CN114354585B - 一种辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器和方法 - Google Patents

Abstract

一种辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器和方法，通过将作为识别分子蛋白质的辣根过氧化酶HRP与作为不干扰识别的支架蛋白质牛血清白蛋白BSA进行复合，使得原本难以凝胶化的辣根过氧化酶HRP能够通过交联剂戊二醛GA交联而成复合蛋白质水凝胶以嵌合光子晶体阵列中的胶体颗粒，从而可以利用辣根过氧化酶HRP与过氧化氢的类过氧化氢酶反应导致的凝胶体积(胶体颗粒间距)变化和该胶体颗粒间距变化导致的光子晶体阵列衍射出的德拜环直径变化对被测物中的过氧化氢含量实现灵敏无标记可视化检测。

Description

一种辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器和方法

技术领域

本发明涉及过氧化氢检测技术，特别是一种辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器和方法，通过将作为识别分子蛋白质的辣根过氧化酶HRP与作为不干扰识别的支架蛋白质牛血清白蛋白BSA进行复合，使得原本难以凝胶化的辣根过氧化酶HRP能够通过交联剂戊二醛GA交联而成复合蛋白质水凝胶以嵌合二维光子晶体阵列中的胶体颗粒，从而可以利用辣根过氧化酶HRP与过氧化氢的类过氧化氢酶反应导致的胶体颗粒间距变化和该胶体颗粒间距变化导致的二维光子晶体阵列的德拜衍射环直径变化对被测物中的过氧化氢含量实现灵敏无标记可视化检测。

背景技术

过氧化氢别名双氧水，乙氧烷，是一种常见的强氧化剂和漂白剂。过氧化氢被广泛应用于食品加工、造纸、纺织、制药以及清洁和消毒产品等工业部门中。此外，过氧化氢在医疗诊断和临床研究方面也发挥着重要的作用。过氧化氢是葡萄糖氧化酶、酒精氧化酶、胆固醇氧化酶、乳酸氧化酶和谷氨酸氧化酶等多种氧化酶所涉及的反应的中间产物。作为一种常见的活性氧，过氧化氢是监测许多疾病和氧化应激紊乱的重要生物标记物，这些疾病包括糖尿病、心血管疾病、帕金森氏病、阿尔茨海默病、癌症以及神经退行性疾病等。过氧化氢也常常被用来对各种医疗设备进行消毒灭菌。因此，对过氧化氢的检测在工业上和医学上都十分重要。目前，检测过氧化氢的方法主要有比色法、化学发光法、荧光法和电化学法等，比色法、化学发光法、荧光法等传统方法依赖于各种仪器设备，通常具有成本高、测试仪器贵重庞大、需要专业人员操作以及难以现场检测等缺点。而电化学法虽然可实现低成本现场检测，但对参比电极的稳定性、工作面积等方面也具有严格要求，非常复杂。因此，开发出一种成本低廉、制备和操作简单的传感器用于过氧化氢的检测是十分有必要的。

光子晶体是由两种或两种以上具有不同折光系数的介质材料在亚微米尺度上按照一定的周期顺序排列而成的有序光学结构。光子晶体周期排列尺度与可见光波长处于同一个量级，当光波作用于光子晶体的周期性结构时通过布拉格衍射能够在一定频率范围内产生“光子带隙”。处于光子带隙的电磁波无法在光子晶体中传播，若被禁止传播的电磁波处于可见光范围内，则光子晶体明亮的结构色即可被人眼所感知。通过对光子晶体的组成材料、晶格参数、有效折射率等参数进行合理的设计，可以人为调控光子晶体的光子带隙和结构色，使得光子晶体在防伪、喷墨打印、光纤、纺织和传感等领域具有巨大的应用前景。将光子晶体与刺激响应性智能传感材料如水凝胶相结合而成的响应性光子晶体传感器，在智能聚合物传感材料对外界条件如温度、pH、电场、离子强度等产生响应时会发生体积变化，同时引起光子晶体晶格参数变化，使光子带隙发生改变，从而将外界环境的变化转换为可读的光学信号。响应性光子晶体传感器具有成本低廉、制备方便、操作简单、信噪比高、选择性和灵敏性良好等特点，已经可以对蛋白质、碳水化合物、神经毒素、氨基酸和金属离子等进行有效检测。

辣根过氧化酶是一种含量丰富的过氧化物酶。这种酶含有血红素基团，能够利用过氧化氢氧化许多有机和无机化合物，已经被广泛应用于工业合成、纺织、医疗诊断、免疫测定和传感等领域。辣根过氧化酶由308个氨基酸组成，其中仅有6个赖氨酸，而只有其中的3个赖氨酸残基位于酶的表面上，可以被有效地化学修饰用于交联，因此利用戊二醛直接交联辣根过氧化酶很难得到蛋白质凝胶。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，提供一种辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器和方法，通过将作为识别分子蛋白质的辣根过氧化酶HRP与作为不干扰识别的支架蛋白质牛血清白蛋白BSA进行复合，使得原本难以凝胶化的辣根过氧化酶HRP能够通过交联剂戊二醛GA交联而成复合蛋白质水凝胶以嵌合光子晶体阵列中的胶体颗粒，从而可以利用辣根过氧化酶HRP与过氧化氢的类过氧化氢酶反应导致的胶体颗粒间距变化和该胶体颗粒间距变化导致的光子晶体阵列衍射出的德拜环直径变化对被测物中的过氧化氢含量实现灵敏无标记可视化检测。

本发明的技术解决方案如下：

一种辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器，其特征在于，包括复合凝胶和光子晶体阵列，所述复合凝胶为片状结构，所述光子晶体阵列中的胶体颗粒均嵌合在所述片状结构的表面上形成胶体颗粒分布层，所述复合凝胶为辣根过氧化酶HRP与牛血清白蛋白BSA复合并通过交联剂戊二醛GA交联而成的复合蛋白质水凝胶，所述复合蛋白质中的辣根过氧化酶HRP为识别分子蛋白质，所述复合蛋白质中的牛血清白蛋白BSA为不干扰识别的支架蛋白质。

