CN110455768A - 一种基于表面增强拉曼光谱的蛋白质检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于表面增强拉曼光谱的蛋白质检测方法,该方法包括以下步骤:1)利用光子晶体微球为模板制备带有氨基的水凝胶微球;2)在带有氨基的水凝胶微球上修饰醛基与抗体分子;3)利用抗原抗体之间的特异性吸附,将修饰有抗体分子的微球置于待检蛋白溶液中,抓取抗原蛋白质分子,然后对微球做银染处理;4)将上述银染后的微球置于拉曼光谱仪下检测。该方法设计原理巧妙、成本低廉、特异性强适用面广,又能维持蛋白质的水相环境,因而保持蛋白石的活性又能反应蛋白质的指纹信息,解决了蛋白质检测方面特异性差、适用面窄、不能反映蛋白指纹信息以及蛋白易失活的缺点,因此可用于临床检验。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料领域、生物检测领域及拉曼光谱检测技术领域,具体是一种基于表面增强拉曼光谱的蛋白质检测方法。
背景技术
随着生物技术以及蛋白质组学的发展,随之涌现出来的关键问题之一是蛋白质的检测与鉴定,而传统的蛋白检测手段如质谱(MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)等有一些自身固有的缺点,如MS设备昂贵、ELISA有假阳性的问题等。
近年来,由于其无创性、用途广泛性以及高灵敏度,表面增强拉曼光谱(SERS)技术已经越来越多的被引入生物领域的应用,比如单分子检测、细胞成像以及临床研究等。与此同时人们也逐渐将SERS技术用于检测蛋白质。例如吉林大学的赵冰研究组在western blot基础上开发的western SERS技术大大简化了蛋白质检测的流程。Kahraman等人直接将蛋白质银溶胶混合,然后用SERS技术检测蛋白质是一种简便易行的方案。但是诸如此类的方法特异性较差,很难从诸如带电性、pH值、分子量等蛋白质自身特性对多种多样的蛋白质做到分离的目的。为了克服蛋白质之间特异性的问题,人们又将拉曼活性标签接枝到待检蛋白质上,以检测拉曼标签的方法达到间接检测蛋白质的目的。首先这些间接的手段不能反映蛋白的指纹信息又使得检测过程变得复杂,还带来蛋白在偶联标签过程中失活的风险。虽然可以从蛋白质混合溶液的拉曼光谱上分析蛋白质组分信息,但是不同蛋白具有相同谱峰的可能性仍然较大,因为拉曼光谱的峰反映的是分子的化学键信息,具有相同化学键或者氨基酸基团的蛋白质拉曼光谱谱峰发生重叠的几率也是相当大的。
基于上述对SERS技术检测蛋白质方面的分析,最佳的蛋白质SERS检测方法应该是在蛋白质分离方面特异性强、检测手段简便、SERS光谱分析容易。因此,设计一种特异性强、适用面广、检测过程中能保持蛋白质活性以及能够反映蛋白质指纹信息的SERS检测技术成为亟待解决的问题。
发明内容
技术问题:针对蛋白质检测方面特异性差、适用面窄、不能反映蛋白指纹信息以及蛋白易失活的缺点,本发明提供一种基于表面增强拉曼光谱的蛋白质检测方法,该方法充分利用了抗原抗体的特异性结合以及SERS的指纹特征,理论上可实现对任意蛋白的检测,而且本方法流程简便、操作性强,成本低廉、特异性强适用面广,通过控制银染时间可实现不同浓度梯度的蛋白检测;另外该检测方法始终保持水相环境、无标记,降低了蛋白失活的风险保持蛋白石的活性,结果也充分反映蛋白拉曼指纹光谱,这种微米级的水凝胶光子晶体微球检测载体可以方便地与生物芯片集成,可实现蛋白分离、检测的一体化,多元化,可用于临床检验。
