度のＡＤＭＡを含有するＰＢＳ溶液に、0.5Ｍグルタルアルデヒド溶液50μlを加えて室温で30分反応させた。これに4mg／mlの水素化ホウ素ナトリウム溶液50μlを加えて反応を停止させた後、pHを調整する目的で0.1Ｍリン酸緩衝液（pH6.6）を加え、被検液であるＧＡ−ＡＤＭＡ溶液を作製した。
前述のプレートをＰＢＳで充分洗浄した後、当該プレートに被検液であるＧＡ−ＡＤＭＡ50μlと、ＰＢＳで5000倍に希釈した競合物質であるビオチン−ＢＳＡ−ＤＭＳ−ＡＤＭＡ50μlとを同時に添加して、室温で90分間競合反応させた。反応液を除去しプレートをＰＢＳで充分洗浄した後、ＰＢＳにて4000倍に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（Oncogene社製）50μlを加えて室温で90分間反応させた。更に反応液を除去してプレートをＰＢＳで充分洗浄した後、基質として濃度1mg／mlのO-フェニレンジアミンを溶解したクエン酸・リン酸緩衝液（pH5.5）（0.015％Ｈ_２Ｏ_２を含む）を各ウェルに100μlづつ添加し発色させた。３Ｎ硫酸100μlを各ウェルに加えて発色反応を停止し、波長492nmの吸光度をマイクロプレートリーダーＭｏｄｅｌ３５５０（バイオラッド社製）を用いて測定した。その結果を図２に示す。

[比較例１]
モノクローナル抗体F12H10を96穴マイクロタイタープレートに10μg／mlのＰＢＳ溶液として50μlづつ添加し、４℃で一晩静置した。その後当該液を除去して、１％ＢＳＡ・ＰＢＳを180μlづつ添加して37℃で１時間ブロッキングを行った。次に、このプレートをＰＢＳで充分洗浄した後、当該プレートに被検液である既知濃度のＡＤＭＡを含有するＰＢＳ溶液50μlと、ＰＢＳで5000倍に希釈した競合物質であるビオチン−ＢＳＡ−ＤＭＳ−ＡＤＭＡ50μlとを同時に添加して室温で90分間競合反応させた。反応液を除去してプレートをＰＢＳで充分洗浄した後、ＰＢＳにて4000倍に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（Oncogene社製）50μlを加えて室温で90分間反応させた。更に反応液を除去してプレートをＰＢＳで充分洗浄した後、基質として濃度1mg／mlのO-フェニレンジアミンを溶解したクエン酸・リン酸緩衝液（pH5.5）（0.015％Ｈ_２Ｏ_２を含む）を各ウェルに100μlづつ添加し発色させた。３Ｎ硫酸100μlを各ウェルに加えて発色反応を停止し、波長492nmの吸光度をマイクロプレートリーダーＭｏｄｅｌ３５５０（バイオラッド社製）を用いて測定した。その結果を図３に示す。

[考察]
実施例１では、被検液中に含まれるＡＤＭＡにグルタルアルデヒドを介してＢＳＡに結合させるという前処理を施して競合ＥＬＩＳＡを実施したため、検出限界は0.3nmol/mlを示した。また、実施例２では、被検液中に含まれるＡＤＭＡにグルタルアルデヒドを結合させるという前処理を施して競合ＥＬＩＳＡを実施したため、検出限界は0.3nmol/mlを示した。一方、比較例１では、被検液中に含まれるＡＤＭＡの前処理せずに測定したため、ＡＤＭＡの検出限界は30nmol/mlであった。即ち、比較例１に対して実施例１や実施例２では、検出感度が100倍上昇したことになる。これは低分子化合物であるＡＤＭＡと抗体の反応性が、架橋剤を結合させることによって高まったことを示す。競合ＥＬＩＳＡにおいて、低分子化合物と抗体の反応性が充分でない場合でも、本発明の低分子化合物に架橋剤を結合させる前処理方法を用いれば、低分子化合物と抗体の反応性が高まり、感度が上昇するという効果があることが示された。

競合法を用いた本発明法（実施例１）により、低分子化合物であるＡＤＭＡを測定した場合の化合物濃度と吸光度の関係を示す図である。競合法を用いた本発明法（実施例２）により、低分子化合物であるＡＤＭＡを測定した場合の化合物濃度と吸光度の関係を示す図である。競合法を用いた従来法（比較例１）により、低分子化合物であるＡＤＭＡを測定した場合の化合物濃度と吸光度の関係を示す図である。

Claims

被検液中に存在する測定対象の低分子化合物に前処理として架橋剤を結合させ、測定対象低分子化合物に前記前処理に使用したのと同じ架橋剤を介して蛋白質を結合させた免疫原を用いて作製された測定対象低分子化合物に対する抗体を用いて、免疫学的測定法により被検液中に存在する前記測定対象低分子化合物を検出することを特徴とする、低分子化合物の検出方法。
測定対象低分子化合物に架橋剤を介して蛋白質を結合させた免疫原を用いて前記測定対象低分子化合物に対する抗体を作製し、被検液中に存在する測定対象低分子化合物に前処理として前記抗体作製に使用したのと同じ架橋剤を結合させ、前記抗体を用いて、免疫学的測定法により前記測定対象低分子化合物を検出することを特徴とする、低分子化合物の検出方法。
被検液中に存在する測定対象低分子化合物に前処理として架橋剤を介して蛋白質を結合させることを特徴とする、請求項１又は２に記載の低分子化合物の検出方法。
結合させる蛋白質が牛血清アルブミンである、請求項３に記載の低分子化合物の検出方法。
被検液中に存在する測定対象低分子化合物の前処理に用いる架橋剤が、グルタルアルデヒド、ビスイミドエステル、又は、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルである、請求項１〜４のいずれかに記載の低分子化合物の検出方法。
免疫学的測定法が、測定対象低分子化合物に架橋剤又は架橋剤を介してタンパク質を結合させた競合物質を使用する競合法である、請求項１〜５のいずれかに記載の低分子化合物の検出方法。
競合物質に結合させる架橋剤が、被検液中に存在する測定対象低分子化合物の前処理に用いる架橋剤とは異なる物質であることを特徴とする、請求項６に記載の低分子化合物の検出方法。
競合物質に結合させる架橋剤がビスイミドエステルであり、被検液中に存在する測定対象低分子化合物の前処理に用いる架橋剤がグルタルアルデヒドである、請求項７に記載の低分子化合物の検出方法。