CN1928561A - 基于光子晶体微球的多元免疫检测方法 - Google Patents

Abstract

基于光子晶体微球用于多元免疫检测方法涉及一种微球由光子晶体特异的光反射峰来编码的多元免疫检测方法，该方法采用具有编码的光子晶体微球，使抗体或者抗原与光子晶体微球结合，抗体或者抗原的种类用光子晶体微球的编码来标识，通过多种利用光子晶体微球标识的抗体或者抗原，同时检测同一个待测样品中相应的抗原或者抗体，微球利用光子晶体特异的光反射峰来编码，不同编码的微球表面分别固定不同的抗原或者抗体，将多个不同编码的微球与同一个待测样品混合，可以同时检测样品中多个待分析物。这种基于光子晶体微球的多元免疫分析方法具有灵敏度高，检测通量大，载体解码简单，检测成本低廉等优点。

Description

基于光子晶体微球的多元免疫检测方法

技术领域

本发明涉及一种微球由光子晶体特异的光反射峰来编码的多元免疫检测方法，属于生物医学研究、环境监测和临床检测的技术领域。

背景技术

免疫分析主要是利用抗体能够与相应抗原及半抗原发高特异性结合这一性质，通过将特定抗体(或抗原)作为选择性试剂来对相应待测抗原(或抗体)进行分析测定的方法。它的提出及发展是20世纪以来在生物分析化学领域所取得的最伟大的成就之一。免疫分析技术具有高度的准确性和特异性，因而在临床检验领域中倍受重视，发展迅速，成为检验方法中最为重要的技术之一。随着抗体和抗原制备技术的成熟及标记技术的发展和完善，免疫分析技术作为疾病诊断的主要手段已被广泛应用于机体免疫功能、肿瘤标志物、内分泌功能、传染性疾病、治疗药物监测、过敏原检测等体外诊断实验中，其中血凝技术、酶免疫技术、放射免疫分析技术、荧光免疫分析及免疫胶体金技术等已被大量地应用于日常的检验工作中。最为常见的基于微孔板的酶免疫分析是将抗原、抗体首先固定于微孔板固相载体上面，接着用酶标记的抗原或抗体与固定在固相载体上的抗体或抗原的发生特异性免疫反应，最后用标记酶催化相应的底物产生可以检测的信号。这样就使特异免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来，从而通过肉眼观察或借助简单的光学仪器测定酶催化底物所生成的有色产物的颜色或吸光度就可方便的进行定量测定。该方法中酶标试剂容易制备、性质稳定、有效期长，且克服了放射免疫分析中放射性同位素对操作人员的危害及荧光免疫分析中所需仪器复杂的缺点，保持了放射免疫技术的灵敏度，成为目前临床检验中应用最为广泛的免疫分析技术。

但是作为酶免疫分析的主要载体96微孔板每孔只包被一种抗原或者抗体，所以一种试剂盒只能检测一种抗体或者抗原。如果需要检测不同的抗原或者抗体，则需要不同的试剂盒，而分析所用的试验步骤基本上是一致的，这样既浪费人力物力又延长了诊断时间。因此，用同一份样品同时测定两种或者两种以上的多元免疫分析方法新近发展起来并越来越多的引起人们的兴趣。多元分析的实现一般通过两种方式来实现。第一种是多探针标记法，也就是利用不同的荧光染料或者同位素等能在相同的分析条件下产生显著不同检测信号的标记探针来分析。随着需要测定的分析物的种类的增加多探针标记法对信号检测系统复杂度的要求增加，而且适合于同时检测的标记物体系也很少，因此其应用收到限制，一般只用于两元或者三元的免疫分析。第二种是编码载体法，即把抗原或者抗体固定在不同的编码载体上进行免疫分析，常见的有抗体微阵列芯片和液相芯片。抗体微阵列芯片是在DNA微阵列芯片的基础上发展起来的，它利用芯片上的坐标位置来编码抗体分子，在不同的位置固定不同的抗体，这样只需要一种标记物如荧光分子标记就可以进行多组分的免疫分析。液相芯片则是近几年来才发展起来的一种多元免疫分析技术，它利用荧光染料来编码微球，把不同的抗体固定到不同的荧光微球上面，同样采用一种标记分子来检测多种组分。两种方法可以多达一百种甚至一百种以上组分的免疫分析，但是临床免疫检测的组分数极少能达到一百种，而基于高通量DNA微阵列芯片的蛋白质微阵列芯片技术需要专业的分析和数据处理仪器，其价格昂贵，试剂耗费严重。液相芯片技术采用大小为5个微米左右的荧光微球作为分析载体，其分析只能通过流式细胞仪这样的精密仪器，成本较高，而且标记物只选择荧光分子，难以与普遍应用的酶免疫分析仪检测方法如吸光度法，化学发光法等整合以降低成本，不便于临床推广使用。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种基于光子晶体微球的多元免疫检测方法，该检测方法用于多元免疫分析具有检测时间短，灵敏度高，检测通量大，载体解码简单，检测成本低廉的优点。