技术方案:本发明提供了一种基于表面增强拉曼光谱的蛋白质检测方法,该方法包括以下步骤:
1)利用光子晶体微球为模板制备带有氨基的水凝胶微球;
2)在带有氨基的水凝胶微球上修饰醛基与抗体分子;
3)利用抗原抗体之间的特异性吸附,将修饰有抗体分子的微球置于待检蛋白溶液中,抓取抗原蛋白质分子,然后对微球做银染处理;
4)将上述银染后的微球置于拉曼光谱仪下检测。
其中:
所述的水凝胶微球包括包括聚丙烯酰胺水凝胶微球、壳聚糖微球、聚多巴胺微球、聚乙烯亚胺微球。
所述的带有氨基的水凝胶微球具有反蛋白石结构,其直径为150~250μm。
所述的利用光子晶体微球为模板制备带氨基水凝胶微球的制备方法如下:将粒径为200~290nm的光子晶体微球浸泡在水凝胶前驱体中2~4h,而后经紫外聚合30~60s使前驱体固化形成水凝胶,依次反复将水凝胶置于50~60℃和0~4℃水中,由于水凝胶的收缩与溶胀,光子晶体微球就很容易从水凝胶中剥离出来,最后将剥离出来的微球浸泡在1~2%HF溶液中以去除氧化硅模板剩下带氨基的水凝胶反蛋白石结构微球。
步骤2)所述的修饰醛基所用的试剂为质量分数为3~5%戊二醛溶液,利用了氨基和醛基的席夫碱反应原理,反应时间为0.5~2h。
步骤2)所述的在带有氨基的水凝胶微球上修饰醛基与抗体分子中,采用的方法为化学偶联法。
步骤2)所述的抗体分子包括肌红蛋白抗体、血红蛋白抗体以及细胞色素C抗体,或者其他待测分子的抗体,如甲胎蛋白抗体、癌胚抗原抗体等。
步骤2)所述在带有氨基的水凝胶微球上修饰醛基与抗体分子的具体操作如下:将带有氨基的水凝胶微球依次置于质量分数为3~5%戊二醛溶液和抗体分子的PBS溶液中,之后取出微球洗掉多余抗体子后再将微球置于1~2%牛血清白蛋白溶液中,封阻非特异性位点,其修饰醛基与抗体分子的原理是氨基与醛基可以形成Shiff碱基,从而将抗体分子通过化学偶联的办法牢牢的连接到水凝胶骨架上。
步骤3)所述的将修饰有抗体分子的微球置于待检蛋白溶液中的时长为1~2h,待检蛋白溶液的浓度为0.01~100μg/ml。
步骤3)所述的对微球做银染处理是指在常温下,将抓取抗原蛋白质分子后的微球浸泡在银溶胶中5min~6h,光子晶体水凝胶中三维多孔结构以及偶联到水凝胶上的蛋白分子的疏水作用以及静电作用力,银纳米粒子很容易负载到水凝胶光子晶体微球上。
所述的银溶胶中银纳米粒子的直径为20~30nm。
步骤4)所述的将上述银染后的微球置于拉曼光谱仪下检测,是指将银染后的微球洗净后置于共聚焦拉曼光谱仪下,调节焦距选择合适波长的激光打在微球的顶端,然后检测蛋白质的拉曼信号,优选532nm波长的激光。
有益效果:与传统的SERS技术检测蛋白相比较而言,本发明具有以下优点:
1、特异性强、适用面广:传统的SERS检测手段蛋白质分离效果比较差,仅仅通过带电性、pH值以及分子量的不同难以从根本上分离蛋白,因此特异性差,仅仅适用于性质差异较大的蛋白,如带电荷相反、酸碱性不同等;本发明基于抗原抗体特异性结合抓取特定蛋白的方法克服了传统方法的不足,因为蛋白质多样化的本质在于蛋白三维构型的不同,因此利用蛋白这种本质上的不同是分离蛋白的最佳方法,理论上是可以分离所有蛋白的方法,适用性广泛;
