CN105158459A - 一种水凝胶二氧化硅光子晶体微球化学发光法高灵敏度、低背景检测伏马毒素b1的方法 - Google Patents

一种水凝胶二氧化硅光子晶体微球化学发光法高灵敏度、低背景检测伏马毒素b1的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种水凝胶二氧化硅光子晶体微球化学发光法高灵敏度检测伏马毒素B1的方法，该方法通过在二氧化硅光子晶体微球空隙紫外聚合凝胶，减小微球内部的多孔结构，减小非特异性生物反应的背景信号，提高检测灵敏度和准确度。以该微球表面为伏马毒素B1探针载体，在微球表面构建竞争化学发光免疫检测伏马毒素B1检测体系，利用多功能酶标仪对化学发光信号进行检测，该方法对伏马毒素B1的检测限为0.0001ng/mL，线性检测范围为0.0001到1ng/mL之间，具有检测灵敏度高、背景信号低优点。

Description

一种水凝胶二氧化硅光子晶体微球化学发光法高灵敏度、低背景检测伏马毒素B1的方法
技术领域
本发明设计农产品、饲料和食品中的伏马毒素高灵敏度、低背景、低成本检测技术方法。具体通过自组装技术和紫外聚合技术合成水凝胶二氧化硅光子晶体微球，以该光子晶体为载体，通过在该微球表面构建竞争免疫化学发光、高灵敏度、低背景、低成本检测伏马毒素新方法。
背景技术
伏马毒素(Fumonisin)是由镰刀菌素属(Fusariumgenus)的真菌产生的代谢物。伏马毒素污染范围广泛，在玉米及其制品中尤为明显。伏马毒素主要影响动物的肝脏及肾脏，长期或高剂量接触会诱发肝癌，并且对胚胎、肺、肌肉骨骼等也有不同程度的损伤，尤其是伏马毒素B1(FB1)，能使人类和动物中毒、致癌。食品添加剂联合专家委员会(JECFA)第56次会议确立了一组关于伏马毒素的每日最大容许摄入量(PMTDI)，规定伏马毒素B1(FB1)，伏马毒素B2(FB2)和伏马毒素B3(FB3)单独或者混合的每日最大容许摄入量不超过2μg/kg。高灵敏度、低成本的检测技术方法是预防农产品、食品、饲料中伏马毒素污染和食品安全评估的最有效手段之一。目前常用的伏马毒素检测方法有色谱法、免疫分析法等。但是，色谱技术方法需要昂贵的检测设备，专门的仪器操作技术人员，检测成本高，很难在食品安全生产、销售一线推广和普及；免疫学技术虽然简单易行，但是该技术对有些真菌毒素检测的灵敏度不够，而且检测需要消耗大量的抗体试剂；基于多孔表面免疫方法检测真菌毒素如光子晶体微球液相芯片化学发光方法，由于其检测背景信号高，检测限有限，准确度较差。研究和开发一种新型的高灵敏度、低背景信号、低成本、特异性好的检测技术和方法具有重要的现实意义。
发明内容
本发明提供一种农产品、饲料和食品中的伏马毒素高灵敏度、低背景、低成本检测技术方法。具体通过自组装技术和紫外聚合技术合成水凝胶二氧化硅光子晶体微球，以该光子晶体为载体，通过在该微球表面构建竞争免疫化学发光、高灵敏度、低背景、低成本检测伏马毒素新方法。
本发明微球的制备：将制备的SiO2三维光子晶体微球用食人鱼洗液浸泡2小时，增强其表面的亲水性，使得水凝胶液更易填满微球内部。将处理过的微球放入已配置好的水凝胶溶液的烧杯中浸泡，并每5分钟摇晃一次，以保证SiO2光子晶体微球与水凝胶溶液充分接触，2小时后将烧杯中的水凝胶溶液吸走，将烧杯中放于磁力搅拌器上，加甲基硅油没过转子，以300rpm/min的转速转动2小时，此时微球已经完全分散开。最后将分散开的微球放于紫外灯下照射10秒钟，得到水凝胶液固定。得到的水凝胶SiO2光子晶体微球和SiO2光子晶体微球表面结构对照如图1。
