CN109154608B - 分析方法以及分析装置 - Google Patents

Abstract

分析方法对由树脂材料形成的分析用基板(1)照射激光，所述分析用基板具有捕捉有检测对象物质(11)和微粒子(20)的反应区域(10)，所述微粒子(20)是用于标识检测对象物质(11)的金属化合物(步骤S2)。分析方法提取接受来自分析用基板(1)的反射光生成的信号电平作为基板信号电平(DL)(步骤S4)。分析方法接受来自反应区域(10)的反射光并生成受光电平信号(JS)(步骤S6)。分析方法提取反应区域(10)中比来自分析用基板(1)的反射光的受光电平高的信号电平的受光电平信号(JS)作为微粒子检测信号(KS)(步骤S7)。分析方法基于提取的微粒子检测信号(KS)来检测微粒子(20)(步骤S8)。

Description

分析方法以及分析装置

技术领域

本发明涉及用于分析抗原、抗体等生物体物质的分析方法以及分析装置。

背景技术

已知有以下免疫检测法(immunoassay)：通过将与疾病相关联的特定的抗原或者抗体作为生物标记物来进行检测，从而定量地对疾病的发现、治疗的效果等进行分析。

在专利文献1中记载有以下分析方法和分析装置：使固定于分析用基板上的反应区域的抗体与试样中的作为抗原的检测对象物质结合，还使检测对象物质与微粒子结合来在反应区域捕捉微粒子以及检测对象物质，利用从光拾取器照射的激光进行扫描，由此检测出在反应区域中捕捉到的微粒子。

在如专利文献1所记载的以往的分析方法中，从光拾取器照射激光扫描反应区域，对来自反应区域的反射光进行分析，并检测微粒子，由此间接地对检测对象物质进行检测。专利文献1所记载的分析方法和分析装置是将光盘以及光盘装置应用于检测体检测中。

在先技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利文献特表2002-530786号公报。

发明内容

但是，在形成反应区域的过程中，具体地通过抗原抗体反应将检测对象物质捕捉到分析用基板上、或者对未反应的不必要的物质进行清洗的过程中，有时蛋白质的凝集块、包含在清洗液中的盐、表面活性剂等作为残渣而被包含在反应区域。当检测微粒子时，残渣也被检测。

通常，由残渣产生的检测信号(噪声信号)和由微粒子产生的检测信号(微粒子检测信号)具有相似的脉冲波形。因此，在以往的分析方法和分析装置中，难以以高精度地识别噪声信号和微粒子检测信号。特别是，在检测对象物质是极微量的情况下，由于与检测对象物质结合而捕捉到反应区域的微粒子也是极微量的，因此由噪声信号产生的影响相对地变大，成为导致微粒子的定量精度、即微粒子的检测极限和分辨率等定量地对微粒子进行分析时的精度(检测极限)变差的主要原因。

实施方式其目的在于提供以下分析方法和分析装置：以比以往高的精度提取出微粒子检测信号，基于被提取出的微粒子检测信号检测微粒子，由此能够间接地使检测对象物质的检测精度提高。

实施方式的第一方式提供一种分析方法，其特征在于，对具有反应区域的分析用基板照射激光，所述反应区域捕捉有检测对象物质和微粒子，所述微粒子是用于标记所述检测对象物质的金属化合物，所述分析用基板由树脂材料形成，提取接受来自所述分析用基板中的未反映区域的反射光来生成的信号电平作为基板信号电平，所述未反应区域是在所述分析用基板中没有形成所述反应区域的区域，接受来自所述反应区域的反射光来生成受光电平信号，提取在来自所述反应区域的受光电平信号中比所述基板信号电平高的信号电平的受光电平信号作为微粒子检测信号，基于提取的微粒子检测信号检测所述微粒子。

实施方式的第二方式分析装置，其特征在于，包括：光拾取器，对具有反应区域的分析用基板照射激光，并检测来自所述反应区域以及未反应区域的反射光的受光电平来生成受光电平信号，所述未反应区域是在所述分析用基板中没有形成所述反应区域的区域，所述反应区域捕捉有检测对象物质和微粒子，所述微粒子是用于标记所述检测对象物质的金属化合物，所述分析用基板由树脂材料形成；基板电平检测电路，提取来自所述未反应区域的受光电平信号的信号电平作为基板信号电平；判定电路，提取在来自所述反应区域的受光电平信号中比所述基板信号电平高的信号电平的受光电平信号来作为微粒子检测信号；以及计数电路，基于所述微粒子检测信号对所述微粒子进行检测。