所述光子晶体阵列为二维光子晶体阵列。

所述辣根过氧化酶HRP用于识别过氧化氢H₂O₂，在与过氧化氢的“类过氧化氢酶”反应中，辣根过氧化酶根据反应体系中过氧化氢的浓度而发生相应程度的失活，在失活过程中，辣根过氧化酶中血红素基团的卟啉大环的间亚甲基桥部位会受到过氧化氢的攻击而发生断裂，形成开链的线状四吡咯，导致识别分子蛋白质的展开，所述展开引起复合凝胶的体积膨胀，光子晶体阵列中的胶体颗粒间距随着复合凝胶的体积膨胀而变大，变大的胶体颗粒间距使得光子晶体阵列衍射出的德拜环直径变小，从而实现针对过氧化氢检测的定性传感和定量传感。

所述复合凝胶中具有以下质量比，辣根过氧化酶HRP:牛血清白蛋白BSA＝25～75:170，所述传感器对过氧化氢的检测限为6.1×10^-5M，线性检测范围为0-1.0mM。

所述戊二醛GA交联包括戊二醛GA与蛋白质分子表面上的赖氨酸发生席夫碱反应，所述蛋白质分子包括表面上具有3个赖氨酸残基的辣根过氧化酶HRP和表面上具有34个赖氨酸残基的牛血清白蛋白BSA。

所述光子晶体阵列中的胶体颗粒为聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯或二氧化硅(SiO₂)或硫化锌(ZnS)或二氧化钛(TiO₂)，所述光子晶体阵列是采用尖端导流气液界面自组装法制备的二维光子晶体胶体颗粒阵列形成。

一种辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A，分别制备出光子晶体阵列和复合凝胶预聚液，所述复合凝胶预聚液是将辣根过氧化酶HRP和牛血清白蛋白BSA溶于磷酸盐缓冲液PBS中而成；

步骤B，将所述复合凝胶预聚液与交联剂戊二醛GA混合成第一混合液，将所述第一混合液铺展在所述光子晶体阵列上进行交联反应以形成复合蛋白质水凝胶，所述光子晶体阵列中的胶体颗粒均嵌合在所述复合蛋白质水凝胶表面上形成胶体颗粒分布层，所述复合蛋白质中的辣根过氧化酶HRP为识别分子蛋白质，所述复合蛋白质中的牛血清白蛋白BSA为不干扰识别的支架蛋白质；

步骤C，将结合了光子晶体阵列的复合蛋白质水凝胶裁切成具有规格尺寸的片状物即得辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器。

所述步骤A中的光子晶体阵列的制备包括步骤A1，合成聚苯乙烯胶体颗粒：在氮气气氛下，将苯乙烯、过硫酸钾和除氧的蒸馏水混合，在搅拌条件下水浴加热反应，反应后通过离心洗涤，制备得到聚苯乙烯胶体颗粒；步骤A2，制备聚苯乙烯二维光子晶体阵列：将聚苯乙烯胶体颗粒分散成乳液，并与正丙醇混合，旋振后注射到水面上，用亲水性处理过的载玻片将所述聚苯乙烯胶体颗粒捞出并且在空气中干燥，得到聚苯乙烯二维光子晶体阵列，所述亲水性处理包括将载玻片浸泡在食人鱼溶液中，再用蒸馏水和无水乙醇依次清洗载玻片后用氮气吹干。

一种使用辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器检测过氧化氢的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，准备至少两片辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器，第一片放入不含有过氧化氢的磷酸盐缓冲液PBS中，将第二片辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器放入待测物中，所述辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器包括复合凝胶和光子晶体阵列，所述复合凝胶为片状结构，所述光子晶体阵列中的胶体颗粒均嵌合在所述片状结构的表面上形成胶体颗粒分布层，所述复合凝胶为辣根过氧化酶HRP与牛血清白蛋白BSA复合并通过交联剂戊二醛GA交联而成的复合蛋白质水凝胶，所述复合蛋白质中的辣根过氧化酶HRP为识别分子蛋白质，所述复合蛋白质中的牛血清白蛋白BSA为不干扰识别的支架蛋白质；

步骤2，按照预设时间使所述辣根过氧化酶HRP与被测物中可能存在的过氧化氢H₂O₂充分进行类过氧化氢酶反应后，将所述第一片和第二片辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器从各自的检测液中取出，所述类过氧化氢酶反应中，辣根过氧化酶根据反应体系中过氧化氢的浓度而发生相应程度的失活，在失活过程中，辣根过氧化酶中血红素基团的卟啉大环的间亚甲基桥部位会受到过氧化氢的攻击而发生断裂，形成开链的线状四吡咯，从而导致蛋白质的断链展开而降低水凝胶的交联密度，使水凝胶发生相应的溶胀，而水凝胶的溶胀又使得光子晶体阵列中的胶体颗粒间距变大；

步骤3，用激光分别照射第一片和第二片辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器，测量出第一片上光子晶体阵列衍射出的德拜环直径D和第二片上光子晶体阵列衍射出的德拜环直径D’，根据D与D’的差值确定被测物中的过氧化氢浓度，所述光子晶体阵列中的胶体颗粒间距变大使得光子晶体阵列衍射出的德拜环直径变小。

本发明的技术效果如下：本发明一种辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器和方法，涉及一种蛋白质(酶)分子由于缺少赖氨酸基团无法通过席夫(Schiff)碱反应采用戊二醛微交联制备智能凝胶材料的难题，通过将辣根过氧化酶与支架蛋白质牛血清白蛋白进行复合并交联得到水凝胶，制备得到二维光子晶体传感器的方法以及灵敏无标记可视化检测过氧化氢的方法。

本发明提供了一种二维光子晶体辣根过氧化酶复合蛋白质凝胶传感器，该传感器利用牛血清白蛋白作为辣根过氧化酶凝胶化的支架材料，制备了辣根过氧化酶/牛血清白蛋白智能水凝胶，与二维光子晶体集成后，得到二维光子晶体传感器。基于辣根过氧化酶与过氧化氢的反应造成的智能材料体积的变化以及二维光子晶体独特的德拜衍射环，从而实现对过氧化氢的无标记选择性灵敏检测。该传感器原料来源广泛，制备和检测过程操作简单，成本低廉，不需要贵重的仪器设备和专业的操作人员，具有广泛的应用前景，可望制备便携式传感设备，并有望用于跟体内H₂O₂浓度相关的各种疾病的检测。