2、流程简便、操作性强:本发明主要包含两大主要步骤,第一步是对蛋白质的分离提纯,第二步是银染后的SERS检测。操作人员甚至不需要有很强的专业知识背景,只要能找到相关的抗原抗体体系就可以得到想要蛋白的SERS信号;
3、增强效果好、指纹特性:水凝胶光子晶体微球具有三维多孔周期结构,而银染过程正是无规则分布的银纳米粒子逐渐形成宏观有序排列的过程,而银纳米粒团聚后的二聚体、三聚体等所形成的“热点”分布可以从宏观上得以控制,增强了SERS基底的均一性;另外通过控制银染时间,可以得到不同增强倍数的蛋白SERS信号,因而理论上低浓度蛋白的SERS信号通过延长银染时间就可以实现;由于所检测蛋白不需要额外连接拉曼信号标签,并且从蛋白分离到最终检测微球始终处于水相环境,蛋白质的三维结构得以保持从而降低了蛋白的失活风险;综合以上所述,所检测到的SERS信号来源于蛋白分子本身,SERS技术的指纹特性得以充分发挥,因而理论上所有蛋白分子都可以用此方法检测;
4、可扩展性高:以接枝抗体分子的水凝胶光子晶体微球为结合载体,抓取特定蛋白银染后便可做蛋白检测,可以方便地与生物芯片集成,达到蛋白分离、检测的一体化,促进了分析系统的微型化和自动化;
5、本发明提供的检测方法可以检测单组份或者多组分蛋白。
附图说明
图1为本发明基于表面增强拉曼光谱的蛋白检测方法的技术方案示意图与化学原理图;
图2为水凝胶微球以及银染不同时长水凝胶微球的扫描电子显微镜(SEM)图;图中A是反蛋白石结构聚丙烯酰胺水凝胶,B为银染5分钟的反蛋白石结构聚丙烯酰胺水凝胶、C为银染15分钟的反蛋白石结构聚丙烯酰胺水凝胶、D为银染30分钟的反蛋白石结构聚丙烯酰胺水凝胶;
图3为蛋白质的拉曼信号图及其对应的浓度梯度曲线示意图,其中A为不同浓度肌红蛋白(Mb)的拉曼信号图、B为不同浓度细胞色素C(Cyt C)的拉曼信号图、C为不同浓度血红蛋白(Hb)的拉曼信号图,D为不同浓度肌红蛋白(Mb)拉曼特征峰的浓度-拉曼强度曲线图、E为不同浓度细胞色素C(Cyt C)拉曼特征峰的浓度-拉曼强度曲线图、F为不同浓度血红蛋白(Hb)拉曼特征峰的浓度-拉曼强度曲线图;
图4为使用本发明提供的检测方法对Mb-Cyt C二元蛋白混合溶液以及Mb-Cyt C-Hb三元蛋白混合溶液进行蛋白质多元检测的主成分分析(PCA)图,其中A图和B图是针对细胞色素C和肌红蛋白的二元检测、C图是三种蛋白分子的多元检测。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步的说明。
一种基于表面增强拉曼光谱的蛋白质检测方法(如图1所示),包括以下步骤:
1)对水凝胶醛基化后通过Shiff碱基反应在水凝胶上接枝抗体分子;
2)利用抗原抗体的特异性吸附作用从待检体系中吸附特定蛋白分子;
3)将吸附有待检蛋白分子的水凝胶微球银染后置于拉曼光谱仪下检测其SERS信号。
水凝胶微球以及银染不同时长水凝胶微球的扫描电子显微镜(SEM)图(如图2所示),从图中可以明显看出水凝胶是反蛋白石结构,其中的孔洞相互贯穿形成三维网络,右边四幅图是水凝胶微球银染5min,10min,15min以及1小时的SEM图。从图中可以看出,随着银染时间的增加,负载到水凝胶上的银纳米粒子逐渐增多,并会形成二聚体、三聚体等团聚体,而“热点”正是来自于这些团聚体中粒子间的空隙。
以下结合实施例对本发明作进一步的描述,但本发明不局限于下述实施例。