根据实施方式的分析方法和分析装置，能够以比以往高的精度提取微粒子检测信号，并基于所提取出的微粒子检测信号检测微粒子，由此能够间接地使检测对象物质的检测精度提高。

附图说明

图1是示出具有反应区域的分析用基板的俯视图；

图2是放大示出在反应区域的轨道区域捕获有微粒子的状态的示意图；

图3是放大示出微粒子与检测对象物质特异地结合并被捕获到反应区域的轨道区域上的状态的示意图；

图4是示出本实施方式的分析装置的构成图；

图5是用于说明微粒子的分析方法的流程图；

图6是示出通过本实施方式的分析方法得到的受光电平信号的一例的图；

图7是示出微粒子的复折射率与受光电平信号的信号电平之间的关系的仿真图；

图8是图7的局部放大图；

图9是示出以往的受光电平信号的一例的图。

具体实施方式

[反应区域的形成]

使用图1～图3，对在分析用基板上形成反应区域的方法进行说明。

如图1所示，分析用基板1例如具有与蓝光光盘(BD)、DVD(Digital Video Disk，数字化视频光盘)、紧凑型盘(CD)等的光盘同等的圆板形状。在分析用基板1的中心部形成有定位孔2。

分析用基板1例如由通常用于光盘的聚碳酸酯树脂、环烯聚合物等的树脂材料形成。此外，分析用基板1不限于上述的光盘，也能使用以其他方式、预定标准规定的光盘。

如图2所示，在分析用基板1的表面上形成有轨道区域5，所述轨道区域5为凸部3与凹部4在半径方向上交替配置而成的区域。凸部3以及凹部4从分析用基板1的内周部朝向外周部形成为螺旋状。凹部4(凸部3)的半径方向的间距、即轨道间距W4例如是320nm。

在分析用基板1的轨道区域5形成有反应区域10。使用图3，对反应区域10的形成方法进行说明。

使与检测对象物质11特异地结合的抗体12固定到轨道区域5上的预定的区域(形成反应区域10的区域)，所述检测对象物质11是与疾病相关联的特定的抗原。例如使包含抗体12的缓冲液与分析用基板1反应。在去除反应后的缓冲液之后，清洗分析用基板1并使其干燥，由此将抗体12固定到轨道区域5上。检测对象物质11例如是特定的蛋白质。

使检测对象物质11与固定于轨道区域5上的抗体12特异地结合。例如使包含检测对象物质11的试样液与抗体12反应。在去除反应后的试样液之后，清洗分析用基板1并使其干燥，由此使轨道区域5的凹部4捕捉检测对象物质11。检测对象物质11的外径为例如100nm左右。此外，根据试样液，也存在不包含检测对象物质11的情况，但为了容易明白地说明，以下对在试样液中包含有检测对象物质11的情况进行说明。

使用于标识检测对象物质11的微粒子20与捕捉到轨道区域5上的检测对象物质11特异地结合。在微粒子20的表面上固定有与检测对象物质11特异地结合的抗体21。通过微粒子20的抗体21与检测对象物质11特异地结合，微粒子20被捕捉到轨道区域5的凹部4。此外，关于微粒子20的大小、材料特性在后面叙述。

因此，检测对象物质11以及微粒子20被捕捉到分析用基板1的轨道区域5的凹部4。检测对象物质11以及微粒子20被捕捉的区域是图1所示的反应区域10。此外，在图1中，八个反应区域10等间隔地形成，以各反应区域10的中心相对于分析用基板1的中心Ca分别位于同一圆周Cb上，然而反应区域10的数目、形成位置并不限于此。

[分析装置]

使用图4，说明用于对捕捉到分析用基板1的反应区域10上的微粒子20进行检测的分析装置的构成例。

分析装置30包括转盘31、夹具32、转盘驱动部33、转盘驱动电路34、引导轴35、光拾取器40、光拾取器驱动电路36以及控制部37。

分析用基板1以反应区域10朝下的方式被载置在转盘31上。

夹具32被向从转盘31离开的方向以及靠近转盘31的方向、即图4的上方以及下方驱动。当夹具32被向下方驱动时，分析用基板1通过夹具32和转盘31被保持在转盘31上。具体地，分析用基板1以其中心Ca位于转盘31的旋转轴C31上的方式被保持。

转盘驱动部33驱动转盘31与分析用基板1以及夹具32一起绕旋转轴C31旋转。作为转盘驱动部33例如可以使用主轴马达。

转盘驱动电路34控制转盘驱动部33。例如，转盘驱动电路34以转盘31与分析用基板1以及夹具32一起以固定的线速度Lv旋转的方式控制转盘驱动部33。

引导轴35与分析用基板1平行地、且沿着分析用基板1的半径方向配置。即，引导轴35沿着与转盘31的旋转轴C31正交的方向配置。

光拾取器40被引导轴35支承。光拾取器40沿着引导轴35在分析用基板1的半径方向上、与分析用基板1平行地被驱动。即，光拾取器40沿着与转盘31的旋转轴C31正交的方向被驱动。