本发明具有以下特点：(1)本发明的原料来源丰富，传感器成本低廉，制备流程简单。(2)本发明的检测仪器传感器结构简单，操作简单，具有很好的线性响应性。(3)本发明首次采用双氧水诱导的酶催化反应导致的智能材料的体积相变化来检测H₂O₂。(4)本发明的传感器具有优异的选择性、良好的灵敏度和稳定性。(5)本发明的传感器不具有可逆性。(6)本发明解决了某些蛋白质(酶)分子由于缺少赖氨酸基团无法通过席夫(Schiff)碱反应交联制备智能凝胶材料的难题。(7)本发明优化了传感器的性能，通过固定BSA的质量不变，调整HRP的质量，发现在HRP浓度：BSA＝15:34(w:w)，交联剂单体溶液：5wt％戊二醛＝60:11(v:v)的条件下传感器发挥最优的性能。(8)本发明优化了传感器的最佳pH条件，在pH＝6.0～9.0的范围内，发现pH＝9.0的条件下传感器发挥最优的性能。(9)本传感器的灵敏度好，检测限：6.1×10^-5M，线性检测范围较宽：0-1.0mM。

附图说明

图1是实施本发明一种辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器的结构示意图。图1中包括辣根过氧化酶复合凝胶1和光子晶体阵列2，复合凝胶1为片状结构，光子晶体阵列2中的胶体颗粒均嵌合在所述片状结构的表面上形成胶体颗粒分布层，复合凝胶1为辣根过氧化酶HRP与牛血清白蛋白BSA复合并通过戊二醛GA交联而成的复合蛋白质水凝胶。所述复合蛋白质中的辣根过氧化酶为识别分子蛋白质，所述复合蛋白质中的牛血清白蛋白为不干扰识别的支架蛋白质。

图2是本发明一种辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器在过氧化氢检测中的原理示意图。图2中左侧部分表示激光穿过传感器中的光子晶体阵列后衍射出的德拜环直径D较大(即胶体颗粒间距较小，被测物中没有过氧化氢H₂O₂或过氧化氢浓度较低)。图2中右侧部分表示激光穿过传感器中的光子晶体阵列后衍射出的德拜环直径D’较小(即胶体颗粒间距较大或变大，被测物中有过氧化氢H₂O₂或过氧化氢浓度增高)。通过德拜环直径的变化确定胶体颗粒间距的变化，通过胶体颗粒间距的变化确定被测物中H₂O₂含量，或者通过德拜环直径的变化直接确定被测物中H₂O₂含量。

图3是不同辣根过氧化酶含量对传感器性能的影响示意图。图3的横坐标为过氧化氢检测液浓度(H₂O₂/mM，单位：毫摩尔/升，溶剂为0.01mM PBS缓冲液，即磷酸盐缓冲液)，刻度值包括0-2-4-6-8-10。图3的纵坐标为胶体颗粒间距变化量(增加量，nm为纳米，ParticleSpacing Change)，刻度值包括0-10-20-30-40-50-60-70-80。图3中包括4种含量的传感器性能曲线，自下而上依次是HRP/BSA-25(辣根过氧化酶HRP25mg/牛血清白蛋白BSA170mg)，HRP/BSA-50(辣根过氧化酶HRP50mg/牛血清白蛋白BSA170mg)，HRP/BSA-70(辣根过氧化酶HRP70mg/牛血清白蛋白BSA170mg)，HRP/BSA-75(辣根过氧化酶HRP75mg/牛血清白蛋白BSA170mg)。

图4是不同pH对传感器响应性能的影响示意图。图4的横坐标为过氧化氢检测液浓度(H₂O₂/mM，单位：毫摩尔/升，溶剂为0.01mM PBS缓冲液，即磷酸盐缓冲液)，刻度值包括0-2-4-6-8-10。图4的纵坐标为胶体颗粒间距变化量(增加量，nm为纳米，Particle SpacingChange)，刻度值包括0-10-20-40-60-80-100。图4中包括3个pH值性能曲线，自下而上依次是pH 6.0，pH 7.4，pH 9.0。

图5是HRP/BSA-75水凝胶和BSA水凝胶之间对H₂O₂检测的响应性能比较示意图。图5的横坐标为过氧化氢检测液浓度(H₂O₂/mM，单位：毫摩尔/升，溶剂为0.01mM PBS缓冲液，即磷酸盐缓冲液)，刻度值包括0-2-4-6-8-10。图5的纵坐标为胶体颗粒间距值(nm为纳米，Particle Spacing)，刻度值包括760-780-800-820-840-860-880-900-920-940-960-980-1000。图5中的下部为BSA水凝胶H₂O₂检测的响应曲线，图5中的中部6张图片为六个H₂O₂浓度点检测液中HRP/BSA-75水凝胶光子晶体传感器的颜色，六个H₂O₂浓度点从左至右依次为0mM，0.1mM，0.5mM，1mM，5mM，10mM，HRP/BSA-75水凝胶光子晶体传感器的颜色(图中是灰度色，实际是彩色)从左至右依次为绿色，黄绿色，黄绿色，黄色，橙色，红色。

图6是HRP/BSA-75水凝胶二维光子晶体传感器对5种不同待测分析物的响应性能比较示意图。图6的纵坐标为胶体颗粒间距变化量(增加量，nm为纳米，Particle SpacingChange)，刻度值包括0-10-20-30-40-50-60-70-80-90。图6中包括HRP/BSA-75水凝胶对5种试剂的响应性能，试剂名称从左到右依次为过氧化氢(H₂O₂)，葡萄糖(D-glucose)，果糖(D-fructose)，华法林钠(Warfarin sodium)，OP-10。

具体实施方式

下面结合附图(图1-图6)和实施例对本发明进行说明。

图1是实施本发明一种辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器的结构示意图。图2是本发明一种辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器在过氧化氢检测中的原理示意图。图3是不同辣根过氧化酶含量对传感器性能的影响示意图。图4是不同pH对传感器响应性能的影响示意图。图5是HRP/BSA-75水凝胶和BSA水凝胶之间对H₂O₂检测的响应性能比较示意图。图6是HRP/BSA-75水凝胶二维光子晶体传感器对5种试剂的响应性能比较示意图。参考图1至图6所示，一种辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器，包括复合凝胶1和光子晶体阵列2，所述复合凝胶为片状结构，所述光子晶体阵列中的胶体颗粒均嵌合在所述片状结构表面上形成胶体颗粒分布层，所述复合凝胶为辣根过氧化酶HRP与牛血清白蛋白BSA复合并通过交联剂戊二醛交联而成的复合蛋白质水凝胶，所述复合蛋白质中的辣根过氧化酶HRP为识别分子蛋白质，所述复合蛋白质中的牛血清白蛋白BSA为不干扰识别的支架蛋白质。所述光子晶体阵列为二维光子晶体阵列。所述辣根过氧化酶HRP用于识别过氧化氢H₂O₂，在与过氧化氢的“类过氧化氢酶”反应中，辣根过氧化酶根据反应体系中过氧化氢的浓度而发生相应程度的失活，在失活过程中，辣根过氧化酶中血红素基团的卟啉大环的间亚甲基桥部位会受到过氧化氢的攻击而发生断裂，形成开链的线状四吡咯，导致识别分子蛋白质的展开，所述展开引起复合凝胶的体积膨胀，光子晶体阵列中的胶体颗粒间距随着复合凝胶的体积膨胀而变大，变大的胶体颗粒间距使得光子晶体阵列衍射出的德拜环直径变小，从而实现针对过氧化氢检测的定性传感以及定量传感。

