CN109142720A - 一种检测黄曲霉毒素b1的纳米复合物试纸条及制备方法 - Google Patents

一种检测黄曲霉毒素b1的纳米复合物试纸条及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种检测黄曲霉毒素B1的纳米复合物试纸条及制备方法。一种检测黄曲霉毒素B1的纳米复合物试纸条，由样品垫、结合垫、NC膜、吸收垫四部分组成，并按一定组装顺序依次粘贴在PVP底板上。其中，结合垫上包被有纳米金‑纳米二氧化硅复合物标记黄曲霉毒素B1抗体，NC膜上的检测线和控制线分别包被有黄曲霉毒素B1抗体和羊抗鼠IgG溶液。采用竞争法，通过将试纸条放入金标试纸阅读分析仪进行信号转化获取响应值，制作标准曲线后，实现了对黄曲霉毒素B1的定量检测，具有灵敏度高，特异性强，稳定性好，反应时间短，操作方便等优点，可用于黄曲霉毒素B1的现场快速检测。

Description

一种检测黄曲霉毒素B1的纳米复合物试纸条及制备方法
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，涉及一种检测黄曲霉毒素B1的纳米复合物试纸条及制备方法。
背景技术
黄曲霉毒素属于真菌毒素，是由黄曲霉菌、寄生曲霉菌等一系列真菌在一定条件下所产生的一组次级代谢产物。黄曲霉菌是普遍存在且广泛分布的微生物，世界范围内绝大多数地区都能发现。研究发现，黄曲霉毒素普遍存在于粮食、油料作物及其制品、干果、发酵产品、风味调味品及饲料等生活中所能接触到的天然作物与工业制品中，特别是油料作物及其制品最容易受到污染。目前已知结构的黄曲霉毒素有20余种，相对分子质量在312至346之间，结构十分相似，差别只存在于个别基团的不同。其中黄曲霉毒素B1的毒性最强，分布最广，具有致癌、致畸、致突变的作用，是世界卫生组织划定的I类致癌物，是已知毒性最强的真菌毒素。
目前，对黄曲霉毒素B1的检测的方法可大致概括为三类：生物鉴定法、仪器分析法与生物传感器分析法。但这些方法由于检测时间较长，对检测人员技术水平要求较高等原因不适用于现场的快速检测。免疫层析试纸条生物传感器具有生产成本低，不需要专业人员操作，使用方便快速的特点，因此可用于黄曲霉毒素B1毒素的现场快速检测。
纳米金易于合成和进行表面修饰、颜色鲜艳、制作成本不高，因此作为传统的标记物被应用于免疫层析试纸条传感器，具有一定的优势。但是，由于受到纳米金信号强度的限制，导致纳米金免疫层析试纸条的检测灵敏度不够理想，通常只能进行视觉定性或者半定量的分析。以纳米二氧化硅颗粒为基础材料进行目的性的表面修饰，将大量的纳米金颗粒通过静电吸附至纳米二氧化硅颗粒表面固定生长，制备纳米金-纳米二氧化硅颗粒复合物（Au@SiO2）。与单一纳米金相比，纳米复合物能够有效提高免疫反应的效率和检测线上纳米金的富集量，显著增强响应信号，从而达到提高灵敏度的目的。
专利一种检测黄曲霉毒素B1的试纸卡及其应用（公开号 103575887B）公开了一种检测黄曲霉毒素B1的试纸卡。试纸卡采用胶体金标记黄曲霉毒素B1 单克隆抗体，发明适用于大量样品的初步筛查，无法做到精确的定量分析。专利一种检测玉米中黄曲霉毒素的检测卡（公开号106680481A）公开了一种检测玉米种黄曲霉毒素的检测卡。检测卡采用胶体金颗粒标记黄曲霉毒素单克隆抗体，发明适用于实验室和现场的的残留检测，可提高食品安全检验的效率和准确性，但无法精准测定样品中黄曲霉素的含量。专利黄曲霉毒素B1的检测方法（公开号106290889A）公开了一种黄曲霉毒素B1的检测方法，属于酶联免疫吸附测定技术领域，该方法的标准曲线线性相关系数达到0.998，IC50值为0.184ug/kg。与上述发明相比，本文研发制备的纳米复合物试纸条在室温条件保存30天仍表现出良好的工作性能，稳定性能；在对微量目标物的检测中表现良好，线性范围为0.001～5ng/mL，理论检测限为0. 81 pg/mL（0.04 μg/kg），视觉检测限为0.5ng/mL。