光拾取器40包括物镜41。物镜41被悬吊线42支承。物镜41被向靠近分析用基板1的方向以及从分析用基板1离开的方向、即图4的上方以及下方驱动。

光拾取器40朝向分析用基板1照射激光40a。激光40a通过物镜41被会聚到分析用基板1的形成有反应区域10侧的面上(在图4中，分析用基板1的下侧的面)。激光40a的波长λ例如是405nm左右。

光拾取器40接受来自分析用基板1的反射光。光拾取器40检测反射光的受光电平并生成受光电平信号JS，并输出给控制部37。

光拾取器驱动电路36对光拾取器40的驱动进行控制。例如光拾取器驱动电路36使光拾取器40沿着引导轴35移动，或者使光拾取器40的物镜41在上下方向上移动。

控制部37对转盘驱动电路34以及光拾取器驱动电路36进行控制。作为控制部37例如可以使用CPU(Central Processing Unit，中央处理器)。

控制部37具有检测来自分析用基板1的信号的信号检测部50。信号检测部50具有基板电平检测电路51、存储电路52、受光信号检测电路53、判定电路54以及计数电路55。

信号检测部50从受光电平信号JS中提取出微粒子检测信号KS并进行计数，由此对捕捉到反应区域10的微粒子20进行检测且进行定量，所述受光电平信号JS从光拾取器40输出。由于检测对象物质11 100nm左右那样小，因此难以直接检测检测对象物质11。因此，通过对比检测对象物质11大的微粒子20进行检测并定量，能够对被捕捉到反应区域10中的检测对象物质11间接地进行检测并定量。

[微粒子以及微粒子的检测]

使用图5的流程图，对微粒子20的分析方法(检测对象物质11的分析方法)进行说明。此外，根据试样液，也存在不包含检测对象物质11的情况。在该情况下，在分析用基板1的反应区域10中，检测对象物质11以及微粒子20未被捕捉到。因此，为了容易明白地进行说明，对在反应区域10中捕捉到了检测对象物质11以及微粒子20的情况进行说明。

控制部37在步骤S1中，控制对转盘驱动电路34以使得形成有反应区域10的分析用基板1以固定的线速度Lv旋转，并使转盘驱动部33驱动转盘31旋转。

基板电平检测电路51在步骤S2中从光拾取器40朝向分析用基板1照射激光40a，并对光拾取器驱动电路36进行控制，使光拾取器40移动到分析用基板1中的未形成反应区域10的预定的未反应区域9的半径位置。激光40a例如被照射到未反应区域9并扫描，所述未反应区域9是相对于图1的分析用基板1的中心Ca的相同圆周Cc上的、不存在反应区域10的区域。

光拾取器40在步骤S3中接受来自未反应区域9的反射光。光拾取器40对来自未反应区域9的反射光的受光电平进行检测并生成受光电平信号JS，并输出给基板电平检测电路51。

基板电平检测电路51在步骤S4中提取来自未反应区域9的受光电平信号JS的受光电平作为基板信号电平DL，并存储到存储电路52。

基板信号电平DL是依赖于分析用基板1自身的基板特性的。从步骤S2到步骤S4的提取基板信号电平DL的处理只要使用相同设计的分析用基板1即可，不需要每当更换分析用基板1时进行。基板信号电平DL的提取可以在使分析装置30动作时仅进行一次，也可以每当分析用基板1的批次变化时进行处理。

在事先已经进行了基板信号电平DL的提取的情况下，能够省略从步骤S2到步骤S4的处理。此外，在本实施方式中，对每当更换分析用基板1时获取来自未反应区域9的受光电平信号JS的情况进行说明。

受光信号检测电路53在步骤S5中从光拾取器40朝向分析用基板1照射激光40a，并对光拾取器驱动电路36进行控制，使光拾取器40移动到分析用基板1中的形成有反应区域10的半径位置。如图3所示，激光40a被照射到反应区域10，并沿着凹部4被扫描。

光拾取器40在步骤S6中接受来自反应区域10的反射光。光拾取器40检测反射光的受光电平并生成受光电平信号JS，并输出给受光信号检测电路53。

图6示出通过本实施方式的分析方法得到的受光电平信号JS的一例。图6的纵轴示出受光电平信号JS的信号电平。横轴示出时间。以下，将来自反应区域10的反射光中的、来自分析用基板1的反射光的受光电平称为基板信号电平DL。基板信号电平DL具体来说是来自分析用基板1的反应区域10中的凹部4的反射光的受光电平。