所述复合凝胶中具有以下重量比，辣根过氧化酶HRP:牛血清白蛋白BSA＝25～75:170，所述传感器对过氧化氢的检测限为6.1×10^-5M，线性检测范围为0-1.0mM。所述戊二醛GA交联包括戊二醛GA与蛋白质分子表面上的赖氨酸发生席夫碱反应，所述蛋白质分子包括表面上具有3个赖氨酸残基的辣根过氧化酶HRP和表面上具有34个赖氨酸残基的牛血清白蛋白BSA。所述光子晶体阵列中的胶体颗粒为聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯或SiO₂或ZnS或TiO₂，所述光子晶体阵列是采用尖端导流气液界面自组装法制备的二维光子晶体胶体颗粒阵列形成。

一种辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤A，分别制备出光子晶体阵列和复合凝胶预聚液，所述复合凝胶预聚液是将辣根过氧化酶HRP和牛血清白蛋白BSA溶于磷酸盐缓冲液PBS中而成；步骤B，将所述复合凝胶预聚液与交联剂戊二醛GA混合成第一混合液，将所述第一混合液铺展在所述光子晶体阵列上进行交联反应以形成复合蛋白质水凝胶，所述光子晶体阵列中的胶体颗粒均嵌合在所述复合蛋白质水凝胶的表面上形成胶体颗粒分布层，所述复合蛋白质中的辣根过氧化酶HRP为识别分子蛋白质，所述复合蛋白质中的牛血清白蛋白BSA为不干扰识别的支架蛋白质。步骤C，将结合了光子晶体阵列的复合蛋白质水凝胶裁切成具有规格尺寸的片状物即得辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器。所述步骤A中的光子晶体阵列的制备包括步骤A1，合成聚苯乙烯胶体颗粒：在氮气气氛下，将苯乙烯、过硫酸钾和除氧的蒸馏水混合，在搅拌条件下水浴加热反应，反应后通过离心洗涤，制备得到聚苯乙烯胶体颗粒；步骤A2，制备聚苯乙烯二维光子晶体阵列：将聚苯乙烯胶体颗粒分散成乳液，并与正丙醇混合，旋振后注射到水面上，用亲水性处理过的载玻片将所述聚苯乙烯胶体颗粒捞出并且在空气中干燥，得到聚苯乙烯二维光子晶体阵列，所述亲水性处理包括将载玻片浸泡在食人鱼溶液中，再用蒸馏水和无水乙醇依次清洗载玻片后用氮气吹干。

一种使用辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器检测过氧化氢的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，准备至少两片辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器，第一片置于不含有过氧化氢的磷酸盐缓冲液PBS中，将第二片辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器放入待测物中，所述辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器包括复合凝胶和光子晶体阵列，所述复合凝胶为片状结构，所述光子晶体阵列中的胶体颗粒均嵌合在所述片状结构表面上形成胶体颗粒分布层，所述复合凝胶为辣根过氧化酶HRP与牛血清白蛋白BSA复合并通过交联剂戊二醛GA交联而成的复合蛋白质水凝胶，所述复合蛋白质中的辣根过氧化酶HRP为识别分子蛋白质，所述复合蛋白质中的牛血清白蛋白BSA为不干扰识别的支架蛋白质；步骤2，按照预设时间使所述辣根过氧化酶HRP与被测物中可能存在的过氧化氢H₂O₂充分进行类过氧化氢酶反应后，将所述辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器取出，所述类过氧化氢酶反应中，辣根过氧化酶根据反应体系中过氧化氢的浓度而发生相应程度的失活，在失活过程中，辣根过氧化酶中血红素基团的卟啉大环的间亚甲基桥部位会受到过氧化氢的攻击而发生断裂，形成开链的线状四吡咯，从而导致蛋白质的展开而降低水凝胶的交联密度，使水凝胶发生相应的溶胀，而水凝胶的溶胀又使得光子晶体阵列中的胶体颗粒间距变大；步骤3，用激光分别照射第一片和第二片辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器，测量出第一片上光子晶体阵列衍射出的德拜环直径D和第二片上光子晶体阵列衍射出的德拜环直径D’，根据D与D’的差值确定被测物中的过氧化氢H₂O₂浓度，所述光子晶体阵列中的胶体颗粒间距变大使得光子晶体阵列衍射出的德拜环直径变小。

本发明公开了属于环境分析与疾病检测领域的一种新型传感器的制备方法。将聚苯乙烯胶体颗粒微球通过气液界面自组装，制备得到二维光子晶体。然后将辣根过氧化酶与牛血清白蛋白混合，溶解到磷酸盐缓冲(PBS)溶液中，将该混合溶液与适量戊二醛混合，铺展到二维光子晶体上进行反应，得到二维光子晶体辣根过氧化酶/牛血清白蛋白复合凝胶传感器。本发明制备的传感器具有优越的灵敏度和选择性，其最低检测限和线性检测范围均优于常见的光学传感器性能。本发明制备的二维光子晶体传感器不具有可循环使用的性能。

