CN102879570A - 一种用光子晶体微球流式芯片检测真菌毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用光子晶体微球流式芯片检测真菌毒素的方法，该方法采用光子晶体微球为真菌毒素探针载体，在微球表面进行直接竞争免疫检测多个真菌毒素，以黄曲霉毒素、伏马毒素和桔青霉毒素为检测对象，通过异硫氰酸荧光素标记抗体与微球表面固定抗原竞争各自的抗原，利用共聚焦荧光扫描仪和光子晶体的反射光谱进行解码，对三种真菌毒素同时检测。该方法对黄曲霉毒素、伏马毒素和桔霉素的检测限为0.001ng/mL，线性检测范围为0.001到10ng/mL之间，仅仅需要10μL试样，整个分析过程小于3小时。

Description

一种用光子晶体微球流式芯片检测真菌毒素的方法

技术领域

本发明涉及农产品、饲料和食品中的真菌毒素快速、高通量、低成本检测技术方法。具体通过谷物中典型的黄曲霉毒素（AFB₁）、伏马毒素（FB₁）和桔青霉毒素（CIT）真菌毒素为检测对象，利用三种光子晶体微球反射峰位置的差异对三种光子晶体微球进行物理编码，通过竞争免疫方法在光子晶体微球表面构建液相芯片检测新技术。

背景技术

真菌毒素是产毒真菌分泌产生的，能引起人畜各种损害的次生代谢产物。到目前为至，已发现的真菌毒素高达500多种，并不断有新的真菌毒素被发现。其中，对人畜危害大、毒性强和污染频率高的真菌毒素主要包括黄曲霉毒素B₁和M₁、展青霉素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、伏马毒素、桔霉素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇等。基于真菌毒素的严重危害，世界粮农组织和各国都严格制定了农产品、饲料和食品的真菌毒素残留最大允许残留量。人们一直努力采取各种预防措施，防止真菌毒素进入人类食物链。其中检测技术方法发挥着越来越重要的作用。一般地，真菌毒素的检测技术概括起来大体上分为三类：第一类是仪器分析法，包括薄层层析法、紫外、荧光分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法、液质联用、气质联用等。第二类是生物学检测方法，包括皮肤毒性实验、致呕吐实验、种子发芽实验等。第三类是基于免疫化学反应的检测方法，包括放射性免疫法、酶联免疫法（ELISA）、荧光偏振免疫分析、免疫凝聚法和免疫层析法等。这些技术方法在分析真菌毒素中起到非常重要的作用。然而，随着科技水平的提高，一些新的有毒有害物质不断被发现；同时，人们生活水平的不断提高，食品安全意识不断增强。这些都要求增加食品中有毒有害成分的检测种类，降低最大允许含量。另外，目前许多国家基于保护消费者健康或/和制造技术性贸易壁垒的目的，规定（或正在规定）必须同时检测农产品、食品和饲料中常见的多种真菌毒素。我国国家标准中也规定了农产品、食品和饲料中的黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马毒素、赭曲霉毒素和桔青霉素的限量标准，其它更多真菌毒素的限量正在制定中。由于农产品样品及其污染源的多样性，对农产品及其制品的真菌毒素检测带来了巨大考验，尤其是对于大批量的样品检测，仅靠常规的上述检测方法已不能满足现场、快速、灵敏、稳定且低成本的需要。基于这些要求，研究和开发对仪器设备要求简单，试剂使用量少，对操作人员要求低，分析方法简便，成本低廉，准确、快速的真菌毒素多元检测技术和方法具有重要的现实意义。

发明内容

本发明目的在于开发一种高灵敏度、高通量、成本低、检测时间快、特异性好的同时检测食品中多种真菌毒素新技术，以替代传统色谱技术或酶联免疫法（ELISA）真菌毒素检测的方法。

本发明的原理如图1所示，在同一体系中，分别在粒径大小相同，反射光谱位置不同的光子晶体微球表面用双氧水：浓硫酸溶液进行羟基化修饰，用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）环氧基修饰，固定不同真菌毒素包被抗原，牛血清蛋白（BSA）封闭。包被的抗原与真菌毒素标准品或试样中真菌毒素竞争结合异硫氰酸荧光素（FITC）标记的各真菌毒素抗体。用荧光共聚焦扫描仪拾取各微球的荧光信号，用微球的反射光谱或其结构色识别不同的真菌毒素探针。建立标准曲线和检测食品中的真菌毒素。

