CN109738635A - 一种检测黄曲霉毒素b1的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒及其制备方法，涉及化学测试分析技术领域。试剂盒的制备方法，包括制备铂金二氧化硅纳米微球信号标签和四氧化三铁纳米微球捕获剂；再将制备好的上述试剂混合放入玻璃容器中，然后超声，再加热；将反应所得的产物反复用磁场清洗，分散到水中；再将反应所得的产物溶液滴入反应板的各个反应孔内，则得到检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒。本发明中铂金二氧化硅纳米微球的引入在很大程度上解决了自然酶存在分离纯化难、合成成本高、耐酸碱性差等缺点。本发明中适配体的对于小分子的结合力强，空间位阻小，很适合对小分子进行检测。本发明中采用磁力吸附可以提高ELISA的检测性能。

Description

一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及化学测试分析技术领域，具体的说，涉及一种可视化检测黄曲霉毒素B1的试剂盒及其制备方法。

背景技术

黄曲霉毒素B1(AFB1)是由黄曲霉寄生曲霉产生的次生代谢产物，主要存在于土壤、动植物和坚果中。其中，最容易受AFB1污染的食品有花生、玉米、稻米、大豆、小麦等。AFB1在已知的霉菌毒素中毒性最大，是已知的化学物质中致癌性最强的一种，它对人类健康的危害十分严重，可引发人类肝癌和食道癌。AFB1对人和动物都具有强烈的毒性，主要表现对肝脏的损害，微量持续摄入，可造成慢性中毒，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。国家质检总局规定AFB1是大部分食品的必检项目之一，随着市场监管范围的扩大以及检测指标限量值的降低，对检测技术的要求也越来越高。因此，发展简便快速的方法检测食品中的AFB1以满足市场需求显得十分迫切。

目前，检测AFB1的方法主要有高效液相色谱法、液相色谱/质谱联用法、免疫层析法、荧光光度法和酶联免疫分析法等。高效液相色谱法和液相色谱/ 质谱联用法能够获得较高的检测准确度，但是其检测周期长，仪器成本高，并且需要培养专业的操作人员，因此不适合进行现场的快速分析检测。免疫层析法具有快速、简单、成本低等优点，但该方法最大的缺点是灵敏度低，精密度较差，并且只能使用抗体-抗原识别模式进行检测，不适合AFB1这类小分子的分析检测。荧光光度法的灵敏度比较高，其灵敏度可以达到pM水平，但由于该方法容易受溶液中离子和其他物质的干扰，其特异性和准确度还有待提高。酶联免疫(ELISA)法具有特异性强、操作方法简单、易于商品化和自动化等优点，它在食品、生物和环境等相关分析领域备受研究者的青睐。

然而，传统的ELISA法具有操作过程繁琐、试剂盒成本高、检测周期长、易出现假阳性等缺点，这极大地限制了它在市场上的广泛应用。传统ELISA 是将酶标记到抗体上作为信号标签，通过酶的催化作用催化底物显色，但是自然酶存在分离纯化难、合成成本高、耐酸碱性差等缺点。(2)传统ELISA的识别仅限于抗体和抗原的大分子识别，由于蛋白质的结合位点和空间位阻的影响，用传统ELISA检测小分子物质是一个很大的挑战。(3)由于ELISA的包被主要依靠蛋白质与基底之间的物理吸附作用，这必然存在非特异性吸附和吸附不牢靠的因素，从而影响ELISA的检测性能。

发明内容

本发明的目的是提供一种可视化检测黄曲霉毒素B1的试剂盒及其制备工艺。

本发明的检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的制备方法，包括：

步骤1、制备铂金二氧化硅纳米微球信号标签和四氧化三铁纳米微球捕获剂；

步骤2、将步骤1制备好的所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签与所述四氧化三铁纳米微球捕获剂混合放入玻璃容器中，然后超声、加热得到产物；

步骤3、将步骤2所制备的产物反复用磁场清洗，分散到水中得到产物溶液；

步骤4、再将步骤3所制备的产物溶液滴入反应板的各个反应孔内，则得到检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒。