在制备的水凝胶SiO2光子晶体微球表面修饰γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)环氧基，固定伏马毒素B1包被抗原，牛血清蛋白(BSA)封闭。在水凝胶SiO2光子晶体微球表面构建竞争免疫化学发光、高灵敏度、低背景、低成本检测伏马毒素新方法。以辣根过氧化物酶标记的二抗与伏马毒素B1抗体特异性结合，加入鲁米诺、双氧水化学发光底物后，用多功能酶标仪检测化学发光信号值强弱。建立标准曲线和检测食品中的伏马毒素B1。
上述方法包括以下步骤：
(1)水凝胶SiO2光子晶体微球的制备
(2)水凝胶溶液的配制方法：向烧杯中依次添加870微升的双蒸水、丙烯酸20微升、2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮10微升、聚乙二醇二丙烯酸酯100微升，用玻璃棒搅拌充分混匀。(3)水凝胶光子晶体微球表面的修饰：通过体积比3：7的双氧水与浓硫酸对步骤(1)得到的微球表面进行羟基化修饰，再用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)对微球表面进行环氧基修饰；
(4)抗原的固定：通过化学键合的方法将伏马毒素B1人工抗原(FB1-BSA)固定于经步骤(2)表面修饰的微球表面。
(5)用水凝胶光子晶体微球对待测样品进行竞争免疫检测，利用标记有辣根过氧化物酶的二抗与伏马毒素B1抗体进行特异性反应，加入化学发光底物后，用酶标仪对发光信号强度进行检测。
谷物试样的处理：
大米、玉米和小麦使用中药粉碎机粉碎，过20目筛，称取试样各5g于100mL的三角瓶中，向样品中添加不同浓度及体积的伏马毒素B1标准品，充分混合试样后，将其放入通风处内，直至溶剂蒸发完全。向其中加入提取剂(甲醇：水＝6：4)15mL，在摇床内150r/min，提取2小时，用whatman滤纸过滤，滤液即为待测样品。
竞争免疫检测：
将修饰后的微球至于离心管中，每管5球，后加入10μL浓度为1000ng/mL的伏马毒素B1-牛血清蛋白偶联物(FB1-BSA)，4℃下过夜。后用PBST和PBS各清洗微球3次，后向离心管中加入10μL含有1％牛血清蛋白(BSA)的pH＝9.6的碳酸盐缓冲液，对微球表面上未结合抗原的活性基团进行封闭，室温下封闭1小时，后用PBST和PBS各清洗微球3次。向各离心管中依次加入10μL不同浓度梯度的伏马毒素B1标准溶液或提取的谷物试样，接着再向离心管中加入10μL的伏马毒素B1抗体(FB1-Ab)，37℃下竞争结合1.5小时，用PBST和PBS各清洗微球3次后，向离心管中加入10μL的稀释比率为1：6000的辣根过氧化物酶标记的二抗(HRP-IgG)，37℃下反应1小时，用PBST和PBS各清洗微球3次。将微球移入384黑色微孔板中，每孔加入化学发光底物液(双氧水、鲁米诺和对碘苯酚混合物)20μL，用多功能酶标仪检测各孔化学发光强度，积分时间1s。伏马毒素B1的标准曲线见图2。
本发明首先采用改进法合成了单分散纳米二氧化硅微球，通过二氧化硅颗粒自组装技术，组装成结构和均一的光子晶体微球。将光子晶体微球放在蒸馏水中用超声波洗净后将其浸入食人鱼洗液(浓硫酸：双氧水＝7：3)进行清洗，使其表面硅羟基增多，将处理过的微球放入已配置好的水凝胶溶液的烧杯中浸泡，并每5分钟摇晃一次，以保证SiO2光子晶体微球与水凝胶溶液充分接触，2小时后将烧杯中的水凝胶溶液吸走，将烧杯中放于磁力搅拌器上，加甲基硅油没过转子，以300rpm/min的转速转动2小时，此时微球已经完全分散开。最后将分散开的微球放于紫外灯下照射10秒钟，得到水凝胶液固定。利用1％的γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)甲苯溶液浸泡，使其表面修饰环氧基。通过优化包被pH值及化学发光底物反应时间，伏马毒素B1抗原浓度，伏马毒素B1抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗稀释比率，确定了最佳包被pH值为9.6，包被浓度为1000ng/mL，抗体稀释比率分别为1：30000和1：6000，化学发光底物反应时间为5min。