本发明所述用光子晶体微球流式芯片检测真菌毒素的方法，是采用光子晶体微球为真菌毒素探针载体，在微球表面进行直接竞争免疫检测多个真菌毒素，以黄曲霉毒素（AFB₁）、伏马毒素（FB₁）和桔青霉毒素（CIT）为检测对象，通过异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗体与微球表面固定抗原竞争各自的抗原，利用共聚焦荧光扫描仪和光子晶体的反射光谱进行解码，对三种真菌毒素同时检测。

上述方法包括以下步骤：

（1）光子晶体微球的制备

（2）光子晶体微球表面的修饰：通过体积比3：7的双氧水与浓硫酸对步骤（1）得到的微球表面进行羟基化修饰，再用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）对微球表面进行环氧基修饰；

（3）抗体标记：通过化学键合方法将黄曲霉毒素（AFB₁）、伏马毒素（FB₁）和桔青霉毒素（CIT）人工抗原固定于经步骤（2）表面修饰的微球表面；

（4）用光子晶体微球流式芯片对待测样品进行竞争免疫检测；利用共聚焦荧光扫描仪和光子晶体的反射光谱进行解码。

光子晶体微球的制备：首先将甲基硅油倒入培养皿中，175℃加热10min，然后冷却至室温备用。内装二氧化硅单分散乳液的1号注射器和内装甲基硅油的2号注射器中的液体通过三通管连接，利用两蠕动泵分别将甲基硅油和二氧化硅单分散乳液混合包裹进入已经处理好的盛有甲基硅油培养皿，在界面力的作用下二氧化硅单分散乳液会形成球状结构。

以不同纳米二氧化硅颗粒自组装技术制备上述的粒径相同的光子晶体微球。各微球具有不同的光反射光谱。

将制备好的微球放入70℃烘箱中加热9h，其中的水分完全蒸发的同时也会使纳米微球进一步组装。微球成型后，使用正己烷多次清洗小球，每次冲洗前先浸泡10min，接着用无水乙醇冲洗3次，然后再放入马弗炉中进行煅烧，升温（2℃/min）至300℃后恒温3h，降温（1.5℃/min）。

光子晶体微球表面的修饰：

修饰羟基：把10ml（30%双氧水和70%浓硫酸）加入到放置有光子晶体微球的烧杯中，室温下过夜，然后用双蒸水多次洗涤后置于氮气流下吹干。处理后微球表面的有机物质等杂质被清除干净，同时二氧化硅表面的硅羟基水解生成生成更多的羟基（-OH）。

修饰环氧基：把上述处理过的微球浸入含1%（V/V）γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）的甲苯溶液中反应过夜，待偶合反应结束后，移去上述反应液，然后分别用甲苯和无水乙醇洗涤微球至少三次以去除微球表面物理吸附的γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS），氮气流下吹干，然后在110℃下烘干45-60mins。修饰后的二氧化硅微球用于下一步的生物检测。

抗体的标记：

抗体的标记采用Sigma公司的异硫氰酸荧光素（FITC）试剂盒进行。

谷物试样的处理：

玉米、小麦和花生通过高速粉碎机粉碎为粒度小于1mm，称取5克各自试样于100ml的容量瓶中。以甲醇为溶剂准备不同浓度梯度真菌毒素标准品，充分混合试样。这些试样放入通风橱内过夜，蒸发完溶剂。加入的标准品通过6ml三氯甲烷提取。振荡1h后，用whatman过滤纸过滤。收集滤液并放入干燥箱中65℃下蒸发溶剂。提取的毒素试样溶解于2mL，0.01M，pH7.4PBS缓冲液中。同时，按照上述方法提取没有加入标准品的对照试样。