此纳米复合物试纸条，以黄曲霉毒素B1为目标分析物，采用抗体竞争法实现对黄曲霉毒素B1的检测。当滴加含有一定含量黄曲霉毒素B1的缓冲溶液在样品垫时，溶液在毛细作用下流动到结合垫上，由于免疫标记物已经与样品缓冲液中的黄曲霉毒素B1分子先行结合，故不会与测试线上的AFB1-BSA结合，则免疫标记物不会被测试线截留下来，测试线不显色。同时，游离的免疫标记物继续向前流动到控制线，被控制线上的羊抗鼠IgG所截获，在控制线上形成第二条肉眼可见的紫红色。当空白组即不含黄曲霉毒素B1样品溶液滴加到样品垫时，测试线与控制线都显紫红色。如果控制线不显色时，则该试纸条失效。最后通过金标试纸阅读分析仪进行信号转化获取响应值，制作标准曲线后，能够对黄曲霉毒素B1进行定量检测。相比于肉眼观察，该实验数据更具有准确性和客观性。目前，检测黄曲霉毒素B1的纳米金-纳米二氧化硅颗粒复合物试纸条尚无报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测黄曲霉毒素B1的纳米复合物试纸条及制备方法，具有灵敏度高，特异性强，检测时间短，操作方便快捷，无需专业人员操作等特点，可用于黄曲霉毒素B1含量的快速检测。
本发明的技术方案是一种检测黄曲霉毒素B1的纳米复合物试纸条，由样品垫、结合垫、NC膜、吸收垫四部分组成，并按一定组装顺序依次粘贴在PVP底板上，其中，结合垫上包被有纳米复合物标记的黄曲霉毒素B1抗体，NC膜上的检测线和控制线分别包被有黄曲霉毒素B1抗体偶联牛血清白蛋白和羊抗鼠IgG溶液。
所述黄曲霉毒素B1抗体为单克隆抗体。
所述黄曲霉毒素B1抗体免疫标记物为纳米金-纳米二氧化硅标记黄曲霉毒素B1单克隆抗体（鼠单抗IgG）的复合物(Au@SiO2-Mab1)。
所述黄曲霉毒素B1试纸条的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备纳米金-纳米二氧化硅复合物（Au@SiO2）：采用硅醇盐水解法制备分散均一的纳米二氧化硅，采用硼氢化钠还原法制备纳米金颗粒，通过纳米金颗粒的吸附及金种子的生长制备分散状态良好的复合材料；
（2）制备纳米金-纳米二氧化硅复合物标记黄曲霉毒素B1抗体(Au@SiO2-Mab1)：通过静电力作用，将黄曲霉毒素B1抗体（Mab1）与纳米金-纳米二氧化硅复合物（Au@SiO2）进行偶联，制得纳米金-纳米二氧化硅复合物标记黄曲霉毒素B1抗体；
（3）制备NC膜：使用喷金仪将黄曲霉毒素B1抗体偶联牛血清白蛋白（BSA-AFB1）喷在NC膜上，形成检测线，距离检测线上方2-3mm处喷上羊抗鼠IgG溶液（1 mg/mL）形成控制线，然后放在室温自然晾干，4 ℃冰箱保存备用；
（4）组装试纸条：将样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫依次粘贴在PVP底板上并轻轻按压，每个组成部位应有2 mm的重叠部分，然后用裁条机将粘贴好的部分裁成3 mm的试纸条，保存在4 ℃冰箱中；
（5）样品检测方法：以空白样品做对照，将50 μL待测样品缓冲溶液滴在样品垫上，反应10 min后，再次滴入50 μL的缓冲溶液进行冲洗，5min后，将试纸条放入金标试纸阅读分析仪，通过相应软件对其产生的信号进行分析，绘制标准曲线，根据标准曲线求得待测样品的含量。