本发明中纳米酶也就是铂金二氧化硅纳米微球的引入在很大程度上解决了自然酶存在分离纯化难、合成成本高、耐酸碱性差等缺点。本发明中适配体的对于小分子的结合力强，空间位阻小，很适合对小分子进行检测。本发明中采用磁力吸附可以提高ELISA的检测性能。

优选地，检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的制备方法中，步骤2具体包括：

所述的将步骤1制备好的所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签与所述四氧化三铁纳米微球捕获剂混合放入玻璃容器中反应的时间至少为20min；所述的超声的时间为5min，所述的加热的条件为95℃以上持续10min；所述的铂金二氧化硅纳米微球信号标签的粒径为40nm～900nm；所述的四氧化三铁纳米微球捕获剂的粒径为80nm～900nm；所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签和所述四氧化三铁纳米微球捕获剂的体积比为1：1。

进一步，优选地，所述的将步骤1制备好的所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签与所述四氧化三铁纳米微球捕获剂混合放入玻璃容器中反应的时间优选为20min；所述的铂金二氧化硅纳米微球信号标签的粒径优选为900nm；所述的四氧化三铁纳米微球捕获剂的粒径优选为400nm。

优选地，制备所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签包括以下步骤：

步骤A1、将四氯金酸和柠檬酸三钠用水定容后加入硼氢化钠溶液搅拌后获得金纳米粒子，将所述金纳米粒子离心洗涤后分散在水中，得到金纳米粒子溶液；

步骤A2、将三乙胺加入水搅拌后，加入十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸，正硅酸乙酯反应后，再加入盐酸甲醇溶液反应，取以上配置而成的部分溶液加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌后得到氨基化二氧化硅纳米微球，将所述氨基化二氧化硅纳米微球离心清洗取沉淀后分散在水中，得到氨基化二氧化硅纳米微球溶液；

步骤A3、将所述氨基化二氧化硅纳米微球加入所述金纳米粒子溶液，超声搅拌反应，得到红色的金二氧化硅纳米微球；

步骤A4、将所述红色的金二氧化硅纳米微球离心洗涤后分散在水中，得到红色的金二氧化硅纳米微球溶液，在所述红色的金二氧化硅纳米微球溶液中加入氯铂酸后搅拌再加入硼氢化钠溶液反应，获得铂金二氧化硅纳米微球，分散到水中，得到铂金二氧化硅纳米微球溶液；

步骤A5、取戊二醛原液加入到所述铂金二氧化硅纳米微球溶液孵育，将反应所得的溶液离心洗涤，分散到水中，得到戊二醛修饰过的铂金二氧化硅纳米微球溶液，再加入氨基化修饰的适配体DNA互补链并搅拌，获得所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签。

进一步，优选地，制备所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签具体包括：

所述步骤A1具体包括：步骤A11、将四氯金酸加入柠檬酸三钠用水定容后，在不断搅拌的条件下加入冰浴过后的硼氢化钠溶液，搅拌后获得金纳米粒子，将所述金纳米粒子离心洗涤后分散在水中，得到金纳米粒子溶液；

所述步骤A2具体包括：步骤A21、将三乙胺加入水磁力搅拌后，加入十六烷基三甲基溴化铵和水杨酸反应，再加入正硅酸乙酯反应，取出冷却后离心清洗取沉淀，然后加入盐酸甲醇溶液反应后，取出冷却后离心清洗取沉淀分散于乙醇中，取以上配置而成的溶液加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在室温下搅拌后，离心清洗取沉淀分散于水中，得到氨基化二氧化硅纳米微球溶液；

所述步骤A4具体包括：步骤A41、将所述红色的金二氧化硅纳米微球离心洗涤后分散在水中，得到红色的金二氧化硅纳米微球溶液，在不断搅拌的条件下加入氯铂酸搅拌后，加入现配冰浴过的硼氢化钠溶液，反应所得的溶液离心洗涤获得铂金二氧化硅纳米微球，分散到水中，得到铂金二氧化硅纳米微球溶液；