实施例1
一种基于表面增强拉曼光谱检测肌红蛋白方法,包括以下步骤:
1)利用光子晶体微球为模板制备带有氨基的聚丙烯酰胺水凝胶微球:将粒径200~290nm的光子晶体微球浸泡在聚丙烯酰胺水凝胶前驱体中2h,而后经紫外聚合60s使前驱体固化形成聚丙烯酰胺水凝胶,依次反复将水凝胶置于60℃和0℃水中,由于水凝胶的收缩与溶胀,光子晶体微球就很容易从水凝胶中剥离出来,最后将剥离出来的微球浸泡在2%HF溶液中以去除氧化硅模板,得到带有氨基的聚丙烯酰胺水凝胶反蛋白石结构微球;
2)选择粒径150μm的带有氨基的聚丙烯酰胺水凝胶微球为载体,将其放置在质量分数3%的戊二醛溶液中浸泡0.5h,用PBS溶液清洗微球后再置于浓度均为150μg/ml的兔抗鼠Mb抗体的PBS溶液中接枝抗体,洗去多余抗体后再将微球置于质量分数为1%牛血清白蛋白溶液中,封阻非特异性位点,得到修饰有醛基与兔抗鼠Mb抗体分子的水凝胶微球;
3)将修饰有醛基与兔抗鼠Mb抗体分子的水凝胶微球洗净后分别放于相应的不同浓度肌红蛋白蛋白溶液中(肌红蛋白选取0.01~100μg/ml五个浓度梯度,每个梯度增大十倍,浸泡时间为1h),然后再用PBS溶液将微球冲洗干净,之后将微球浸泡在粒径为20nm的银纳米粒子水凝胶溶液中5min进行银染,最后捞起微球用PBS溶液冲洗干净,备用;
4)将步骤3)得到的备用微球置于拉曼光谱仪下进行SERS检测。
图3中的A为图不同浓度梯度的肌红蛋白做SERS检测,从图中可以看出对肌红蛋白最低检测浓度可以达到2.73μM(0.01μg/ml),图3中的D图是肌红蛋白两个特征峰所做的蛋白质浓度-特征峰强度曲线,从图中可以看出特征峰强度与浓度的常用对数成正比;从本实例来看,本方法可以对肌红蛋白不同浓度梯度做定量检测。
实施例2
一种基于表面增强拉曼光谱检测细胞色素C方法,包括以下步骤:
1)利用光子晶体微球为模板制备壳聚糖水凝胶微球:将粒径200~290nm的光子晶体微球浸泡在壳聚糖水凝胶前驱体中4h,而后经紫外聚合30s使前驱体固化形成壳聚糖水凝胶,依次反复将水凝胶置于50℃和4℃水中,由于水凝胶的收缩与溶胀,光子晶体微球就很容易从水凝胶中剥离出来,最后将剥离出来的微球浸泡在1%HF溶液中以去除氧化硅模板,得到带有氨基的壳聚糖水凝胶反蛋白石结构微球;
2)选择粒径200μm带有氨基的壳聚糖水凝胶微球为载体,将其放置在质量分数4%的戊二醛溶液中浸泡1h;用PBS溶液清洗微球后再置于浓度均为200μg/ml的细胞色素C抗体的PBS溶液中接枝抗体,洗去多余抗体后再将微球置于质量分数为1.5%牛血清白蛋白溶液中,封阻非特异性位点,得到修饰有醛基与细胞色素C抗体分子的水凝胶微球;
3)将修饰有醛基与细胞色素C抗体分子的水凝胶微球洗净后分别放于相应的不同浓度细胞色素C溶液中(细胞色素C溶液选取0.01~100μg/ml五个浓度梯度,每个梯度增大十倍)浸泡时间为1.5h,然后再用PBS溶液将微球冲洗干净,之后将微球浸泡在粒径为25nm的银纳米粒子水凝胶溶液中3h进行银染,最后捞起微球用PBS溶液冲洗干净,备用;
4)将步骤3)得到的备用微球置于拉曼光谱仪下进行SERS检测。
图3中B图为不同浓度梯度的细胞色素C中做SERS检测,从图中可以看出对细胞色素C最低检测浓度可以达到4.505μM(0.01μg/ml);图3中E图是细胞色素C两个特征峰所做的蛋白质浓度-特征峰强度曲线,从图中可以看出特征峰强度与浓度的常用对数成正比;从本实例来看,本方法可以对细胞色素C不同浓度梯度做定量检测。