比基板信号电平DL高的信号电平(高电平)的受光电平信号是微粒子检测信号KS，比基板信号电平DL低的信号电平(低电平)的受光电平信号是噪声信号NS。受光电平信号JS中的基板信号电平DL是不包含微粒子检测信号KS和噪声信号NS的时间中的固定的受光电平。

在形成反应区域10的过程中，具体地，在通过抗原抗体反应将检测对象物质11捕捉到分析用基板1上、或者对未反应的不需要的物质进行清洗的过程等中，有时存在蛋白质的凝集块、清洗液所包含的盐、表面活性剂等作为残渣包含在反应区域10的情况。由这样的残渣产生的噪声信号NS也被作为受光电平信号JS检测出。

图7是通过FDTD(Finite-Difference Time-Domain method，时域有限差分法)法对微粒子的复折射率m(m＝n-ki)和微粒子检测信号KS的信号电平的关系进行光学仿真的图。图8是图7的局部放大图。

图7以及图8的纵轴示出微粒子检测信号KS的信号电平(电压相对值)。横轴示出微粒子的复折射率m中的实部的折射率n。此外，复折射率m＝n-ki中的ki是虚部。K表示消光系数。图7以及图8中的Lk0、Lk1、Lk2、Lk3以及Lk4示出k＝0、k＝0.1、k＝0.2、k＝0.3以及k＝0.4情况下的微粒子检测信号KS的信号电平。图7以及图8中的DL示出基板信号电平。图7以及图8是将激光40a的波长λ设为405nm、将微粒子的外径设为200nm、将分析用基板1的实部的折射率n设为1.53(ki＝0)来进行光学仿真而得的。

图9示出以往的微粒子检测信号KS与噪声信号NS的关系。以往，微粒子由聚苯乙烯等合成树脂形成。通常，聚苯乙烯等合成树脂的折射率n是1.5左右，消光系数k是0.2～0.4左右。因此，如图9所示，以往，微粒子检测信号KS为比基板信号电平DL低的信号电平。因此，以外，如图9所示，微粒子检测信号KS以及噪声信号NS作为比基板信号电平DL低的信号电平的受光电平信号而被检测出。

通常，微粒子检测信号KS与噪声信号NS比信号电平低。因此，通过将受光电平信号的信号电平与阈值Ltha进行比较，能够以某种程度的精度辨别微粒子检测信号KS和噪声信号NS。但是，在被检测的微粒子是极微量的情况下，由于由噪声信号NS产生的影响相对变大，因此成为使微粒子的定量精度变差的主要原因。

因此，在本实施方式中，使用微粒子检测信号KS比基板信号电平DL高的信号电平的微粒子20。具体地，如图8所示，微粒子20通过复折射率m(m＝n-ki)的虚部的消光系数k是0.3以下(k≤0.3)且实部的折射率n是2.1～2.5的范围(2.1≤n≤2.5)、或者消光系数k是0.2以下(k≤0.2)且折射率n是2.1～2.6的范围(2.1≤n≤2.6)的材料形成。作为这样的材料，可以使用氧化钛、氧化铌、氧化钽等过渡金属的氧化物等的金属化合物。

在微粒子20的表面，可以以构成配体为目的来聚合覆盖树脂材料。微粒子20的有效复折射率成为金属化合物与树脂材料的合成复折射率。通过以薄的树脂覆膜覆盖微粒子20的表面，能够构成配体。在该情况下，通过将合成复折射率的折射率n以及消光系数k设为上述的范围，能够使微粒子检测信号KS成为比基板信号电平DL高的信号电平。

以磁捕集微粒子20为目的，可以在微粒子20中内包磁性体。微粒子20的有效复折射率成为金属化合物与磁性体的合成复折射率。在该情况下，通过将合成复折射率的折射率n以及消光系数k设为上述的范围，能够使微粒子检测信号KS成为比基板信号电平DL高的信号电平。

激光40a在反应区域10上沿凹部4扫描。为了精度好地对微粒子20进行定量，优选微粒子20以高概率被凹部4捕捉且沿扫描方向被捕捉。例如，当微粒子20的直径d(参照图3)比λ/4小时，成为使微粒子20的检测精度变差、或者通过微粒子20在与扫描方向正交的方向上被捕捉多个而使微粒子20的定量精度变差的主要原因。此外，λ是被照射到微粒子20的激光40a的波长。