所述步骤A5具体包括：步骤A51、取戊二醛原液加入到所述铂金二氧化硅纳米微球溶液中并在室温下孵育，反应所得的戊二醛修饰过的铂金二氧化硅纳米微球溶液离心洗涤，分散到水中，然后加入氨基化修饰的适配体DNA互补链并在室温下搅拌反应，适配体互补链序列为：5'－ACACGTGCCCAACAA AAAA－3'。反应所得的溶液离心洗涤获得所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签，分散到水中，得到铂金二氧化硅纳米微球信号标签溶液。

进一步，优选地，在所述步骤A1或A11中，所述的将四氯金酸和柠檬酸三钠用水定容后所得的溶液中，四氯金酸的浓度为2.5ⅹ10^-2mmol/L，柠檬酸三钠的浓度为73.5mg/L；所述的加入硼氢化钠溶液与所述的将四氯金酸和柠檬酸三钠用去离子水定容后所得的溶液与硼氢化钠溶液的体积比为3：100，并且该溶液中硼氢化钠的浓度为3ⅹ10^-3mol/L，所述的搅拌时间优选为10～15min，最优选为15min；所述的金纳米粒子溶液的浓度为4～4.9mg/L，最佳优选浓度为 4.9mg/L；

在所述步骤A2或A21中，所述的将三乙胺加入水，所得的三乙胺水溶液浓度为2.7～2.76g/L，最优选为2.72g/L，所述的加入十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸与三乙胺的质量比为8：1～4：1.4～1.5，最优选为8：2：1.48，正硅酸乙酯、盐酸甲醇溶液、乙醇与三乙胺水溶液的体积比为4：25：4：25；所述的由以上配置而成的部分溶液与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为120：1，所述的在室温下搅拌的时间为5～6h，最优选为6h；

其中，所述的将三乙胺加入水搅拌为磁力搅拌，温度为80℃，时间至少为 0.5h，最优选为0.5h；所述的加入十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸和正硅酸乙酯反应温度为80℃，时间至少为1h，最优选为1h；所述的盐酸甲醇溶液中盐酸：甲醇体积比为1：9～11，最优选为1：10，所述的加入盐酸甲醇溶液的反应温度为60～80℃，最优选为60℃；所述的氨基化二氧化硅纳米微球溶液的浓度为86～100mg/L，最佳优选浓度为86mg/L；

在所述步骤A3中，氨基化二氧化硅纳米微球与所述金纳米粒子溶液体积比小于1：5，最优选为1：6；所述超声搅拌反应时间至少为10min，最优选为 15min；

在所述步骤A4或A41中，所述的红色的金二氧化硅纳米微球溶液的浓度为19.4mg/L，所述的在所述红色的金二氧化硅纳米微球溶液溶液中加入氯铂酸后所得到的溶液中，氯铂酸的浓度为0.47mol/L，所述的加入硼氢化钠溶液后所得的溶液中，硼氢化钠的浓度为4.8ⅹ10^-5mol/L，所述铂金二氧化硅纳米微球溶液的浓度为18.2～31.2mg/L，最佳优选浓度为18.2mg/L；所述的加入氯铂酸搅拌的时间至少为10min，最优选为10min；

在所述步骤A5或A51中，戊二醛原液和所述铂金二氧化硅纳米微球溶液体积比为1：5；所述的取戊二醛原液加入到所述铂金二氧化硅纳米微球溶液中并在室温下孵育时间至少为30min，最优选为30min；所述的戊二醛修饰过的铂金二氧化硅纳米微球溶液再加入氨基化修饰的适配体DNA互补链后所得到的溶液中，所述氨基化修饰的适配体DNA互补链的浓度为0.46～0.60nmol/mL，最佳优选浓度为0.46nmol/mL。

所述的加入氨基化修饰的适配体DNA互补链并在室温下搅拌反应时间至少为30min，最优选为30min；所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签的浓度为 0.19～0.30mg/L，最佳优选浓度为0.19mg/L。

本技术方案中铂金二氧化硅纳米微球的引入在很大程度上解决了自然酶存在分离纯化难、合成成本高、耐酸碱性差等缺点。本发明中适配体的对于小分子的结合力强，空间位阻小，很适合对小分子进行检测。