本发明的发明构思：牛血清白蛋白的表面上有34个赖氨酸残基，大量的赖氨酸基团可以方便的通过戊二醛交联法制得蛋白质水凝胶，因此可以作为辣根过氧化酶凝胶化的支架，有效地解决辣根过氧化物酶本身难以凝胶化的难题。当单色激光垂直入射在二维光子晶体阵列上时，由于德拜衍射会在二维光子晶体另一侧的屏幕上产生德拜环。二维光子晶体阵列中胶体颗粒间距的变化会引起德拜环直径发生相应的变化。在与过氧化氢的“类过氧化氢酶”反应中，辣根过氧化酶会根据反应体系中过氧化氢的浓度而发生相应程度的失活。在失活过程中，辣根过氧化酶中血红素基团的卟啉大环的间亚甲基桥部位会受到过氧化氢的攻击而发生断裂，形成开链的线状四吡咯，从而导致蛋白质的断链展开。水凝胶三维互联网络链上的酶蛋白的展开会降低水凝胶的交联密度，从而使水凝胶发生相应的溶胀。水凝胶的溶胀使附着在其表面的二维光子晶体阵列的胶体颗粒间距发生变化从而改变了德拜环直径的大小，通过测量德拜环直径的变化从而实现对过氧化氢的高灵敏度和选择性检测。

一种制备二维光子晶体复合水凝胶传感器的方法，其主要特征是采用牛血清白蛋白作为支架材料，与辣根过氧化酶混合后可制备得到含有辣根过氧化酶的智能凝胶材料。与二维光子晶体结合后，制备得到二维光子晶体复合水凝胶传感器，可用于H₂O₂的选择性检测。

一种新型的二维光子晶体复合水凝胶传感器，其中的识别分子蛋白质(酶)的活性不受支架蛋白质的干扰。其检测限为6.1×10^-5M，线性检测范围为0-1.0mM。

采用两种蛋白质(酶)混合的方式进行复合，且支架蛋白质(酶)不干扰识别分子蛋白质(酶)的活性。

蛋白质复合单体溶液与戊二醛稀溶液进行热交联，单体溶液浓度50-300mg/mL，戊二醛浓度5％-25％。

识别分子可以为采用任意一种含有少量赖氨酸基团的特异性蛋白质，牛血清白蛋白质表面含有大量的赖氨酸。识别分子辣根过氧化酶等蛋白质含有少量的赖氨酸。

将2种或者2种以上的蛋白质(酶)复合得到智能凝胶材料作为传感材料，二维光子晶体作为换能器。

该传感器具有较低的检测限(6.1×10^-5M)和较宽线性检测范围(0-1.0mM)，响应时间依据其厚度从3到5小时不等。

识别分子(辣根过氧化酶)的浓度和待测物质过氧化氢的pH会影响其检测灵敏度，该传感器中识别分子(辣根过氧化酶)的浓度越高，灵敏度越好，pH越高，灵敏度越高。

该传感器对H₂O₂具有选择性，对其它常见干扰物如葡萄糖、果糖、华法林钠、OP-10均没有响应性。

可以采用任意材料制备得到的二维光子晶体，通常为聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸甲酯，二氧化硅，ZnS,TiO₂等材料。

本发明涉及一种蛋白质(酶)分子由于缺少赖氨酸基团无法通过席夫(Schiff)碱反应采用戊二醛微交联制备智能凝胶材料的难题，通过将辣根过氧化酶与支架蛋白质牛血清白蛋白进行复合并交联得到水凝胶，制备得到二维光子晶体传感器的方法以及灵敏无标记可视化检测过氧化氢的方法。

本发明的制备方法包括以下步骤：

S1.合成聚苯乙烯微球：在氮气气氛下，将除掉氧气的蒸馏水、苯乙烯和过硫酸钾混合，在搅拌条件下水浴加热反应，反应后通过离心洗涤，制备得到聚苯乙烯微球；

S2.制备聚苯乙烯二维光子晶体：将聚苯乙烯微球分散成乳液，并与正丙醇混合，旋振后注射到水面上，用亲水性处理过的载玻片捞出并且在空气中干燥，得到聚苯乙烯二维光子晶体。

S3.制备二维光子晶体辣根过氧化酶蛋白质水凝胶传感器。

S3-1.制备预聚液：将辣根过氧化酶和牛血清白蛋白溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中备用。

S3-2.制备二维光子晶体蛋白质水凝胶：将预聚液与戊二醛混合后，将混合液滴在亲水性处理过的载玻片上，用附有二维光子晶体的载玻片盖在混合液上，反应后揭下水凝胶浸泡备用。

S4.检测过氧化氢：

S4-1.配置过氧化氢检测液：使用磷酸盐缓冲液稀释过氧化氢至相应浓度。

S4-2.确定传感器的最佳辣根过氧化酶含量：将水凝胶裁切成相同的尺寸，浸泡在相应浓度的过氧化氢检测液中至完全平衡，测量其德拜环直径。

S4-3.确定传感器的工作的最佳pH：将水凝胶裁切成相同的尺寸，浸泡在不同pH的过氧化氢检测液中至完全平衡，测量其德拜环直径。

S4-4.确定传感器的响应时间：将水凝胶裁切成相同的尺寸，浸泡在过氧化氢检测液中，每间隔一段时间测量一次德拜环直径至水凝胶完全平衡。

S4-5.确定传感器的选择性：将水凝胶裁切成相同的尺寸，浸泡在过氧化氢、葡萄糖、果糖、华法林钠、OP-10检测液中至水凝胶完全平衡，测量其德拜环直径。

根据本发明，具体地，步骤S1包括：把除氧后的98mL蒸馏水、6mL苯乙烯和0.08g过硫酸钾，在氮气气氛下间隔依次加入三口烧瓶中，以300r/min的速度搅拌，70℃水浴反应6小时后冷却至室温。以5000rpm离心30分钟，制备得到聚苯乙烯微球。

根据本发明，具体地，步骤S2包括：将步骤S1所得的聚苯乙烯微球分散在蒸馏水中，得到质量分数为15％的聚苯乙烯微球乳液。将200μL的聚苯乙烯微球乳液与100μL的正丙醇旋振混合1min得到混合液A，用1mL注射器吸取200μL混合液A备用。在塑料表面皿中注满蒸馏水，将注射器针头调整至针头切口的一半浸入水面的位置，缓慢在水面上铺满混合液A。用亲水性处理后的载玻片在表面皿边缘垂直插入水面，缓慢旋转至水平，然后缓慢捞出并且在空气中干燥，制得聚苯乙烯二维光子晶体；所述亲水处理的过程为，将载玻片浸泡在食人鱼溶液(浓硫酸：双氧水＝7:3，体积比)中24h，之后用蒸馏水和无水乙醇分别清洗，用氮气吹干后备用。