所述的步骤（2）纳米金-纳米二氧化硅复合物标记黄曲霉毒素B1抗体(Au@SiO2-Mab1)的制备方法为：取1 mL Au@SiO2溶液（pH=6），加入1 μg黄曲霉毒素B1抗体，室温下震荡60 min，接着加入终浓度为1%的BSA溶液继续反应30min，然后溶液以6000 r/min离心5min，所得沉淀用Eluent Buffer溶液清洗，最后将沉淀溶解于含有0.02 M Na3PO4·12H2O，10%蔗糖和0.22% Tween-20的缓冲溶液中。
本发明的优点在于：
本发明构建基于纳米金-纳米二氧化硅复合物试纸条，并用于黄曲霉毒素B1的快速检测，具有灵敏度高，特异性强，检测时间短，操作方便快捷，无需专业人员操作等特点，可用于黄曲霉毒素B1含量的快速检测。
附图说明
图1为纳米复合物试纸条传感器灵敏度分析图。
图2为纳米复合物试纸条传感器标准曲线图。
图3为纳米复合物试纸条传感器特异性分析图（a：空白样；b：大田软海绵酸；c：河豚毒素；d：玉米赤霉烯酮，e：赭曲霉毒素；f：黄曲霉毒素G1；g：黄曲霉毒素B2；h：b、c、d、e、f、g混合物；i：0.5 ng/mL AFB1；j：b、c、d、e、f、g、i混合物）。
图4为纳米复合物试纸条传感器检测下限分析图。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明做详细的说明。
实施例1：纳米金-纳米二氧化硅复合物(Au@SiO2)的制备
(1)在平底烧瓶中加入3.54 mL Triton X-100、15 mL环己烷、3.6 mL正己醇和960 μL去离子水，在磁力搅拌器上搅拌30 min，然后加入200 μL正硅酸四乙酯继续搅拌30 min后，再加入120 μL氨水在磁力搅拌器上搅拌反应15 h，反应结束后，加入等体积的丙酮终止反应，溶液离心，弃去上清液得到纳米二氧化硅颗粒沉淀，最后清洗离心烘干后得到得到的二氧化硅颗粒；
(2)在平底烧瓶中加入80 mL去离子水，置于冰浴环境的磁力搅拌器上搅拌5 min，缓慢滴加质量分数为50% HAuCl4，当溶液变为黄色时加入0.50 mL的0.2 mol/L K2CO3，随后缓慢加入1 mL的0.1mol/L NaBH4溶液，当溶液颜色由紫色变为橙色最后变为亮红色说明纳米金制备完毕；
(3)在平底烧瓶中加入20 mL纳米金溶液与1 mL纳米二氧化硅颗粒溶液，在磁力搅拌器上快速搅拌60 min，静置后离心弃去上清液，取沉淀加入适量去离子水超声至分散均匀备用。
(4)平底烧瓶内加入90 mL去离子水、80 μL的50% HAuCl4和0.025 g K2CO3溶液，置于磁力搅拌器上搅拌，加入（3）中制得的10 mL纳米金吸附的纳米二氧化硅颗粒溶液和1 mL的0.5 mol/L盐酸羟胺，再分多次加入1 g PVP均匀分散，搅拌反应过夜，溶液离心沉淀加入去离子水经超声均匀分散后去离子水均匀分散，即制备获得Au@SiO2复合材料，在4℃条件下保存。
实施例2：纳米金-纳米二氧化硅复合物标记黄曲霉毒素B1抗体(Au@SiO2-Mab1)的制备
取1 μg的黄曲霉毒素B1抗体加入到0.5 mL纳米金-纳米二氧化硅复合物中，室温下振荡反应60 min，加入50 μL牛血清白蛋白溶液后继续振荡反应30 min；反应结束后，溶液以6000 r/min 离心5 min，除去上清液，用Eluent Buffer清洗沉淀一次，得到的沉淀用500 μL Eluent Buffer定容，在4℃条件下保存备用。
实施例3：NC膜的制备
使用喷金仪将黄曲霉毒素偶联牛血清白蛋白（AFB1-BSA）喷在NC膜上，形成检测线，距离检测线上方2-3 mm处喷上羊抗鼠IgG（1 mg/mL）形成控制线，然后放在室温自然晾干，4℃冰箱保存备用。