优选地，制备所述四氧化三铁纳米微球捕获剂具体包括以下步骤：

步骤B、取戊二醛原液加入到四氧化三铁纳米微球溶液中并在室温下孵育；反应所得的戊二醛修饰过的四氧化三铁纳米微球溶液离心洗涤，分散到水中；加入氨基化修饰的适配体DNA链并在室温下搅拌反应，适配体DNA链序列为： 5'－GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC －3'得到的溶液用磁场洗涤获得四氧化三铁纳米微球捕获剂。

进一步，优选地，在所述步骤B中，所述的四氧化三铁纳米微球溶液浓度为1～1.6ⅹ10^-9mol/L，最优选为1ⅹ10^-9mol/L；所述的取戊二醛原液加入到四氧化三铁纳米微球溶液中并在室温下孵育时间至少为30min，最优选为30min；戊二醛原液与四氧化三铁纳米微球溶液的体积比为1：5；所述的加入氨基化修饰的适配体DNA链并在室温下搅拌反应时间至少为30min，最优选为30min。所述的反应所得的戊二醛修饰过的四氧化三铁纳米微球溶液离心洗涤，分散到水中；加入氨基化修饰的适配体DNA链后所得到的溶液中，所述氨基化修饰的适配体DNA链的浓度为2.45nmol/ml；所述四氧化三铁纳米微球捕获剂的浓度为1～1.6ⅹ10^-9mol/L，最佳优选浓度为1ⅹ10^-9mol/L。

本发明还提供一种检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒，还包括；

反应板，板体上开设多个大小相同的孔，纵向或者横向相邻两个孔的距离均相同；所述反应板的孔中的存放的试剂为铂金二氧化硅纳米微球信号标签和四氧化三铁纳米微球捕获剂的产物溶液。

进一步，优选地，所述反应板的底部装配一个可自动拆卸的盒子，所述盒子内衬的大小为与所述反应板的大小相同；在所述盒子内放置同样规格大小的磁铁。

采用这样的设计能够方便地进行捕获、富集、分离和洗涤操作，减少ELISA 的包板和洗涤时间。

优选地，该试剂盒还包括：

黄曲霉素标准比色卡；利用所述反应板的孔中的混合液与不同浓度的黄曲霉素B1标准溶液进行显色反应，根据显色结果制成所述黄曲霉素标准比色卡。

试剂盒中所述的黄曲霉素B1标准比色卡按如下步骤制备：

配制摩尔浓度分别为a)0μg/mL；b)1μg/mL；c)10μg/mL；d)50μg/mL；e) 100μg/mL；f)200μg/mL和g)400μg/mL；7个点的黄曲霉素B1标准溶液，用所述的黄曲霉素B1可视化检测的试剂盒分别与以上述7个点的黄曲霉素B1 标准溶液进行显色，根据黄曲霉素B1标准溶液的显色结果制作黄曲霉素B1 标准色块，将黄曲霉素B1标准色块按照黄曲霉素B1标准溶液浓度的高低顺序进行排列，粘贴制成黄曲霉素B1可视化检测的标准比色卡。

与现有技术相比，本发明提供的一种检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒具有以下有益效果：

本发明中纳米酶也就是铂金二氧化硅纳米微球的引入在很大程度上解决了自然酶存在分离纯化难、合成成本高、耐酸碱性差等缺点。本发明中适配体对小分子的结合力强，空间位阻小，很适合对小分子进行检测。本发明中采用磁力吸附可以有效改善非特异性吸附和吸附不牢靠，提高ELISA的检测性能。

附图说明

下面将以明确易懂的方式，结合附图说明优选实施方式，对一种检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的上述特性、技术特征、优点及其实现方式予以进一步说明。

图1为检测黄曲霉素试剂盒的原理图；

图2为96孔板的正面结构参数图；

图3为96孔板的侧面结构参数图；

图4是捕获DNA和信号标签反应时间与吸光度的柱状图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对照附图说明本发明的具体实施方式。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，并获得其他的实施方式。