技术方案：本发明的目的可以通过以下方案实现：

采用具有编码的光子晶体微球，使抗体或者抗原与光子晶体微球结合，抗体或者抗原的种类用光子晶体微球的编码来标识，通过多种利用光子晶体微球标识的抗体或者抗原，同时检测同一个待测样品中相应的抗原或者抗体，所述检测方法包括以下步骤：

1.选取不同编码的光子晶体微球，在同一种编码的微球表面包被同一种特异性抗原或者抗体制成一种免疫微球；制备好的免疫微球用磷酸盐缓冲液洗涤，封闭缓冲液封闭之后，将分别包被有不同特异性抗体或者抗原的多种编码的微球进行混合，即得到多元免疫测定用光子晶体微球；

2.将多元免疫测定用光子晶体微球与待测样品混合进行抗原和抗体的特异性结合反应，反应完毕，用磷酸盐缓冲液洗涤，并加入标记二抗进行第二次结合反应，然后再用磷酸盐缓冲液洗涤；

3.检测微球的编码，以及微球表面的标记二抗的信号。

所述光子晶体微球的结构是胶体粒子有序自组装的蛋白石结构光子晶体，或是反蛋白石结构的光子晶体；蛋白石或者反蛋白石结构的光子晶体能反射特定波长的光，其反射光谱具有特征反射峰，波长范围涵盖紫外，可见与红外区。所述的光子晶体微球的编码为光子晶体反射光谱中特征反射峰波长的数值。所述的光子晶体微球是基于液滴或者球形孔洞为模板的胶体粒子自组装法制备的光子晶体微球，或是全息光刻法制备的光子晶体微球。光子晶体微球表面抗原或者抗体采用物理吸附法固定，或利用微球表面的功能基团进行共价连接，或对微球表面进行处理以得到衍生的功能基团从而用于共价固定或者增加物理吸附能力。抗体或者抗原的种类用光子晶体微球的编码来标识，在同种编码的微球上固定同种抗体或者抗原，使抗体或者抗原的种类与编码形成一一对应的关系。标记二抗的标记物是酶标记、化学发光物质、荧光标记、或者量子点标记。标记二抗的标记物是酶时，反应步骤3)，要首先按照微球的编码将微球分开，然后加入标记酶的底物进行酶促反应，以检测酶促反应的显色或者发光信号。

微球由光子晶体特异的光反射峰来编码，不同编码的微球表面分别固定不同的抗原或者抗体，抗体或者抗原的种类用光子晶体微球的编码来标识。将多个不同编码的微球与同一个待测样品混合，可以同时检测样品中多个待分析物。该多元免疫检测方法可以广泛应用于生物医学研究，环境监测和临床检测领域。

有益效果：根据本发明基于光子晶体编码多元免疫分析用微球与现有多元免疫分析载体相比具有以下优点：

1)由于光子晶体微球在三维方向上都具有有序纳米结构，所以其编码反射峰可以在各个方向检测到，而且强度很高，因此对微球编码的解读非常简单方便。

2)采用不同结构的光子晶体可以得到不同的反射峰位置编码，反射峰位置可以涵盖紫外、可见以及红外区域，甚至可以用多个反射峰作为一个编码。因此，光子晶体微球的编码量可以有数千个甚至数万个，可以满足同时检测多个指标的需要，也可以满足高通量检测的需要。

3)光子晶体微球的制备可以采用“自下而上”(bottom-up)的纳米粒子自组装方法，例如，利用表面带有等功能基团的纳米粒子组装得到的光子晶体微球表面自然带有-NH₂或者-COOH。因此，光子晶体微球具有多样化的功能表面，很容易满足不同免疫分析对微球表明化学的要求。