利用水凝胶光子晶体微球具有较大的表面积，内部孔结构填充水凝胶的特点，不但能有效固定大量的靶分子探针，而且能够避免非特异吸附造成的背景信号高的特点。该技术建立的方法检测标准曲线和同粒径下SiO2光子晶体微球、玻璃微球标准曲线比较见图3，很明显，SiO2光子晶体微球具有很高的检测背景信号，表现在该FB1标准曲线下IC50值比水凝胶SiO2光子晶体微球高一个数量级，线性范围也少一个数量级，玻璃微球的FB1标准曲线下IC50值也低于水凝胶SiO2光子晶体微球的IC50值，检测线性范围仅仅1个数量级。建立水凝胶光子晶体微球对伏马毒素B1检测范围在1-0.0001ng/mL之间，对伏马毒素B1在大米、玉米和小麦中的回收率在78.60％～107.59％之间。结构类似的毒素之间无干扰，具有良好的特异性。特异性见图4。
本发明中通过对反应条件进行优化，将化学发光信号值提高，从而扩大检测线性范围，降低了检测背景信号。这一技术对伏马毒素B1的检测灵敏度达到了pg/mL，检测现行范围到5个数量级，结构类似的毒素之间不存在明显的干扰问题，具有良好的检测特异性。而且，检测样品试剂仅仅需要2μL/球，节省了试剂和样品，将包被封闭好的微球直接用于检测，检测时间小于3小时。该技术可以高通量、快速、灵敏、稳定地检测样本，成本低廉。
附图说明
图1SiO2光子晶体微球(A)，水凝胶SiO2光子晶体微球(B)表面结构
图2伏马毒素B1检测标准曲线。
图3同粒径的SiO2光子晶体微球(A)、玻璃微球(B)检测伏马毒素B1检测标准曲线比较。图4伏马毒素B1检测的特异性。
具体实施方式
本发明所用伏马毒素B1标准品(AFB1)，伏马毒素B1-牛血清蛋白偶联物(AFB1-BSA)，四氧乙基硅烷(TEOS)购于Sigma-Aldrich。牛血清蛋白(BSA)，磷酸盐缓冲液(PBS)，鲁米诺购于上海生工有限公司。辣根过氧化物酶标记的二抗(HRP-IgG)，伏马毒素B1抗体(AFB1-Ab)购于Abcam。γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)购于东京化成工业株式会社。甲基硅油购于宇诺公司。氨水、无水乙醇、吐温-20购于南京化学试剂公司。谷物包括大米、玉米和小麦，购于南京热河南路农贸市场。
本发明所用的仪器主要有：
AM-3250B型磁力搅拌器天津奥特赛恩斯仪器有限公司
TDZ5-WS型台式低速自动平衡离心机长沙湘智离心机仪器有限公司
KQ-300B型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司
H600-II型透射电子显微镜日本日立公司
DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司
OTL1200管式炉南京南大仪器厂
LSP01-1A微流注射泵河北保定兰格恒流泵有限公司
PHS-3C-01型pH计上海三信仪表厂
Infinite200多功能酶标仪帝肯(上海)贸易有限公司
ZQTY-70-T型震荡培养箱上海知楚仪器有限公司摇床
中药粉碎机长沙市常宏制药机械设备厂
SW-CJ-2净化工作台苏州净化仪器有限公司
QL-866漩涡混合仪海门麒麟医用仪器厂
单分散二氧化硅纳米颗粒的制备：采用改进法合成。
实施例1