实施例4：试纸条的组装
将样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫依次粘贴在PVP底板上并轻轻按压，每个组成部位应有2 mm的重叠部分，然后用裁条机将粘贴好的部分裁成3 mm的试纸条，保存在4 ℃冰箱中。
实施例5：样品检测方法
以空白样品做对照，将50 μL待测样品缓冲溶液滴在样品垫上，10 min后，再次滴入50μL的缓冲溶液进行冲洗，5min后，将试纸条放入金标试纸阅读分析仪，通过相应软件对其产生的信号进行分析，绘制标准曲线，根据标准曲线求得待测样品的含量。
实施例6：纳米复合材料试纸条传感器的灵敏度及检测限
用PBST缓冲溶液将黄曲霉毒素B1标准溶液分别稀释至0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、200 ng/mL，然后将这些不同浓度的样品溶液分别取100 μL滴加在试纸条样品垫上，每组样品测三个平行，记录读条机上检测线与控制线的响应值，结果如图1所示，在黄曲霉毒素B1浓度逐渐增高的情况下，通过肉眼观察试纸条检测线上的颜色由紫红色逐渐变淡最终消失；如图2所示，当黄曲霉毒素B1的浓度范围在0.001～5 ng/mL时，试纸条响应信号与样品浓度呈现良好的线性关系，因此在0.001～5 ng/mL的浓度范围内可以利用该试纸条对黄曲霉毒素B1实行定量检测；经计算，该试纸条的检测限为0.81 pg/mL（0.04 μg/kg）。
实施例7：纳米复合材料试纸条传感器的特异性
取黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、大田软海绵酸、河豚毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素等6种非目标物进行试纸条特异性的检测；首先，以空白溶液为对照，将这六种非目标物分别溶于PBST缓冲溶液中，终浓度均为0.5 ng/mL；另外以0.5 ng/mL的黄曲霉毒素B1标准溶液为对照，同时将这六种非目标物与黄曲霉毒素B1样品进行混合，确保溶液中每种样品的种浓度均为0.5 ng/mL，然后分别取100 μL滴加在试纸条上进行检测，每组样品测六个平行，结果如图3所示（a：空白样；b：大田软海绵酸；c：河豚毒素；d：玉米赤霉烯酮，e：赭曲霉毒素；f：黄曲霉毒素G1；g：黄曲霉毒素B2；h：b、c、d、e、f、g混合物； i：0.5 ng/mL AFB1； j： b、c、d、e、f、g、i混合物）。以空白样（图3a）与0.5 ng/mL AFB1（图3i）为对照，b、c、d、e的信号值与空白组信号值相比无明显差异，b、c、d、e的信号值与0.5ng/mL的黄曲霉毒素B1标准溶液信号值相比有明显差异，这说明所选择的大田软海绵酸、河豚毒素、玉米赤霉烯酮与赭曲霉毒素对黄曲霉毒素B1的检测未产生明显的交叉反应；图中f、g信号值与空白组信号值和0.5ng/mL的黄曲霉毒素B1标准溶液信号值相比均有明显差异，这说明黄曲霉毒素B2和黄曲霉毒素G1与AFB1抗体发生了交叉反应，所用抗体的特异性对于目标物同族分子的特异性检测仍有待提高。
实施例8：纳米复合材料试纸条传感器对实际样品的检测
选取不同品牌不同产地的的10份山茶籽油样品，样品编号为1～10，使用本研究制备的检测黄曲霉毒素B1的纳米复合物试纸条检测上述山茶籽油样品，平行检测3组，实验结果如表1所示，10份山茶籽油样本中所检测出来的黄曲霉毒素B1含量均低于国标限定的含量（GB2761—2017中规定植物油脂中黄曲霉毒素B1限量标准为10 μg/kg）。
表 1
实施例9：纳米复合材料试纸条检测下限