本发明所制备的样品通过以下手段对进行结构表征：采用马尔文Zeta电位粒径测定仪测定所制备样品的粒径；采用透射电镜观察所制备样品的孔径。

下面结合具体实施例对本发明是如何实现的做进一步详细、清楚、完整地说明，所列实施例仅对本发明予以进一步说明，并不因此而限制本发明：

实施例1

本发明的快速检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的制备方法，包括：

步骤1：制备铂金二氧化硅纳米微球信号标签和四氧化三铁纳米微球捕获剂。

步骤2：取1mL粒径为900nm，浓度为0.19mg/L的铂金二氧化硅纳米微球信号标签和1mL粒径为400nm，浓度为1ⅹ10^-9mol/L的四氧化三铁纳米微球捕获剂混合放入玻璃容器中20min后超声5min，后加热至95℃持续10min，得到产物。

步骤3：将步骤2反应所得的产物反复用磁场清洗，分散到2mL水中。

步骤4：将步骤3反应所得的产物溶液各取10μL滴入96孔反应板的各个反应孔内，则得到检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒。

用酶标仪检测实施例1显色后溶液的吸光值。

实施例1的磁力清洗显色后溶液的吸光值结果如表1和图4所示，表明步骤31中铂金二氧化硅纳米微球信号标签和四氧化三铁纳米微球捕获剂混合放入玻璃容器中反应20min吸光值较高，表明两者结合数大。

对照组1

步骤2中取1mL粒径为900nm，浓度为0.19mg/L的铂金二氧化硅纳米微球信号标签和1mL粒径为400nm，浓度为1ⅹ10^-9mol/L的四氧化三铁纳米微球捕获剂混合放入玻璃容器中反应5～30min，其余步骤如实施例1，用酶标仪检测其磁力清洗显色后溶液的吸光值，实验结果的柱状图如图4，数值结果如表1所示：

表1

由表1可知，铂金二氧化硅纳米微球信号标签通过适配体与cDNA双链互补结合四氧化三铁纳米微球捕获剂的在20min时吸光值高，表明两者的结合数大，20min之后吸光值趋于平稳，故选取20min为最佳反应时间。

实施例2

制备所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签具体包括以下步骤：

步骤A1、取1.04mL浓度为24mmol/L的四氯金酸，加入7.3535mg柠檬酸三钠后定容至100mL，在不断搅拌的条件下加入3mL冰浴过浓度为0.1mol/L 的硼氢化钠溶液，搅拌24h后获得金纳米粒子，将金纳米粒子离心洗涤后分散在100mL水中备用。

步骤A2、取68mg三乙胺加入25mL水，80℃下磁力搅拌0.5h后，加入 368mg十六烷基三甲基溴化铵和92mg水杨酸80℃下反应1h后，加入4mL正硅酸乙酯80℃下反应1h后，取出冷却后离心清洗取沉淀，后加入25mL盐酸甲醇溶液，盐酸甲醇溶液体积比为1：10，在60℃下反应，后取出冷却后离心清洗取沉淀分散于25mL乙醇中；取其中5mL加入600μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷在室温下搅拌6h，后离心清洗取沉淀分散于30mL水中得氨基化二氧化硅纳米微球。

步骤A3、取浓度为1ⅹ10^-9mol/L氨基化二氧化硅纳米微球1mL，加入6mL 所述金纳米粒子溶液后，超声搅拌反应15min，得到红色的金二氧化硅纳米微球。

步骤A4、将红色的金二氧化硅纳米微球离心洗涤后分散在8mL水中，在搅拌条件下加入200μL浓度为19.3mmol/L氯铂酸，搅拌15min后加入1mL现配冰浴过浓度为0.439mmol/L的硼氢化钠，反应所得的溶液离心洗涤获得铂金二氧化硅纳米微球，分散到1mL水中备用。

步骤A5、取1mL戊二醛原液加入到5mL铂金二氧化硅纳米微球溶液中并在室温下孵育1h。将反应所得的戊二醛修饰过的铂金二氧化硅纳米微球溶液离心洗涤，分散到5mL水中；然后加入0.5mL浓度为5.1nmol/mL氨基化修饰的适配体DNA互补链并在室温下搅拌反应1h，适配体互补链序列为：5'－ ACACGTGCCCAACAAAAAA－3'。将反应所得的溶液离心洗涤获得铂金二氧化硅纳米微球信号标签分散到5mL水中备用。