实施例3
一种基于表面增强拉曼光谱检测血红蛋白方法,包括以下步骤:
1)利用光子晶体微球为模板制备聚多巴胺水凝胶微球:将粒径200~290nm的光子晶体微球浸泡在聚多巴胺水凝胶前驱体中3h,而后经紫外聚合40s使前驱体固化形成聚多巴胺水凝胶,依次反复将水凝胶置于54℃和1℃水中,由于水凝胶的收缩与溶胀,光子晶体微球就很容易从水凝胶中剥离出来,最后将剥离出来的微球浸泡在1.2%HF溶液中以去除氧化硅模板,得到带有氨基的聚多巴胺水凝胶反蛋白石结构微球;
2)选择粒径250μm的带有氨基的聚多巴胺水凝胶微球为载体,将其放置在质量分数5%的戊二醛溶液中浸泡2h,用PBS溶液清洗微球后再置于浓度均为250μg/ml的血红蛋白抗体的PBS溶液中接枝抗体,洗去多余抗体后再将微球置于质量分数为2%牛血清白蛋白溶液中,封阻非特异性位点,得到修饰有醛基与血红蛋白抗体分子的水凝胶微球;
3)将修饰有醛基与血红蛋白抗体分子的水凝胶微球洗净后分别放于相应的不同浓度血红蛋白蛋白溶液中(血红蛋白选取0.01~100μg/ml五个浓度梯度,每个梯度增大十倍)浸泡时间为2h,然后再用PBS溶液将微球冲洗干净,然后将微球浸泡在粒径为30nm的银纳米粒子水凝胶溶液中6h进行银染,最后捞起微球用PBS溶液冲洗干净,备用;
4)将步骤3)得到的备用微球置于拉曼光谱仪下进行SERS检测。
图3中图C为不同浓度梯度的血红蛋白做SERS检测,从图中可以看出对血红蛋白最低检测浓度可以达到775nM(0.01μg/ml);图3中图F是血红蛋白两个特征峰所做的蛋白质浓度-特征峰强度曲线,从图中可以看出特征峰强度与浓度的常用对数成正比;从本实例来看,本方法可以对血红蛋白不同浓度梯度做定量检测。
实施例4
一种基于表面增强拉曼光谱检测蛋白多组分的方法,包括以下步骤:
1)利用光子晶体微球为模板制备聚乙烯亚胺水凝胶微球:将粒径200~290nm的光子晶体微球浸泡在聚乙烯亚胺水凝胶前驱体中3.5h,而后经紫外聚合50s使前驱体固化形成聚乙烯亚胺水凝胶,依次反复将水凝胶置于58℃和2℃水中,由于水凝胶的收缩与溶胀,光子晶体微球就很容易从水凝胶中剥离出来,最后将剥离出来的微球浸泡在1.5%HF溶液中以去除氧化硅模板,得到带有氨基的聚乙烯亚胺水凝胶反蛋白石结构微球;
2)选择粒径150μm的带有氨基的聚乙烯亚胺水凝胶微球为载体,将其放置在质量分数4%的戊二醛溶液中浸泡1h,用PBS溶液清洗微球后再置于浓度均为200μg/ml的肌红蛋白(Mb)抗体、血红蛋白(Hb)抗体以及细胞色素C(Cyt C)抗体的PBS溶液中接枝抗体,洗去多余抗体后再将微球置于质量分数为1%牛血清白蛋白溶液中,封阻非特异性位点,得到修饰有醛基与多种蛋白抗体分子的水凝胶微球,使用PBS溶液洗净微球后备用;
3)利用抗原抗体之间的特异性吸附抓取抗原蛋白质分子:
①配制浓度为27.3μM(0.1μg/ml)的Mb溶液、7.75μM(0.1μg/ml)的Hb溶液、45.05μM(0.1μg/ml)的Cyt C溶液;
②将接枝有Mb抗体和Hb抗体的微球浸泡27.3μM和7.75μM的Mb和Hb的单组份溶液中做蛋白特异性测试;
