CN111257564A - 一种采用上转换发光免疫层析法测定己烯雌酚的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种采用上转换发光免疫层析法测定己烯雌酚的方法，本研究采用溶剂热法合成上转换纳米颗粒(UCNPs)‑NaYF4：Yb，Er，进行表面功能化修饰，将其与己烯雌酚(DES)单克隆抗体偶联，制备荧光探针，以牛血清白蛋白一己烯雌酚(BSA—DES)偶联物和羊抗鼠二抗分别喷涂硝酸纤维膜，形成试纸条检测线(T线)和质控线(C线)，建立了上转换发光免疫层析试纸条快速定量检测。DES的方法。实验结果表明：此试纸条定量检测DES线性范围为25～10000 ng/mL(Y=0.43927x‑0.57647，R2=0.996)，检出限为20.84 ng/mL，单个样品检测时间为15 min，批内和批间变异系数均小于10％，特异性识别能力强，在37℃存放下7天检测值RSD的平均值约为15％。加标回收实验显示平均回收率为90.1％‑115.2％，相对标准偏差小于5％，与高效液相色谱法有较好的一致性。

Description

一种采用上转换发光免疫层析法测定己烯雌酚的方法
技术领域
本发明属于生物检验领域。具体涉及己烯雌酚的测定方法。
背景技术
己烯雌酚(Dethylstilbestrol，DES)作为一种人工合成的雌激素药物，广泛应用于妇科病的预防和治疗，同时它还具有促进动物生长和提高饲料转化率等作用。DES可通过食物链进人人体，导致激素分泌异常、甚至乳腺癌和胚胎畸形等严重后果，因此许多国家已明令禁止将DES用于动物养殖。我国国家标准规定的DES检测方法为液相色谱-串联质谱法，目前用于DES检测的方法主要有酶联免疫分析法、高效液相色谱法、液相色谱一质谱联用法、电化学法、放射免疫法等。以上方法准确灵敏，但存在过程复杂、操作繁琐以及携带不便等缺点。因此，建立简单、灵敏、快速的检测方法十分必要。
近年来，基于荧光标记的免疫层析技术得到广泛关注，量子点(Quantum dots，QDs)为免疫层析技术的常用的荧光标记物。QDs作为免疫探针，建立了检测玉米赤霉烯酮的免疫层析方法，且灵敏度良好。段宏等利用量子点荧光微球为探针，制备免疫层析试纸条定量检测恶性疟原虫。稀土掺杂上转换纳米颗粒(UCNPs)是一种新型材料，其上转换发光机制源于稀土离子在红外光激发下，可以转化为高能量可见光。NaYF4：Yb，Er为双掺的上转换稀土化合物，量子产率高，荧光稳定性好。与QDs相比，UCNPs具有稳定性好、亮度高、干扰背景几乎为零、不易光解和光漂白等优点。目前，上转换发光免疫层析技术的研究逐渐受到关注，於然等将修饰羧基的上转换颗粒用于免疫层析试纸，检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇，但抗体标记较复杂，检测范围窄。本研究以修饰醛基的UCNPs为载体，将DES单抗直接标记在颗粒表面，制备出新型的荧光探针，建立了上转换免疫层析试纸条快速定量检测DES的新方法。方法检测范围宽，操作简单，适用于大量样品现场检测。
发明内容
本文采用己烯雌酚上转换发光免疫层析方法，并基于上转换发光免疫分析仪，用于己烯雌酚的快速检测。
本发明包括以下步骤：
（1）上转换纳米材料NaYF4：Yb，Er的合成与表面修饰：称取0.18 mmol YbCl3·6H2O，0.80 mmol YCl3·7H20和0.02 mmol ErCl3·6H2O，加人10 mL C18H3402和30 mL C18H36。将溶液加热至160℃并维持30 min，形成均匀溶液，同时除去O2和水，然后冷却至50℃。逐滴加入20 mL溶有5 mmol NaOH和8 mmol NH4F的甲醇溶液并搅拌30 min，尽快升温至100℃除去水和甲醇。在氮气保护下迅速加热至320℃并维持1 h。反应完成后，溶液自然冷却至室温，所得产物用环己烷和乙醇洗3次，烘干备用。
称取上述UCNPs 100 mg于60 mL乙醇中，超声分散。加入2．5 mL氨水，20 mL超纯水和25µL TEOS，40℃下搅拌反应6 h。随后，加人50 µL APTES，40℃继续搅拌反应6 h。所得产物用乙醇洗涤3次，干燥备用。称取10 mg修饰氨基的UCNPs，分散于10 mL PBS缓冲液(0．01mol/L，pH 7．4)，然后加人20 mL 2．5％的戊二醛溶液，振荡反应30 min，所得产物用PBS缓冲液洗涤两次。