由表2可知，实施例2所制备的样品粒径200nm，孔径大。

对照组2

步骤A2中取68mg三乙胺加入25mL水，80℃下磁力搅拌0.5h后，加入 368mg十六烷基三甲基溴化铵和46mg水杨酸，其余操作步骤如实施例2，作为对照组。

另外步骤A2中取68mg三乙胺加入25mL水，80℃下磁力搅拌0.5h后，加入368mg十六烷基三甲基溴化铵和184mg水杨酸，其余操作步骤如实施例2，作为另一组对照组。

表2

由表2可知，加入368mg十六烷基三甲基溴化铵和184mg水杨酸用于合成多孔二氧化硅孔径与其他时间相比相对较大，多孔二氧化硅用于负载纳米金及纳米铂，孔径越大意味着可以搭载更多的铂金纳米颗粒，使后续的显色效果更强，故368mg十六烷基三甲基溴化铵和92mg水杨酸为最优工艺。

对照组3

步骤A2中，加入4mL正硅酸乙酯80℃下分别反应1h、2h和3h后，其余步骤如实施例2，结果如表3所示。

时间	粒径	孔径大小
			1h	100nm	大
2h	200nm	大
			3h	400nm	大

表3

由表3可知，反应1h后多孔二氧化硅粒径最小，孔径与其他时间相比并无明显变化，多孔二氧化硅用于负载纳米金及纳米铂，粒径越小意味着检测体系越稳定，故1h为最优工艺。

实施例3

试剂盒中的反应板为96孔反应板，如图1所示，板体上开设了96个大小相同的孔，分为8行12列，纵向或横向相邻两个孔的距离均相同。在反应板底部装配了一个可自动拆卸的盒子，如图2所示，盒子的内衬的长和宽与96 孔反应板相同，高度为14.35mm。在该盒子内放置同样规格大小的磁铁。

另外，96孔板的反应孔中存放铂金二氧化硅微球信号标签与四氧化三铁纳米微球捕获剂的产物溶液。

采用这样的设计能够方便地进行捕获、富集、分离和洗涤操作，减少ELISA 的包板和洗涤时间。

并且由于试剂盒中放置磁铁的盒子可自动拆卸，并与96孔板适配，当试剂盒中溶液使用完后，可自行配置溶液，使用时只需将盒子装配于所需孔板上即可。

实施例4

试剂盒中还包括：黄曲霉素标准比色卡。该比色卡是利用反应板的孔中的混合液与不同浓度的黄曲霉素B1标准溶液进行显色反应，根据显色结果制成的。

试剂盒中所述的黄曲霉素B1标准比色卡按如下步骤制备：

配制摩尔浓度分别为a)0μg/mL；b)1μg/mL；c)10μg/mL；d)50μg/mL；e) 100μg/mL；f)200μg/mL和g)400μg/mL；7个点的黄曲霉素B1标准溶液，用所述的黄曲霉素B1可视化检测的试剂盒分别与以上述7个点的黄曲霉素B1 标准溶液进行显色，根据黄曲霉素B1标准溶液的显色结果制作黄曲霉素B1 标准色块，将黄曲霉素B1标准色块按照黄曲霉素B1标准溶液浓度的高低顺序进行排列，粘贴制成黄曲霉素B1可视化检测的标准比色卡。

该比色卡通过与样品的检测结果进行对比，可直接得到样品的黄曲霉素B1 的含量或范围。

实施例5

本试剂盒显色原理，如图1所示，当没有黄曲霉素B1(AFB1)存在时，捕获DNA(AFB1aptamer)和互补DNA(cDNA)结合，从而引入铂金二氧化硅纳米微球信号标签(APS)催化H₂O₂溶液分解，导致3,3',5,5'-四甲基联苯胺 (TMB)产生可溶性蓝色产物，此时的吸光值较较高，记作A0；当待测物存在时，黄曲霉毒素B1(AFB1)会与适配体特异性结合，从而竞争cDNA导致 APS脱落，被洗脱后，导致TMB产生可溶性蓝色产物较少，此时的吸光值较低，记作A1。当待测物浓度不断增大时，竞争cDNA会导致APS信号标签越多被清洗，TMB产生可溶性蓝色产物较少，因此显色后溶液的吸光值就越低。吸光值的改变量(ΔA＝A0-A1)和待测物浓度在一定范围内成正比例关系，通过该数量关系式可以对待测物进行定量检测。