竞争免疫检测：

将修饰后的微球置于反应管中（每管五个），然后分别加入10μL浓度为240，250和260ng/mL的黄曲霉毒素-牛血清蛋白连接物（AFB₁-BSA），伏马毒素-牛血清蛋白连接物（FB₁-BSA）和桔青霉毒素-卵清蛋白连接物（CIT-OVA）的三种不同微球的PBS（0.01M，pH7.4）缓冲液，37℃水浴中反应1h。PBST多次洗涤后，用20μL含有1%BSA的PBS缓冲液对微球上面未和抗原结合的活性基团进行封闭，接着再用PBST缓冲溶液进行洗涤。在每个反应管中分别加入10μL不同浓度梯度的各自真菌毒素的标准溶液（标准曲线）或提取的谷物试样，紧接着再加入10μL异硫氰酸荧光素（FITC）标记过的浓度分别为1.65，0.95和1.40μg/mL各自毒素单克隆抗体，37℃水浴中反应1h，用PBST多次洗涤微球，然后将微球置于清洗干净的载玻片上进行固定，待载玻片上面的液体基本挥发完后放入芯片扫描仪进行分析，测其荧光强度。用光反射光谱仪分辨不同的微球。各真菌毒素的标准曲线见图2.。

本发明采用法合成了单分散性的纳米二氧化硅颗粒，通过纳米二氧化硅颗粒自组装技术，制备了结构和粒径均一的光子晶体微球。选择了三种光子晶体微球作为光编码载体。将光子晶体微球放在蒸馏水中用超声波清洗后将其浸入食人鱼洗液（30%双氧水和70%浓硫酸）进行清洗，使其表面发生水解以产生更多的羟基，然后再用1%γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）的甲苯溶液浸泡光子晶体微球，在其表面修饰环氧基。通过优化固定黄曲霉毒素抗原、伏马毒素抗原以及桔青霉毒素抗原包被浓度，各自抗体浓度，微球表面修饰温度，确定了最佳包被浓度分别为240ng/mL、250ng/mL、260ng/mL，各自抗体反应浓度为1.65，0.95和1.4μg/mL。光子晶体微球在110℃下与γ-(2，3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷反应45-60mins，可以使微球表面形成的末端修饰更多，更稳定的环氧基团，提高真菌毒素的检测灵敏度和检测线性范围。不同温度对检测信号的影响见图3。

利用三种光子晶体微球最大反射峰位置的差异对三种光子晶体微球进行物理编码，然后再分别包被不同的偶联抗原，通过异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗体与微球表面固定抗原竞争各自的标准品，利用共聚焦荧光扫描仪和光子晶体的反射光谱进行解码，构建农产品中三种真菌毒素同时检测的液相芯片检测技术。建立三种毒素线性检测范围在0.1-0.001ng/ml之间；对三种毒素在玉米、小麦和花生中的回收率在74.7%～127.9%之间；各微球载体之间无干扰，具有良好的特异性。特异性见图4。

本发明中通过提高γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）修饰温度，可以提高近3倍的检测荧光信号，扩大检测线性范围。这一技术对三种真菌毒素的检测灵敏度达到了pg/ml，检测线性范围到3-4个数量级，各个毒素检测分别在各自微球表面进行不存在互相干扰问题，具有很好的检测特异性。而且，检测样品试剂仅仅需要10μL，节省了试剂和样品，检测时间小于3小时。该技术可以高通量、快速、灵敏、稳定地检测样本，成本低廉。

附图说明

图1为光子晶体微球流式芯片检测真菌毒素原理图；

图2三种真菌毒素同时检测标准曲线；

图3环氧基修饰温度对检测标准曲线的影响；

图4三种真菌毒素同时检测的特异性。

具体实施方式

本发明所用真菌毒素标准品黄曲霉毒素（AFB₁），伏马毒素（FB₁），和桔青霉毒素（CIT），黄曲霉毒素-牛血清蛋白连接物（AFB1-BSA），吐温-20，γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS），牛血清白蛋白（BSA），交联葡聚糖G-25M和异硫氰酸荧光素（FITC）标记试剂盒购于Sigma-Aldrich。四氧乙基硅烷（TEOS）购于AlfaAesar公司。鼠单克隆抗黄曲霉毒素（AFB₁）抗体，鼠单克隆抗伏马毒素（FB₁）抗体和伏马毒素-牛血清蛋白连接物（FB₁-BSA）购于Abcam(UK)公司。兔单克隆抗桔青霉毒素（CIT）抗体和桔青霉毒素-卵清蛋白连接物（CIT-OVA）由华中农业大学陈福生教授惠赠。甲基硅油购于宇诺公司。氨水、无水乙醇购于南京化学试剂公司。谷物包括玉米、小麦和花生购于南京金润发超市。