4)光子晶体微球为蛋白石或者反蛋白石的纳米结构，所以其表面为亚微米级的粗糙表面，微球具有极高的比表面积，满足适合高灵敏度载体的要求，能获得高的检测灵敏度。

5)与荧光染料编码微球相比，光子晶体微球编码颜色稳定，耐紫外和长期储存。微球的解码只需要白光就可以，不用专门的激发光，大大降低了解码光学系统的复杂性。

6)另外由于光子晶体的反射结构，载体表面对荧光标记的荧光的吸收降低，所以能够提高荧光的强度和检测反应的灵敏度。

7)光子晶体微球载体的粒径范围为几十个微米到几个毫米，很容易满足多种免疫分析检测方法如酶联显色法、化学发光法、荧光法等对载体尺寸的要求。因此，光子晶体微球载体可以与常规的酶标仪，化学发光检测仪，以及荧光显微镜等仪器配合使用，不需要专门的检测仪器配套，从而满足多种硬件条件，降低了使用成本，方便推广使用。

附图说明

图1是混合多元免疫测定微球进行反应(以双抗夹心法为例)的示意图。

图2是反应结束后分开多元免疫检测微球检测信号(以双抗夹心法为例)的示意图。

图3是光子晶体微球的两种结构—蛋白石和反蛋白石结构

图4是一个多元免疫检测的实际结果。

以上的图中有：光子晶体编码微球1、抗原2、标记二抗3。

具体实施方式

将不同抗原或者抗体通过物理吸附或者化学键共价连接分别固定到不同编码的光子晶体微球上面，吸去作为载体的微球表面未结合的抗原或者抗体并对空位点进行封闭。混合不同编码的光子晶体微球，加入待测样品，与微球上的抗原或者抗体进行抗原抗体反应。洗去未反应的物质，加入标记过的二抗或者抗原进行第二次结合反应，吸去未结合的反应物，然后根据微球的编码将微球分开检测标记信号。信号的强弱与样品中待测成分的含量成一定正相关。

其中，所述光子晶体微球的大小在0.1～6mm之间，粒度均一，并具有不同的光子晶体编码以方便区分。微球的结构可以是胶体粒子有序自组装的蛋白石结构光子晶体，也可以是反蛋白石结构的光子晶体。微球的编码来自于蛋白石或者反蛋白石结构的光子晶体对特定波长的光的反射。

待测样品可以是体液、组织液、细胞裂解液、血液、血清中的病原微生物抗原或其抗体、细胞因子、肿瘤标志物、自身抗体、激素、神经递质、毒品、兴奋剂、各种细胞表面的可溶性标记或者各种可溶性受体分子。

基于光子晶体微球的多元免疫分析方法包括以下步骤：

选取不同编码的微球，在同一种编码的微球表面包被同一种特异性抗原或者抗体制成一种免疫微球；制备好的免疫微球用磷酸盐缓冲液洗涤，封闭缓冲液封闭之后，将包被有不同特异性抗体或者抗原的不同编码的微球进行混合，即得到多元免疫测定用微球。

将多元免疫测定用微球与待测样品混合进行抗原和抗体的特异性结合反应，用磷酸盐缓冲液洗涤之后，加入标记二抗进行第二次结合反应，然后再用磷酸盐缓冲液洗涤。

上述二抗的标记物可以是酶标记、化学发光物质、荧光标记和量子点标记。按照微球的颜色将微球分开，对于酶标记物，加入标记酶的底物进行酶促反应或者化学发光反应后用酶标仪检测。对于荧光标记物，荧光信号可以通过荧光显微镜、荧光分光光度计、荧光光谱或者时间分辨荧光测定仪测定。

微球利用光子晶体特异的光反射峰来编码，不同编码的微球表面固定有不同的抗原或者抗体，将多个不同编码的微球与同一个样品混合，可以同时检测样品中多个待分析物。

实施例一。使用光子晶体微球进行血液中艾滋病病毒(HIV)和乙型肝炎病毒(HBV)的检测：

1分别在600nm和560nm编码的光子晶体微球上包被艾滋病病毒合成肽抗原和乙型肝炎表面抗原，在450nm编码的光子晶体微球上包被牛血清白蛋白做为对照。三种包被过的编码微球分别用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，加入1％的牛血清白蛋白(BSA)封闭。磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次后，将三种包被过的编码微球混合，得到不同特异性的多元免疫微球。