应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1、制备铂金二氧化硅纳米微球信号标签和四氧化三铁纳米微球捕获剂；

步骤2、将步骤1制备好的所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签与所述四氧化三铁纳米微球捕获剂混合放入玻璃容器中，然后超声、加热得到产物；

步骤3、将步骤2所制备的产物反复用磁场清洗，分散到水中得到产物溶液；

步骤4、再将步骤3所制备的产物溶液滴入反应板的各个反应孔内，则得到检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒。

2.如权利要求1所述的检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤2具体包括：

所述的将步骤1制备好的所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签与所述四氧化三铁纳米微球捕获剂混合放入玻璃容器中反应的时间至少为20min；所述的超声的时间为5min，所述的加热的条件为95℃以上持续10min；所述的铂金二氧化硅纳米微球信号标签的粒径为40nm～900nm；所述的四氧化三铁纳米微球捕获剂的粒径为80nm～900nm；所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签和所述四氧化三铁纳米微球捕获剂的体积比为1：1。

3.如权利要求2所述的检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤2中：

所述的将步骤1制备好的所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签与所述四氧化三铁纳米微球捕获剂混合放入玻璃容器中反应的时间为20min；所述的铂金二氧化硅纳米微球信号标签的粒径为900nm；所述的四氧化三铁纳米微球捕获剂的粒径为400nm。

4.如权利要求1所述的用于检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的制备方法，其特征在于，制备所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签具体包括以下步骤：

步骤A1、将四氯金酸和柠檬酸三钠用去离子水定容后加入硼氢化钠溶液搅拌后获得金纳米粒子，将所述金纳米粒子离心洗涤后分散在水中，得到金纳米粒子溶液；

步骤A2、将三乙胺加入水搅拌后，加入十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸，正硅酸乙酯反应后，再加入盐酸甲醇溶液反应，取以上配置而成的部分溶液加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌后得到氨基化二氧化硅纳米微球，将所述氨基化二氧化硅纳米微球离心清洗取沉淀后分散在水中，得到氨基化二氧化硅纳米微球溶液；

步骤A3、将所述氨基化二氧化硅纳米微球加入所述金纳米粒子溶液，超声搅拌反应，得到红色的金二氧化硅纳米微球；

步骤A4、将所述红色的金二氧化硅纳米微球离心洗涤后分散在水中，得到红色的金二氧化硅纳米微球溶液，在所述红色的金二氧化硅纳米微球溶液中加入氯铂酸后搅拌再加入硼氢化钠溶液反应，获得铂金二氧化硅纳米微球，分散到水中，得到铂金二氧化硅纳米微球溶液；

步骤A5、取戊二醛原液加入到所述铂金二氧化硅纳米微球溶液孵育，将反应所得的溶液离心洗涤，分散到水中，得到戊二醛修饰过的铂金二氧化硅纳米微球溶液，再加入氨基化修饰的适配体DNA互补链并搅拌，获得所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签。

5.如权利要求4所述的用于检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的制备方法，其特征在于，制备所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签具体包括：

在所述步骤A1中，所述的将四氯金酸和柠檬酸三钠用去离子水定容后所得的溶液中，四氯金酸的浓度为2.5ⅹ10^-2mmol/L，柠檬酸三钠的浓度为73.5mg/L；所述的加入硼氢化钠溶液与所述的将四氯金酸和柠檬酸三钠用去离子水定容后所得的溶液与硼氢化钠溶液的体积比为3：100，并且该溶液中硼氢化钠的浓度为3ⅹ10^-3mol/L，所述的搅拌时间为10～15min；所述的金纳米粒子溶液的浓度为4～4.9mg/L；

在所述步骤A2中，所述的将三乙胺加入水，所得的三乙胺水溶液浓度为2.7～2.76g/L，所述的加入十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸与三乙胺的质量比为8：1～4：1.4～1.5，正硅酸乙酯、盐酸甲醇溶液、乙醇与三乙胺水溶液的体积比为4：25：4：25；所述的以上配置而成的部分溶液与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为120：1，所述的在室温下搅拌的时间为5～6h；