③以体积比1:1:1将Mb溶液、Hb溶液和Cyt C溶液混合作为三元检测体系,将接枝有Mb抗体、Cyt C抗体和Hb抗体的微球浸泡在三元检测体系中孵育反应1.5h,之后经银染1h捞起微球用PBS溶液冲洗干净,备用;
4)将步骤3)得到的备用微球置于拉曼光谱仪下进行SERS检测:每种微球各设置五颗,每颗测试五次选取其均值(激光波长为532nm,功率为1.2mW,积分时间为10s,感兴趣波数区为400~1800cm-1)。
将得到的拉曼光谱导入到IBM SPSS Statistics 22软件中做主成分分析(PCA),所绘制的图形如图4所示。从图4中图A和图B中看出,该方法对蛋白质检测特异性较强,从图4中图C来看,三种蛋白被完全区分开,说明本方法具备多元检测的能力。
Claims (9)
1.一种基于表面增强拉曼光谱的蛋白质检测方法,其特征在于:该方法包括以下步骤:
1)利用光子晶体微球为模板制备带有氨基的水凝胶微球;
2)在带有氨基的水凝胶微球上修饰醛基与抗体分子;
3)利用抗原抗体之间的特异性吸附,将修饰有抗体分子的微球置于待检蛋白溶液中,抓取抗原蛋白质分子,然后对微球做银染处理;
4)将上述银染后的微球置于拉曼光谱仪下检测。
2.如权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱的蛋白质检测方法,其特征在于:所述的带有氨基的水凝胶微球包括聚丙烯酰胺水凝胶微球、壳聚糖微球、聚多巴胺微球、聚乙烯亚胺微球。
3.如权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱的蛋白质检测方法,其特征在于:所述的带有氨基的水凝胶微球具有反蛋白石结构,其直径为150~250μm。
4.如权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱的蛋白质检测方法,其特征在于:步骤2)所述的修饰醛基所用的试剂为质量分数为3~5%戊二醛溶液。
5.如权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱的蛋白质检测方法,其特征在于:步骤2)所述的在带有氨基的水凝胶微球上修饰醛基与抗体分子中,采用的方法为化学偶联法。
6.如权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱的蛋白质检测方法,其特征在于:步骤2)所述的抗体分子包括肌红蛋白抗体、血红蛋白抗体、细胞色素C抗体、甲胎蛋白抗体、癌胚抗原抗体。
7.如权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱的蛋白质检测方法,其特征在于:步骤3)所述的将修饰有抗体分子的微球置于待检蛋白溶液中的时长为1~2h,待检蛋白溶液的浓度为0.01~100μg/ml。
8.如权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱的蛋白质检测方法,其特征在于:步骤3)所述的对微球做银染处理是指在常温下,将抓取抗原蛋白质分子后的微球浸泡在银溶胶中5min~6h。
9.如权利要求8所述的一种基于表面增强拉曼光谱的蛋白质检测方法,其特征在于:所述的银溶胶中银纳米粒子的直径为20~30nm。
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