2将混合后的三种编码微球，加入到100ul待测血清中，37℃孵育30分钟，吸去反应液，PBS洗涤两次后加入荧光FITC标记的羊抗人IgG，37℃孵育30分钟，PBS洗涤两次。

3在荧光显微镜下观察微球表面的荧光强度，并用光纤光谱仪测定微球的反射光谱。

实施例二。使用多元免疫微球进行TORCH诊断：

1分别在430nm、480nm、530nm、600nm和650nm编码光子晶体微球上包T.gondii，Rubella virus，CMV，HSV Type II抗原和对照牛血清白蛋白，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，加入1％的牛血清白蛋白(BSA)封闭，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次后，将6种包被过的编码微球混合得到不同特异性的多元免疫微球。

2将混合后的五种编码微球，加入到100ul待测血清中，37℃孵育30分钟，吸去反应液，PBS洗涤两次后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgM，37℃孵育30分钟，PBS洗涤两次后把五种编码微球分别放入微孔板的五个微孔中，加入辣根过氧化物酶显色底物TMB溶液，37℃催化反应20分钟，加入2M的硫酸终止反应。

3在酶标仪上测定每个微孔在450nm处的吸光度，并用光纤光谱仪测定微球的反射光谱。

Claims (8)

1.一种基于光子晶体微球的多元免疫检测方法，其特征在于采用具有编码的光子晶体微球，使抗体或者抗原与光子晶体微球结合，抗体或者抗原的种类用光子晶体微球的编码来标识，通过多种利用光子晶体微球标识的抗体或者抗原，同时检测同一个待测样品中相应的抗原或者抗体，所述检测方法包括以下步骤：

1)选取不同编码的光子晶体微球，在同一种编码的微球表面包被同一种特异性抗原或者抗体制成一种免疫微球；制备好的免疫微球用磷酸盐缓冲液洗涤，封闭缓冲液封闭之后，将分别包被有不同特异性抗体或者抗原的多种编码的微球进行混合，即得到多元免疫测定用光子晶体微球；

2)将多元免疫测定用光子晶体微球与待测样品混合进行抗原和抗体的特异性结合反应，反应完毕，用磷酸盐缓冲液洗涤，并加入标记二抗进行第二次结合反应，然后再用磷酸盐缓冲液洗涤；

3)检测微球的编码，以及微球表面的标记二抗的信号。

2.根据权利要求1所述的基于光子晶体微球的多元免疫检测方法，其特征在于所述的光子晶体微球的编码为光子晶体反射光谱中特征反射峰波长的数值。

3.根据权利要求1所述的基于光子晶体微球的多元免疫检测方法，其特征在于所述光子晶体微球的结构是胶体粒子有序自组装的蛋白石结构光子晶体，或是反蛋白石结构的光子晶体；蛋白石或者反蛋白石结构的光子晶体能反射特定波长的光，其反射光谱具有特征反射峰，波长范围涵盖紫外，可见与红外区。

4.根据权利要求1或3所述的基于光子晶体微球的多元免疫检测方法，其特征在于所述的光子晶体微球是基于液滴或者球形孔洞为模板的胶体粒子自组装法制备的光子晶体微球，或是全息光刻法制备的光子晶体微球。

5.根据权利要求1所述的基于光子晶体微球的多元免疫检测方法，其特征在于光子晶体微球表面抗原或者抗体采用物理吸附法固定，或利用微球表面的功能基团进行共价连接，或对微球表面进行处理以得到衍生的功能基团从而用于共价固定或者增加物理吸附能力。

6.根据权利要求1所述的基于光子晶体微球的多元免疫检测方法，其特征在于抗体或者抗原的种类用光子晶体微球的编码来标识，在同种编码的微球上固定同种抗体或者抗原，使抗体或者抗原的种类与编码形成一一对应的关系。

7.根据权利要求1所述的基于光子晶体微球的多元免疫检测方法，其特征在于标记二抗的标记物是酶标记、化学发光物质、荧光标记、或者量子点标记。

8.根据权利要求1或7所述的基于光子晶体微球的多元免疫检测方法，其特征在于标记二抗的标记物是酶时，反应步骤3)，要首先按照微球的编码将微球分开，然后加入标记酶的底物进行酶促反应，以检测酶促反应的显色或者发光信号。

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