本试验通过控制纳米金-纳米二氧化硅复合物标记黄曲霉毒素B1抗体的用量，在保证控制线清晰可见的情况下，对一系列黄曲霉毒素B1的毒素浓度（0、0.1、0.5、1、2、5ng/mL）进行检测，如图4所示检测黄曲霉毒素B1的纳米复合物试纸条在毒素浓度为0.5 ng/mL测试线就已经消失，即检测黄曲霉毒素B1的纳米复合物试纸条的检测下限为0.5 ng/mL，说明检测黄曲霉毒素B1的纳米复合物试纸条在对实际样品的检测中可以表现出很高的灵敏度以及可以在大量稀释样品之后仍然能够对样品中的毒素表现出良好的响应能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (4)

1.一种检测黄曲霉毒素B1的纳米复合物试纸条，其特征在于：由样品垫、结合垫、NC膜、吸收垫四部分组成，并按一定组装顺序依次粘贴在PVP底板上，其中，结合垫上包被有纳米复合物标记黄曲霉毒素B1抗体，NC膜上的检测线和控制线分别包被有黄曲霉毒素B1抗体偶联牛血清白蛋白和羊抗鼠IgG溶液。
2.根据权利要求1所述的一种检测黄曲霉毒素B1的纳米复合物试纸条，其特征在于：所述纳米复合物标记黄曲霉毒素B1抗体为纳米金-纳米二氧化硅复合物标记黄曲霉毒素B1抗体的复合物。
3.如权利要求1所述的一种检测黄曲霉毒素B1的纳米复合物试纸条的制备方法，其特征包括以下步骤：
（1）制备纳米金-纳米二氧化硅复合物：采用硅醇盐水解法制备分散均一的纳米二氧化硅，采用硼氢化钠还原法制备纳米金颗粒，通过纳米金颗粒的吸附及金种子的生长制备分散状态良好的纳米复合物；
（2）制备纳米金-纳米二氧化硅复合物标记黄曲霉毒素B1抗体：通过静电吸附作用和疏水作用，将黄曲霉毒素B1固定在纳米金-纳米二氧化硅复合物表面，制得纳米金-纳米二氧化硅复合物标记黄曲霉毒素B1抗体；
（3）制备NC膜：使用喷金仪将黄曲霉毒素B1抗体偶联牛血清白蛋白喷在NC膜上，形成检测线，距离检测线上方2-3mm处喷上羊抗鼠IgG形成控制线，然后放在室温自然晾干，4 ℃冰箱保存备用；
（4）组装试纸条：将样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫依次粘贴在PVP底板上并轻轻按压，每个组成部位应有2 mm的重叠部分，然后用裁条机将粘贴好的部分裁成3 mm的试纸条，保存在4 ℃冰箱中；
（5）样品检测方法：将50 μL待测样品缓冲溶液滴在样品垫上，反应10 min后，再次滴入50 μL的缓冲溶液进行冲洗，5min后，将试纸条放入金标试纸阅读分析仪，通过相应软件对其产生的信号进行分析，绘制标准曲线，根据标准曲线求得待测样品的含量。
4.根据权利要求3所述的一种检测黄曲霉毒素B1的纳米复合物试纸条的制备方法，其特征在于：步骤（2）纳米金-纳米二氧化硅复合物标记黄曲霉毒素B1抗体的制备：取1 mL 纳米金-纳米二氧化硅复合物溶液，pH=6，加入1 μg黄曲霉毒素B1抗体，室温下震荡60 min，接着加入终浓度为1%的BSA溶液继续反应30min，然后溶液以6000 r/min离心5 min，所得沉淀用Eluent Buffer溶液清洗，最后将沉淀溶解于含有0.02 M Na3PO4·12H2O，10%蔗糖和0.22%Tween-20的缓冲溶液中。
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CN109738635A (zh) * 2019-01-15 2019-05-10 湖北工业大学 一种检测黄曲霉毒素b1的试剂盒及其制备方法
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