当微粒子20的直径d比λ/2大时，微粒子20难以被凹部4捕捉到。因此，优选的是，微粒子20的直径d为λ/4～λ/2的范围(λ/4≤d≤λ/2)。

返回图5，判定电路54在步骤S7中将比存储在存储电路52中的基板信号电平DL高的信号电平的受光电平信号判定为微粒子检测信号KS。例如，判定电路54对受光电平信号JS与阈值Lth进行比较，将阈值Lth以上的信号电平的受光电平信号JS判定为微粒子检测信号KS。阈值Lth被设定为比基板信号电平DL高的电平。

当在受光电平信号JS中包含有噪声信号NS的情况下，噪声信号NS是比基板信号电平DL低的信号电平。因此，能够容易识别相对于基板信号电平DL高信号电平的微粒子检测信号KS和低信号电平的噪声信号NS。因此，能够从受光电平信号JS精度良好地仅提取出微粒子检测信号KS。

计数电路55在步骤S8中按照每个反映区域10对微粒子检测信号KS、具体而言微粒子检测信号KS的脉冲数进行计数，并按照每个轨道进行相加。由此，能够对各反应区域10中的微粒子20进行定量。通过对微粒子20进行定量，能够间接地对通过微粒子20标识的检测对象物质11进行定量。

控制部37在步骤S9中对光拾取器驱动电路36进行控制，使光拾取器40移动到初始位置，并使激光40a的照射停止。控制部37对转盘驱动电路34进行控制，使转盘31的旋转停止。

根据本实施方式的分析方法，通过使用微粒子检测信号KS比基板信号电平DL高的信号电平的微粒子20，容易相对于比基板信号电平DL低的信号电平的噪声信号进行识别。例如，通过对受光电平信号JS和阈值Lth进行比较，能够从受光电平信号JS中精度良好地仅提取微粒子检测信号KS，该阈值Lth被设定为比基板信号电平DL高的电平。基于被提取出的微粒子检测信号KS，能够精度良好地检测出被捕捉到反应区域10的微粒子20。

因此，根据本实施方式的分析方法，以比以往高的精度提取微粒子检测信号，并基于被提取出的微粒子检测信号对微粒子进行检测，由此能够间接地提高检测对象物质的检测精度。

本发明并不限于以上说明的上述的本实施方式，能够在不脱离本发明的主旨的范围内进行各种变更。

产业上的可用性

本发明能够在对抗原、抗体等的生物体物质进行分析时使用。

Claims (4)

1.一种生物体物质的分析方法，其特征在于，

对具有反应区域的分析用基板照射激光，所述反应区域捕捉有检测对象物质和微粒子，所述微粒子是用于标记所述检测对象物质的金属化合物，在所述微粒子的表面上固定有与所述检测对象物质特异地结合的抗体，所述分析用基板由树脂材料形成，

提取接受来自所述分析用基板中的未反应区域的反射光来生成的信号电平作为基板信号电平，所述未反应区域是在所述分析用基板中没有形成所述反应区域的区域，

接受来自所述反应区域的反射光来生成受光电平信号，

提取在来自所述反应区域的受光电平信号中比所述基板信号电平高的信号电平的受光电平信号作为微粒子检测信号，

基于提取的微粒子检测信号检测所述微粒子，

所述微粒子的复折射率n-ki的虚部ki的消光系数k是0.3以下且实部的折射率n为2.1～2.5的范围，或者，复折射率n-ki的消光系数k是0.2以下且折射率n为2.1～2.6的范围。

2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，

所述微粒子被树脂膜覆盖。

3.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，

所述微粒子内包有磁性体。

4.一种生物体物质的分析装置，其特征在于，包括：

光拾取器，对具有反应区域的分析用基板照射激光，并检测来自所述反应区域以及未反应区域的反射光的受光电平来生成受光电平信号，所述未反应区域是在所述分析用基板中没有形成所述反应区域的区域，所述反应区域捕捉有检测对象物质和微粒子，所述微粒子是用于标记所述检测对象物质的金属化合物，在所述微粒子的表面上固定有与所述检测对象物质特异地结合的抗体，所述分析用基板由树脂材料形成；

基板电平检测电路，提取来自所述未反应区域的受光电平信号的信号电平作为基板信号电平；

判定电路，提取在来自所述反应区域的受光电平信号中比所述基板信号电平高的信号电平的受光电平信号来作为微粒子检测信号；以及

计数电路，基于所述微粒子检测信号对所述微粒子进行检测，

所述微粒子的复折射率n-ki的虚部ki的消光系数k是0.3以下且实部的折射率n为2.1～2.5的范围，或者，复折射率n-ki的消光系数k是0.2以下且折射率n为2.1～2.6的范围。

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