（2）DES单抗标记的UCNPs探针和UCNPs试纸条的制备：称取10 mg修饰后的UCNPs，加人2 mL超纯水超声分散。随后，加入4.8µL (10.5 mg/mL)的DES单克隆抗体，室温振荡1h，再加入50 µL 20％牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭1 h。用PBS洗涤两次后，将偶联上抗体的UCNPs用PBS重悬，于4℃下保存待用。
上转换发光试纸条包括加样垫、结合垫、层析膜、吸水垫和PVC板。将标记好抗体的UCNPs均匀滴涂在结合垫上，真空冷冻干燥。用划膜仪将0.8 mg/mL DES-BBSA和1 mg/mL羊抗鼠IgG喷涂在NC膜上，分别作为检测线(T线)和质控线(C线)，37℃干燥1 h。将将加样垫、结合垫、NC膜、吸水垫裁剪成
合适大小，依次粘贴在PVC板上，用自动切条机切成4 mm宽的试纸条，干燥备用。
（3）UCNPs试纸条的检测流程及条件优化：将不同浓度的样品取100µL滴加到检测卡加样垫上，室温反应15 min后，UPT-3A免疫分析仪读取试纸条T和C线荧光强度。当样品中没有DES时，UCNPs探针经NC膜迁移至试纸条T线区域，未结合的UCNPs探针与DES-BSA结合，T线出现荧光条带；反之，UCNPs探针上的DES单克隆抗体与DES结合，免疫复合物经NC膜进一步迁移至试纸条c线区域与羊抗鼠二抗结合，C线出现荧光条带，T/C的值与DES浓度呈负相关。如果C线没有产生荧光条带，说明试纸条无效。以结合垫宽度、加样垫宽度、DES-BSA浓度、羊抗鼠二抗浓度为因素，设计四因素三水平正交试验，优化试纸条性能，具体见表l。通过正交试验选取阴性样本T0/C0。与阳性样本T/C的差值最大时的条件为试纸条最佳工艺条件。采用免疫动力学分析方法确定试纸条最佳检测时间。最优条件下，将浓度为500 ng/mL的DES溶液加入加样孔，每隔30 s，UPT-3A免疫分析仪读取试纸条T/C的值，以T/C的值达到稳定的时间为最佳检测时间。
具体实施方式
下面将详细说明本发明的具体实施方式：
1.仪器、试剂及材料：
仪器：
JJEM—IOOCXII透射电子显微镜(日本电子株式会社)；FTS6000傅里叶红外光谱仪(美国Bio-Rad公司)；LGJ-10D型冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂)；HM3010单维往复划膜仪(上海金标公司)；ZQ2000微电脑自动斩切机(上海金标公司)；硝酸纤维素膜(NC膜)、加样垫、结合垫、吸水垫、PVC底板及UPT-3A便携式上转换发光免疫分析仪，均由北京热景生物技术有限公司提供。
试剂及材料：
氯化钇(YCl3·6H20)、氯化镱(YbCl3·6H20)、氯化铒(ErCl3·6H2O)、十八烯(C18H36。)购于山东西亚化学工业有限公司；四乙氧基硅硅烷(TEOS)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，牛血清白蛋白(BSA)购于上海Sigma公司；己烯雌酚(DES)、雌二醇(E2、己烷雌酚(HEX)、双烯雌酚(DIEN)、双酚A(BPA)购于北京百灵威公司；己烯雌酚单克隆抗体(DES-ab))、己烯雌酚抗原(DES-BSA)本实验室制备；羊抗鼠抗体(北京索莱宝公司)；实验用水为超纯水；其它试剂均为分析纯。牛奶样品购于当地超市。
2.方法与结果
UCNPs试纸条的优化:结合垫宽度、加样垫宽度、DES—BSA浓度、羊抗鼠二抗浓度是影响试纸条检测灵敏度的关键参数。本研究通过正交试验优化，当结合垫宽度为0.7 cm，加样垫宽度为1.8 cm，DES-BSA浓度为0.8 mg/mL，羊抗鼠二抗浓度为1 mg/mL时阴性样本T0/C0。与阳性样本T/C的差值最大。因此，本实验选择该条件为试纸条的最优条件，T线和c线荧光强度比值随着反应时间的延长呈现下降趋势，在15 min后即趋于稳定。此结果表明，试纸条最佳的检测时间为加样后15 min。