根据本发明，具体地，步骤S3-1包括：分别将25mg、50mg、70mg、75mg辣根过氧化酶和170mg牛血清白蛋白溶于1mL 0.1M PBS缓冲液(pH＝7.4)中备用。

根据本发明，具体地，步骤S3-2包括：将300μL步骤S3-1中配制的预聚液与55μL质量分数为5％的戊二醛混合旋振3s后得到混合液B，将混合液B滴在亲水性处理过的载玻片上，用步骤S2中制备的附有二维光子晶体模板的载玻片盖在混合液上，室温下反应3小时后揭下水凝胶，浸泡在0.01M PBS缓冲液(pH＝7.4)中，放在4℃冰箱中保存，期间换PBS缓冲液至少3次。

根据本发明，具体地，步骤S4-1包括：用0.01mM PBS缓冲液将过氧化氢稀释，得到0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM的过氧化氢检测液。

根据本发明，具体地，步骤S4-2包括：将步骤S3-2制备的辣根过氧化酶的水凝胶裁切成8cm×8cm的正方形薄膜，分别浸泡在步骤S4-1制备的0mM、0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM的过氧化氢检测液中，其中检测液的pH为7.4。等到水凝胶完全平衡后取出测量德拜环直径，其中样品距离屏幕的高度为7cm。

根据本发明，具体地，步骤S4-3包括：将步骤S4-2得到拥有最佳传感性能的水凝胶用于检测；重复步骤S4-2中的过氧化氢检测操作，其中检测液的pH分别为至6.0、7.4、9.0。

根据本发明，具体地，步骤S4-4包括：将步骤S4-2得到拥有最佳传感性能的水凝胶用于确定传感器的响应时间。将水凝胶裁切成8cm×8cm的正方形薄膜，浸泡在10mM的过氧化氢检测液中，其中检测液的pH为7.4。在浸泡30s、1min、5min、10min、20min、30min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h时测量德拜环直径。

根据本发明，具体地，步骤S4-5包括：将步骤S4-2得到拥有最佳响应性能的水凝胶用于确定传感器的响应时间。将水凝胶裁切成8cm×8cm的正方形薄膜，分别浸泡在10mM的过氧化氢、葡萄糖、果糖、华法林钠、OP-10检测液中，其中检测液的pH为7.4。等到水凝胶完全平衡后取出测量德拜环直径，其中样品距离屏幕的高度为7cm。

本发明首次采用双氧水诱导的酶催化反应导致的智能材料的体积相变化来检测H₂O₂在检测过氧化氢时优化了辣根过氧化酶和牛血清白蛋白的质量比(HRP：BSA＝15:34，w:w)、pH(9.0)。在接近人体生理条件的pH为7.4时，厚度为120微米的传感器在3小时内可达到响应平衡，操作简单。灵敏度高，线性范围为0-1.0mM，检出限是6.1×10^-5M。本发明的传感器不具有可逆性。

本发明提供了一种二维光子晶体蛋白质水凝胶传感器，该传感器基于辣根过氧化酶与过氧化氢的反应来检测过氧化氢的浓度，原料来源广泛，成本低廉，制备和检测过程操作简单，不需要贵重的仪器设备和专业的操作人员，具有广泛的应用前景。

用无皂乳液聚合法制备了聚苯乙烯微球。通过尖端导流气液界面自组装法制备了二维光子晶体胶体颗粒阵列模板。

以辣根过氧化酶和牛血清白蛋白为蛋白质单体，通过戊二醛热交联法将蛋白质水凝胶与二维光子晶体结合制得二维光子晶体辣根过氧化酶/牛血清白蛋白复合蛋白质水凝胶传感器。

当单色激光垂直入射在二维光子晶体阵列上时，由于德拜衍射会在二维光子晶体另一侧的屏幕上产生德拜环。二维光子晶体阵列中的胶体颗粒间距变化会引起德拜环直径发生相应的变化。

在与过氧化氢的“类过氧化氢酶”反应中，辣根过氧化酶会根据反应体系中过氧化氢的浓度而发生相应程度的失活。在失活过程中，辣根过氧化酶中血红素基团的卟啉大环的间亚甲基桥部位会受到过氧化氢的攻击而发生断裂，形成开链的线状四吡咯，从而导致蛋白质的断链展开。水凝胶三维互联网络链上的酶蛋白的展开会降低水凝胶的交联密度，从而使水凝胶发生相应的溶胀。水凝胶的溶胀使附着在其表面的二维光子晶体阵列的胶体颗粒间距发生变化从而改变了德拜环直径的大小。

辣根过氧化酶的表面上仅有6个赖氨酸残基，而只有其中的3个可以作为戊二醛的交联点，因此仅利用辣根过氧化酶作为单体很难得到成型的蛋白质水凝胶。本发明使用牛血清白蛋白作为辣根过氧化酶的支架，将二者通过戊二醛热交联制备成具有可操作强度的复合蛋白质水凝胶。

作为优选，本发明中的牛血清白蛋白和辣根过氧化酶的质量比为34:15，戊二醛的质量浓度为5wt％，单体溶液与戊二醛的体积比为60:11，反应条件为室温3小时。

在以上优选条件下，本发明在0-1mM的过氧化氢浓度范围具有很好的线性响应，响应时间为3小时。

实施案例1，将75mg辣根过氧化酶和170mg牛血清白蛋白溶于1mL PBS缓冲液(0.1M,pH＝7.4)中，再将55μL 5wt％戊二醛加入300μl蛋白质单体溶液中，旋振5s后迅速滴加在亲水性处理后的玻璃片上，再将附有二维光子晶体模板的玻璃片盖在其上，室温下反应3小时。

将反应后的蛋白质水凝胶揭下后，浸泡在PBS缓冲液(0.01M,pH＝7.4)中，放在4℃的冰箱中冷藏至少24小时(期间至少换PBS缓冲液3次)。

将浸泡完的蛋白质水凝胶裁切成变成边长为8cm的正方形，再放到不同浓度的过氧化氢PBS缓冲液(0.01M,pH＝7.4)中进行检测。

实施案例2，参见图3。

1.将75mg辣根过氧化酶和170mg牛血清白蛋白溶于1mL PBS缓冲液(0.1M,pH＝7.4)中，再将55μL浓度5wt％戊二醛加入300μL蛋白质单体溶液中，旋振5s后迅速滴加在亲水性处理后的玻璃片上，再将附有二维光子晶体模板的玻璃片盖在其上，室温下反应3小时。