本发明所用的仪器主要有：

AM-3250B型磁力搅拌器广州北锐精密仪器有限公司

DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司

BX51型偏光金相显微镜、光纤光谱仪OLYMPUS

KQ-300B型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司

LSP01-1A型蠕动泵保定兰格恒流泵有限公司

高分辨率扫描电子显微镜（JSM-5610LV）日本电子公司，

QL-866微型漩涡混合仪海门麒麟医用仪器厂

SW-CJ-2净化工作台苏州净化仪器有限公司

YXQ-LS-30SII全自动立式高压灭菌器上海博讯实业有限公司

722型紫外可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司

LuxScan10K激光共聚焦生物芯片扫描仪北京博奥生物有限公司

5425R型高速冷冻离心机Effendrof

PHS-3C型精密pH计上海雷磁仪器厂

二氧化硅纳米颗粒的制备：采用

方法合成。

实施例1

玉米、小麦和花生通过高速粉碎机粉碎为粒度小于1mm，称取5克各自试样于100ml的容量瓶中。以甲醇为溶剂准备不同浓度梯度真菌毒素标准品，充分混合试样。这些试样放入通风橱内过夜，蒸发完溶剂。加入的标准品通过6ml三氯甲烷提取。振荡1h后，用whatman过滤纸过滤。收集滤液并放入干燥箱中65℃下蒸发溶剂。提取的毒素试样溶解于2mL，0.01M，pH7.4PBS缓冲液中。同时，按照上述方法提取没有加入标准品的对照试样。

竞争免疫检测：

将修饰后的微球置于反应管中（每管五个），然后分别加入10μL浓度为240，250和260ng/mL的黄曲霉毒素-牛血清蛋白连接物（AFB₁-BSA），伏马毒素-牛血清蛋白连接物（FB₁-BSA）和桔青霉毒素-卵清蛋白连接物（CIT-OVA）的三种不同微球的PBS（0.01M，pH7.4）缓冲液，37℃水浴中反应1h。PBST多次洗涤后，用20μL含有1%BSA的PBS缓冲液对微球上面未和抗原结合的活性基团进行封闭，接着再用PBST缓冲溶液进行洗涤。在每个反应管中分别加入10μL不同浓度梯度的各自真菌毒素的标准溶液（标准曲线）或提取的谷物试样，紧接着再加入10μL异硫氰酸荧光素（FITC）标记过的浓度分别为1.65，0.95，和1.40μg/mL各自毒素单克隆抗体，37℃水浴中反应1h，用PBST多次洗涤微球，然后将微球置于清洗干净的载玻片上进行固定，待载玻片上面的液体基本挥发完后放入芯片扫描仪进行分析，测其荧光强度。用光反射光谱仪分辨不同的微球。

检测结果见表1：

表1

Claims (4)

1.一种用光子晶体微球流式芯片检测真菌毒素的方法，其特征在于，采用光子晶体微球为真菌毒素探针载体，在微球表面进行直接竞争免疫检测多个真菌毒素，以黄曲霉毒素、伏马毒素和桔青霉毒素为检测对象，通过异硫氰酸荧光素标记抗体与微球表面固定抗原竞争各自的抗原，利用共聚焦荧光扫描仪和光子晶体的反射光谱进行解码，对三种真菌毒素同时检测。

2.根据权利要求1所述的方法，包括以下步骤：

（1）光子晶体微球的制备；

（2）光子晶体微球表面的修饰：通过体积比3：7的双氧水与浓硫酸对步骤（1）得到的微球表面进行羟基化修饰，再用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷对微球表面进行环氧基修饰；

（3）抗体标记：通过化学键合方法将黄曲霉毒素、伏马毒素和桔青霉毒素人工抗原固定于经步骤（2）表面修饰的微球表面；

（4）用光子晶体微球流式芯片对待测样品进行竞争免疫检测；利用共聚焦荧光扫描仪和光子晶体的反射光谱进行解码。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤（2）中γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷微球表面进行环氧基修饰时，110℃下烘干45-60mins。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述黄曲霉毒素、伏马毒素和桔青霉毒素人工抗原包被浓度分别为240ng/mL、250ng/mL、260ng/mL，各自抗体反应浓度为1.65，0.95和1.4μg/mL。

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