其中，所述的将三乙胺加入水搅拌为磁力搅拌，温度为80℃，时间至少为0.5h；所述的加入十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸，正硅酸乙酯反应温度为80℃，时间至少为1h；所述的盐酸甲醇溶液中盐酸：甲醇体积比为1：9～11，所述的加入盐酸甲醇溶液的反应温度为60～80℃；所述的氨基化二氧化硅纳米微球溶液的浓度为86～100mg/L；

在所述步骤A3中，氨基化二氧化硅纳米微球与所述金纳米粒子溶液体积比小于1：5；所述超声搅拌反应时间至少为10min；

在所述步骤A4中，所述的红色的金二氧化硅纳米微球溶液的浓度为19.4mg/L，所述的在所述红色的金二氧化硅纳米微球溶液溶液中加入氯铂酸后所得到的溶液中，氯铂酸的浓度为0.47mol/L，所述的加入硼氢化钠溶液后所得的溶液中，硼氢化钠的浓度为4.8ⅹ10^{- 5}mol/L，所述铂金二氧化硅纳米微球溶液的浓度为18.2～31.2mg/L；所述的加入氯铂酸搅拌的时间至少为10min；

在所述步骤A5中，戊二醛原液和所述铂金二氧化硅纳米微球溶液体积比为1：5；所述的取戊二醛原液加入到所述铂金二氧化硅纳米微球溶液中并在室温下孵育时间至少为30min；所述的戊二醛修饰过的铂金二氧化硅纳米微球溶液再加入氨基化修饰的适配体DNA互补链后所得到的溶液中，所述氨基化修饰的适配体DNA互补链的浓度为0.46～0.60nmol/mL；

所述的加入氨基化修饰的适配体DNA互补链并在室温下搅拌反应时间至少为30min；所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签的浓度为0.19～0.30mg/L。

6.如权利要求1所述的用于检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的制备方法，其特征在于，制备所述四氧化三铁纳米微球捕获剂具体包括以下步骤：

步骤B、取戊二醛原液加入到四氧化三铁纳米微球溶液中并在室温下孵育；反应所得的戊二醛修饰过的四氧化三铁纳米微球溶液离心洗涤，分散到水中；加入氨基化修饰的适配体DNA链并在室温下搅拌反应，得到的溶液用磁场洗涤获得四氧化三铁纳米微球捕获剂。

7.如权利要求6所述的用于检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的制备方法，其特征在于，制备所述四氧化三铁纳米微球捕获剂具体包括：

在所述步骤B中，所述的四氧化三铁纳米微球溶液浓度为10^-9mol/L；所述的取戊二醛原液加入到四氧化三铁纳米微球溶液中并在室温下孵育时间至少为30min；戊二醛原液与四氧化三铁纳米微球溶液的体积比为1：5；所述的加入氨基化修饰的适配体DNA链并在室温下搅拌反应时间至少为30min；所述的反应所得的戊二醛修饰过的四氧化三铁纳米微球溶液离心洗涤，分散到水中；加入氨基化修饰的适配体DNA链后所得到的溶液中，所述氨基化修饰的适配体DNA链的浓度为2.45nmol/ml；所述四氧化三铁纳米微球捕获剂的浓度为1～1.6ⅹ10^-9mol/L。

8.一种检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒，其特征在于，由权利要求1-7任意一项所述的用于检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的制备方法制备而成，还包括；

反应板，板体上开设多个大小相同的孔，纵向或者横向相邻两个孔的距离均相同；所述反应板的孔中存放的试剂为铂金二氧化硅纳米微球信号标签和四氧化三铁纳米微球捕获剂的产物溶液。

9.如权利要求8所述的一种检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒，其特征在于：

所述反应板的底部装配一个可自动拆卸的盒子，所述盒子的内衬大小为与所述反应板的大小相同；在所述盒子内放置同样规格大小的磁铁。

10.如权利要求8所述的一种检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒，其特征在于：还包括：

黄曲霉素标准比色卡；利用所述反应板的孔中的混合液与不同浓度的黄曲霉素B1标准溶液进行显色反应，根据显色结果制成所述黄曲霉素标准比色卡。