UCNPs试纸条定量检测DES的标准曲线及检出限：用10％甲醇溶液配制DES系列标准溶液(0，25，50，100，200，500，800，1000，4000，8000和10000 ng/mL)。UCNPs试纸条检测，15 min后UPT-3A免疫分析仪读取试纸条T和C线荧光强度以及T和C线荧光强度比值，每个浓度重复检测3次以DES浓度对数为横坐标，阴性样本T0/C0。对数与阳性样本T/C对数的差值为纵坐标，绘制DES检测的标准曲线。UCNPs免疫层析试纸条检测DES的标准曲线。结果表明，DES浓度在25～10000 ng/mL时，其对数值和阴性样本T0/C0。对数与阳性样本T/C对数的差值呈线性关系，线性回归方程为y=0.43927x一0.57647(R2=0.996)。检出限按m0-3SD(m0为20次空白测试T/C的平均值，SD为20次空白测试的标准差)计算为20.84 ng/mL。
UCNPs试纸条重复性和热稳定性：表2可知，UCNPs试纸条批内和批间重复性相对较好。通过计算得出批内RSD小于6％，批间RSD变异系数(CV)小于10％。结果表明，UCNPs试纸条重复性好。实际应用中，UCNPs试纸条应存放在室温或4℃以保持生物分子活性。一般认为，如果试纸条存放在37℃，它的检测能力将更快受到损害因此，将试纸条密封存放于37℃恒温恒湿箱，分别在第0，3，7天取出检测，以第0天的检测值作为对照组组。如表3所示，第3天的检测值的RSD小于10％，而第7天的检测值的RSD平均值约为15％，说明UCNPs试纸条热稳定性良好。
UCNPs试纸条的特异性：分别配制浓度为270 ng/mL的DES，HEX，DIEN，BPA，E2标准溶液。用UCNPs试纸条检测，重复3次通过计算其竞争抑制率(1-B/B0)判断试纸条的特异性，其中B为阳性时试纸条的T/C值，B0为阴性时试纸条的T0/C0值。取DES的结构类似物DINE，HEX，BPA和功能类似物E2评价试纸条的特异性。在浓度为270 ng/mL时，只有DES的竞争抑制率为67.7％，其结构类似物和功能类似物的竞争抑制率均小于20％，表明UCNPs试纸条具有良好的特异性识别能力。
实际样品检测:牛奶样品购买于当地超市。分别取1 mL牛奶置于离心管中，按50，200，800，4000和8000 ng/mL水平添加DES标准品。每个样品中加入等体积的乙酸乙酯萃取，小心振荡，静置，待样品分层后，收集上清液，用氮气吹干。最后，将残留物溶解在10％甲醇溶液中进行分析。同时用高效液相色谱法进行对比。
加标样品的检测：UCNPs试纸条的准确性以及精密度通过加标回收实验进行评价。从表4可知，5个加标水平的平均回收率为90.1％～115.2％，相对标准偏差(RSD)均小于5％，表明UCNPs试纸条的精密度及准确性满足快速定量检测DES的需求。为了进一步验证UCNPs试纸条的可靠性，同时用高效液相色谱法测定加标样品中的DES，回收率为96.3％～113.5％，相对标准偏差(RSD)均小于4％。同时，两种方法的测定结果有较好的一致性。
表1 四因素三水平正交试验表
Figure DEST_PATH_DEST_PATH_IMAGE002A
表2 UCNPs免疫层析试纸条的重复性
Figure DEST_PATH_DEST_PATH_IMAGE004A
表3 UCNPs试纸条的热稳定性实验
Figure DEST_PATH_DEST_PATH_IMAGE006A
表4 牛奶中己烯雌酚的加标回收实验
Figure DEST_PATH_DEST_PATH_IMAGE008

Claims (3)

1.一种测定己烯雌酚的方法，其特征在于：
DES的检测流程是将不同浓度的样品取100µL滴加到检测卡加样垫上，室温反应15 min后，UPT-3A免疫分析仪读取试纸条T和C线荧光强度。
2.当样品中没有DES时，UCNPs探针经NC膜迁移至试纸条T线区域，未结合的UCNPs探针与DES-BSA结合，T线出现荧光条带；反之，UCNPs探针上的DES单克隆抗体与DES结合，免疫复合物经NC膜进一步迁移至试纸条c线区域与羊抗鼠二抗结合，C线出现荧光条带，T／C的值与DES浓度呈负相关；如果C线没有产生荧光条带，说明试纸条无效。
3.根据权利要求1所述的测定己烯雌酚的方法，其特征在于：本试验采用溶剂热法合成上转换纳米颗粒(UCNPs)-NaYF4：Yb，Er，进行表面功能化修饰，将其与己烯雌酚(DES)单克隆抗体偶联，制备荧光探针，以牛血清白蛋白一己烯雌酚(BSA—DES)偶联物和羊抗鼠二抗分别喷涂硝酸纤维膜，形成试纸条检测线(T线)和质控线(C线)，建立了上转换发光免疫层析试纸条快速定量检测。
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