大米、玉米和小麦使用中药粉碎机粉碎，过20目筛，称取试样各5g于100mL的三角瓶中，向样品中添加不同浓度及体积的伏马毒素B1标准品，充分混合试样后，将其放入通风处内，直至溶剂蒸发完全。向其中加入提取剂(甲醇：水＝6：4)15mL，在摇床内150r/min，提取2小时，用whatman滤纸过滤，滤液即为待测样品。同时，按照上述方法提取没有加入标准品的对照试样。
竞争免疫检测：
将修饰后的微球至于离心管中，每管5球，后加入10μL浓度为1200ng/mL的伏马毒素B1-牛血清蛋白偶联物(FB1-BSA)，4℃下过夜。后用PBST和PBS各清洗微球3次，后向离心管中加入10μL含有1％牛血清蛋白(BSA)的pH＝9.6的碳酸盐缓冲液，对微球表面上未结合抗原的活性基团进行封闭，室温下封闭1小时，后用PBST和PBS各清洗微球3次。向各离心管中依次加入10μL不同浓度梯度的伏马毒素B1标准溶液(标准曲线)或提取的谷物试样，接着再向离心管中加入10μL的伏马毒素B1抗体(FB1-Ab)，37℃下竞争结合1.5小时，用PBST和PBS各清洗微球3次后，向离心管中加入10μL的稀释比率为1：6000的辣根过氧化物酶标记的二抗(HRP-IgG)，37℃下反应1小时，用PBST和PBS各清洗微球3次。将微球移入384黑色微孔板中，每孔加入化学发光底物液(双氧水、鲁米诺和对碘苯酚混合物)20μL，用酶标仪检测各孔化学发光强度，积分时间1s。
检测结果见表1：
表1

Claims (3)

1.一种用水凝胶二氧化硅光子晶体微球化学发光法检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，通过在二氧化硅光子晶体微球空隙紫外光照射下聚合凝胶，减小微球内部的多孔结构；以该水凝胶二氧化硅光子晶体微球表面为伏马毒素B1探针载体，在微球表面构建竞争化学发光免疫检测伏马毒素B1检测体系，利用多功能酶标仪对化学发光信号进行检测；
包括以下步骤：
(1)水凝胶二氧化硅光子晶体微球的制备；
(2)水凝胶二氧化硅光子晶体微球的修饰：通过体积比3：7的双氧水与浓硫酸对步骤(1)得到的微球表面进行羟基化修饰，再用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷对微球表面进行环氧基修饰；
(3)抗原的固定：通过化学键合方法将伏马毒素B1人工抗原固定于经过步骤(2)修饰的微球表面；
(4)用水凝胶二氧化硅光子晶体微球对待测样品进行竞争免疫检测；利用多功能酶标仪检测化学发光信号值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)通过两项流自组装技术制备二氧化硅光子晶体微球；通过体积比3：7的双氧水与浓硫酸对二氧化硅光子晶体微球亲水性修饰，水凝胶溶液的组成为丙烯酸：2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮：聚乙二醇二丙烯酸酯：水为20:10:100:870(v/v)，用玻璃棒搅拌充分混匀；将处理过的微球放入已配置好的水凝胶溶液的烧杯中浸泡，并每5分钟摇晃一次，2小时后将烧杯中的水凝胶溶液吸走，将烧杯中放于磁力搅拌器上，加入甲基硅油没过转子，以300rpm/min的转速转动2小时，最后将分散开的微球放于紫外灯下照射10秒钟，得到水凝胶二氧化硅光子晶体微球。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述伏马毒素B1人工抗原包被浓度为1000ng/mL，抗体稀释比率为1：30000，二抗稀释比率为1：6000。
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