将反应后的蛋白质水凝胶揭下后，浸泡在PBS缓冲液(0.01M,pH＝7.4)中，放在4℃的冰箱中冷藏24小时(期间至少换PBS缓冲液3次)。

2.将70mg辣根过氧化酶和170mg牛血清白蛋白溶于1mL PBS缓冲液(0.1M,pH＝7.4)中，再将55μL浓度5wt％戊二醛加入300μL蛋白质单体溶液中，旋振5s后迅速滴加在亲水性处理后的玻璃片上，再将附有二维光子晶体模板的玻璃片盖在其上，室温下反应3小时。

将反应后的蛋白质水凝胶揭下后，浸泡在PBS缓冲液(0.01M,pH＝7.4)中，放在4℃的冰箱中冷藏24小时(期间至少换PBS缓冲液3次)。

3.将50mg辣根过氧化酶和170mg牛血清白蛋白溶于1mL PBS缓冲液(0.1M,pH＝7.4)中，再将55μL浓度5wt％戊二醛加入300μL蛋白质单体溶液中，旋振5s后迅速滴加在亲水性处理后的玻璃片上，再将附有二维光子晶体模板的玻璃片盖在其上，室温下反应3小时。

将反应后的蛋白质水凝胶揭下后，浸泡在PBS缓冲液(0.01M,pH＝7.4)中，放在4℃的冰箱中冷藏24小时(期间至少换PBS缓冲液3次)。

4.将25mg辣根过氧化酶和170mg牛血清白蛋白溶于1mL PBS缓冲液(0.1M,pH＝7.4)中，再将55μL浓度5wt％戊二醛加入300μL蛋白质单体溶液中，旋振5s后迅速滴加在亲水性处理后的玻璃片上，再将附有二维光子晶体模板的玻璃片盖在其上，室温下反应3小时。

将反应后的蛋白质水凝胶揭下后，浸泡在PBS缓冲液(0.01M,pH＝7.4)中，放在4℃的冰箱中冷藏24小时(期间至少换PBS缓冲液3次)。

作为优选，本发明中的BSA和HRP的质量比为34:15，戊二醛的质量浓度为5wt％，单体溶液与戊二醛的体积比为60:11，反应条件为室温3小时。

在以上优选条件下，本发明在0-1mM的过氧化氢浓度范围具有很好的线性响应，响应时间为3小时。

实施案例3，参见图4。

将75mg辣根过氧化酶和170mg牛血清白蛋白溶于1mL PBS缓冲液(0.1M,pH＝6.0)中，再将55μL浓度5wt％戊二醛加入300μL蛋白质单体溶液中，旋振5s后迅速滴加在亲水性处理后的玻璃片上，再将附有二维光子晶体模板的玻璃片盖在其上，室温下反应3小时。

将反应后的蛋白质水凝胶揭下后，浸泡在PBS缓冲液(0.01M,pH＝6.0)中，放在4℃的冰箱中冷藏至少24小时(期间至少换PBS缓冲液3次)。

将75mg辣根过氧化酶和170mg牛血清白蛋白溶于1mL PBS缓冲液(0.1M,pH＝9.0)中，再将55μL浓度5wt％戊二醛加入300μL蛋白质单体溶液中，旋振5s后迅速滴加在亲水性处理后的玻璃片上，再将附有二维光子晶体模板的玻璃片盖在其上，室温下反应3小时。

将反应后的蛋白质水凝胶揭下后，浸泡在PBS缓冲液(0.01M,pH＝9.0)中，放在4℃的冰箱中冷藏至少24小时(期间至少换PBS缓冲液3次)。

参考图1，HRP为辣根过氧化酶，表面上只有3个赖氨酸，难以与戊二醛交联形成辣根过氧化酶凝胶。BSA为牛血清白蛋白，表面上有34个赖氨酸，足够与辣根过氧化酶和戊二醛交联形成辣根过氧化酶牛血清白蛋白复合凝胶。GA为戊二醛，能够与蛋白质上的赖氨酸通过席夫碱反应形成凝胶。

参考图2，激光垂直入射在二维光子晶体阵列上会衍射出德拜环。辣根过氧化酶复合蛋白水凝胶与过氧化氢反应后，凝胶发生膨胀，附在凝胶上的二维光子晶体中的胶体颗粒间距随着凝胶的膨胀而发生增大。这些胶体颗粒间距增加会导致德拜环直径减小。

参考图5，纵坐标为胶体颗粒间距，横坐标为检测液中过氧化氢的浓度。图5中上方线为辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器对H₂O₂的响应曲线。上方线下方的照片为传感器在光线下的实物图，从左到右共六个传感器，分别反映了在对应于红线上六个检测点的不同浓度过氧化氢检测液中传感器的颜色，从左到右检测液中过氧化氢的浓度分别为0mM、0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM，从左到右传感器的颜色分别为绿色、黄绿色、黄绿色、黄色、橙色、红色。图5中下方线为牛血清白蛋白水凝胶，该凝胶在过氧化氢浓度为0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM的检测液中均几乎没有响应。证明辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器对H₂O₂的检测具有良好的选择性。

实施案例4，参见图6。

将75mg辣根过氧化酶和170mg牛血清白蛋白溶于1mL PBS缓冲液(0.1M,pH＝7.4)中，再将55μL浓度5wt％戊二醛加入300μL蛋白质单体溶液中，旋振5s后迅速滴加在亲水性处理后的玻璃片上，再将附有二维光子晶体模板的玻璃片盖在其上，室温下反应3小时。

将反应后的蛋白质水凝胶揭下后，浸泡在PBS缓冲液(0.01M,pH＝7.4)中，放在4℃的冰箱中冷藏至少24小时(期间至少换PBS缓冲液3次)。

将浸泡完的蛋白质水凝胶裁切成8cm×8cm的正方形薄膜，再放到10mM的过氧化氢、葡萄糖、果糖、华法林钠、OP-10的PBS缓冲液(0.01M,pH＝7.4)中进行检测。

参考图6，纵坐标为胶体颗粒间距变化量(增加量，nm为纳米，Particle SpacingChange)，刻度值包括0-10-20-30-40-50-60-70-80-90。图6中包括HRP/BSA-75水凝胶对5种试剂的响应性能，试剂名称从左到右依次为过氧化氢(H₂O₂)，葡萄糖(D-glucose)，果糖(D-fructose)，华法林钠(Warfarin sodium)，OP-10。该凝胶在过氧化氢的检测液中具有较大的响应，而在葡萄糖、果糖、华法林钠、OP-10的检测液中均几乎没有响应。证明辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器在众多待测物中可以选择性地检测。

本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。在此指明，以上叙述有助于本领域技术人员理解本发明创造，但并非限制本发明创造的保护范围。任何没有脱离本发明创造实质内容的对以上叙述的等同替换、修饰改进和/或删繁从简而进行的实施，均落入本发明创造的保护范围。

Claims (6)

1.一种辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器，其特征在于，包括复合凝胶和光子晶体阵列，所述复合凝胶为片状结构，所述光子晶体阵列中的胶体颗粒均嵌合在所述片状结构表面上形成胶体颗粒分布层，所述复合凝胶为辣根过氧化酶HRP与牛血清白蛋白BSA复合并通过交联剂戊二醛GA交联而成的复合蛋白质水凝胶，所述复合蛋白质中的辣根过氧化酶HRP为识别分子蛋白质，所述复合蛋白质中的牛血清白蛋白BSA为不干扰识别的支架蛋白质；

所述光子晶体阵列为二维光子晶体阵列；

所述辣根过氧化酶HRP用于识别过氧化氢H₂O₂，在与过氧化氢的“类过氧化氢酶”反应中，辣根过氧化酶根据反应体系中过氧化氢的浓度而发生相应程度的失活，在失活过程中，辣根过氧化酶中血红素基团的卟啉大环的间亚甲基桥部位会受到过氧化氢的攻击而发生断裂，形成开链的线状四吡咯，导致识别分子蛋白质的断链展开，所述展开引起复合凝胶的体积膨胀，光子晶体阵列中的胶体颗粒间距随着复合凝胶的体积膨胀而变大，变大的胶体颗粒间距使得光子晶体阵列衍射出的德拜环直径变小，从而实现针对过氧化氢检测的定性传感或定量传感；

所述复合凝胶中具有以下质量比，辣根过氧化酶HRP:牛血清白蛋白BSA＝25～75:170，所述传感器对过氧化氢的检测限为6.1×10^-5M，线性检测范围为0-1.0mM。

2.根据权利要求1所述的辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器，其特征在于，所述戊二醛GA交联包括戊二醛GA与蛋白质分子表面上的赖氨酸发生席夫碱反应，所述蛋白质分子包括表面上具有3个赖氨酸残基的辣根过氧化酶HRP和表面上具有34个赖氨酸残基的牛血清白蛋白BSA。

3.根据权利要求1所述的辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器，其特征在于，所述光子晶体阵列中的胶体颗粒为聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯或SiO₂或ZnS或TiO₂，所述光子晶体阵列是采用尖端导流气液界面自组装法制备的二维光子晶体胶体颗粒阵列形成。

4.一种如权利要求1-3之一所述辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A，分别制备出光子晶体阵列和复合凝胶预聚液，所述复合凝胶预聚液是将辣根过氧化酶HRP和牛血清白蛋白BSA溶于磷酸盐缓冲液PBS中而成；

步骤B，将所述复合凝胶预聚液与交联剂戊二醛GA混合成第一混合液，将所述第一混合液铺展在所述光子晶体阵列上进行交联反应以形成复合蛋白质水凝胶，所述光子晶体阵列中的胶体颗粒均嵌合在所述复合蛋白质水凝胶中形成胶体颗粒分布层，所述复合蛋白质中的辣根过氧化酶HRP为识别分子蛋白质，所述复合蛋白质中的牛血清白蛋白BSA为不干扰识别的支架蛋白质；

步骤C，将结合了光子晶体阵列的复合蛋白质水凝胶裁切成具有规格尺寸的片状物即得辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器。

5.根据权利要求4所述的辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤A中的光子晶体阵列的制备包括步骤A1，合成聚苯乙烯胶体颗粒：在氮气气氛下，将苯乙烯、过硫酸钾和除氧的蒸馏水混合，在搅拌条件下水浴加热反应，反应后通过离心洗涤，制备得到聚苯乙烯胶体颗粒；步骤A2，制备聚苯乙烯二维光子晶体阵列：将聚苯乙烯胶体颗粒分散成乳液，并与正丙醇混合，旋振后注射到水面上，用亲水性处理过的载玻片将所述聚苯乙烯胶体颗粒捞出并且在空气中干燥，得到聚苯乙烯二维光子晶体阵列，所述亲水性处理包括将载玻片浸泡在食人鱼溶液中，再用蒸馏水和无水乙醇依次清洗载玻片后用氮气吹干。

6.一种使用如权利要求1-3之一所述辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器检测过氧化氢的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，准备至少两片辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器，第一片置于不含有过氧化氢的磷酸盐缓冲液PBS中，将第二片辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器放入待测物中，所述辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器包括复合凝胶和光子晶体阵列，所述复合凝胶为片状结构，所述光子晶体阵列中的胶体颗粒均嵌合在所述片状结构表面上形成胶体颗粒分布层，所述复合凝胶为辣根过氧化酶HRP与牛血清白蛋白BSA复合并通过交联剂戊二醛GA交联而成的复合蛋白质水凝胶，所述复合蛋白质中的辣根过氧化酶HRP为识别分子蛋白质，所述复合蛋白质中的牛血清白蛋白BSA为不干扰识别的支架蛋白质；

步骤2，按照预设时间使所述辣根过氧化酶HRP与被测物中可能存在的过氧化氢H₂O₂充分进行类过氧化氢酶反应后，将所述辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器取出，所述类过氧化氢酶反应中，辣根过氧化酶根据反应体系中过氧化氢的浓度而发生相应程度的失活，在失活过程中，辣根过氧化酶中血红素基团的卟啉大环的间亚甲基桥部位会受到过氧化氢的攻击而发生断裂，形成开链的线状四吡咯，从而导致蛋白质的展开而降低水凝胶的交联密度，使水凝胶发生相应的溶胀，而水凝胶的溶胀又使得光子晶体阵列中的胶体颗粒间距变大；

步骤3，用激光分别照射第一片和第二片辣根过氧化酶复合凝胶光子晶体传感器，测量出第一片上光子晶体阵列衍射出的德拜环直径D和第二片上光子晶体阵列衍射出的德拜环直径D’，根据D与D’的差值确定被测物中的过氧化氢浓度，所述光子晶体阵列中的胶体颗粒间距变大使得光子晶体阵列衍射出的德拜环直径变小。