CN111766388A - 一种检测吡虫啉的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

一种检测吡虫啉的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测吡虫啉的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用，属于荧光免疫层析检测技术领域，所述荧光免疫层析试纸条，包括底板和依次搭接在底板上的样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫；所述结合垫上包被有量子点微球标记探针，所述量子点微球标记探针是量子点微球与吡虫啉单克隆抗体的偶联物；所述NC膜由样品垫方向向吸水垫方向依次设有检测线和质控线，所述检测线包被有吡虫啉半抗原‑鸡卵清蛋白偶联物，所述质控线包被有兔抗小鼠IgG抗体。利用本发明所述荧光免疫层析试纸条检测吡虫啉，具有操作简单、灵敏度高，稳定性好，所述荧光免疫层析试纸条适用于农药残留的现场快速检测与大批量样品的筛查。

Description

一种检测吡虫啉的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于荧光免疫层析检测技术领域，尤其涉及一种检测吡虫啉的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
吡虫啉(Imidacloprid)是一种新型高效氯代烟碱类内吸性广谱杀虫剂，其胃毒与触杀作用比较突出，其作用机制是作为竞争性抑制剂选择性地抑制昆虫神经系统烟碱型乙酰胆碱受体，其能够模拟乙酰胆碱(Acetylcholine,Ach)的作用方式，竞争结合Ach的结合位点，导致Ach结合能力下降，从而抑制Ach与乙酰胆碱受体的结合，并且吡虫啉能模拟乙酰胆碱不停地刺激乙酰胆碱受体，使神经冲动持续性传导，从而破坏神经系统信号的正常传导，起到杀虫作用。
目前，检测吡虫啉残留的方法主要有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱质谱联用法(GC/MS)、液相色谱质谱联用技术(LC/MS)和酶联免疫吸附法(ELISA)等。虽然这些方法具有准确性好、灵敏度和重现性好的优点，但需要复杂的操作过程与技术培训，只有在专业实验室，专门从事仪器分析的人员才能进行检测，不能满足现场快速、高通量检测的需求。
免疫层析技术是20世纪80～90年代发展起来的一种将免疫技术和色谱层析技术相结合的快速免疫分析方法，是最常用的即时检测技术(Point of care test,POCT)，该方法因具有通量高、检测快速、成本低且不需要复杂的仪器设备等优势，近年来已被广泛应用到生物医药、农药残留、食品安全检测等领域。胶体金是免疫层析技术最常用的标记物，胶体金免疫层析试纸条是现场快速筛查的首选方法，但该方法存在以下缺陷：
1、检测灵敏度低、人为因素干扰大；
2、只能进行定性或半定量结果分析，无法实现精准定量检测；
3、样品基质干扰较大，容易产生假阳性。
因此开发高灵敏度，能够实现定量检测的免疫层析方法是十分有必要的。
近年来，基于荧光标记物的免疫层析技术得到了广泛应用，其中量子点(Quantumdot，QDs)具有激发光谱宽、发射光谱窄且对称、荧光强度高、光化学稳定性好、生物相容性好等优点。量子点微球(Quantum dot submicrobeads，QBs)是一种将量子点荧光染料进行包埋或在高聚物载体上通过吸附作用而形成的一种荧光标记物，具有更高的信号强度，可有效提高检测方法的灵敏度，在免疫层析检测领域具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种基于量子点微球的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。利用所述荧光免疫层析试纸条检测吡虫啉，具有操作简单、灵敏度高，稳定性好，能够实现定量检测，所述荧光免疫层析试纸条适用于农药残留的现场快速检测与大批量样品的筛查。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种检测吡虫啉的荧光免疫层析试纸条，包括底板和依次搭接在底板上的样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫；
所述结合垫上包被有量子点微球标记探针，所述量子点微球标记探针是量子点微球与吡虫啉单克隆抗体的偶联物，包被浓度为40～60μg/mL；
所述NC膜由样品垫方向向吸水垫方向依次设有检测线和质控线，所述检测线包被有吡虫啉半抗原-鸡卵清蛋白偶联物，所述质控线包被有兔抗鼠IgG抗体。
优选的，所述检测线上吡虫啉半抗原-鸡卵清蛋白偶联物的浓度为1.4～1.6mg/mL。
优选的，所述质控线上兔抗鼠IgG抗体浓度为0.4～0.6mg/mL。
优选的，所述检测线与质控线之间的距离为6～8mm。
优选的，所述搭接的长度为2～3mm。
本发明还提供了所述的检测吡虫啉的荧光免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
将样品垫浸入样品垫处理液中浸湿后干燥获得处理后的样品垫；
将结合垫置于结合垫处理液中浸湿后干燥、喷涂量子点微球标记的吡虫啉单克隆抗体获得处理后的结合垫；
将NC膜固定于底板中心，然后在所述NC膜上喷涂检测线和质控线；
将处理后的样品垫、处理后的结合垫和吸水垫依次组装于固定有NC膜的底板上。
优选的，所述样品垫处理液以水为溶剂，包括以下组分：0.008～0.012mol/L PBS、质量分数1.5％～2.5％的BSA、质量分数2％～3％的蔗糖和质量分数0.01％～0.03％的NaN3。
优选的，所述结合垫处理液以水为溶剂，包括以下组分：15～25mmol/L Na3PO4·12H2O，质量分数4～6％的BSA，体积分数0.2％～0.3％的Tween-20和质量分数8％～12％的蔗糖。
本发明还提供了所述的试纸条在检测吡虫啉中的应用。
优选的，所述试纸条的检测限为0.012ng/mL，所述试纸条的检测线性范围为0.023～0.546ng/mL。
本发明的有益效果：本发明提供的检测吡虫啉的荧光免疫层析试纸条，结合垫上包被有量子点微球标记的吡虫啉单克隆抗体，采用量子点微球为信号标签，具有独特的光学性质，良好的生物兼容性，所述量子点微球粒径较大，表面能够提供很多的羧基化位点，使更多的吡虫啉单克隆抗体连接在微球表面上，可以起到信号放大作用，大大提高了检测灵敏度，可实现对低浓度目标物的定量检测，与传统胶体金试纸条相比，检测灵敏度提高了10～20倍；同时降低了其它物质的非特异性干扰。
本发明所述的试纸条检测操作简单，无需专业人员和大型仪器，检测速度快，满足POCT检测需求。
本发明所述的试纸条，只需一个紫外发光设备，无需其他任何试剂和仪器，可现场操作；5～10min即可判定检测结果。
附图说明
图1为本发明提供的检测吡虫啉荧光免疫层析试纸条的结构示意图；
图2为本发明提供的检测吡虫啉荧光免疫层析试纸条的结构示意图；
图3为本发明提供的检测吡虫啉荧光免疫层析试纸条的结果判定示意图；
图4为本发明提供的检测吡虫啉荧光免疫层析试纸条进行定量检测样本中吡虫啉的线性关系线和照片图；
图5为吡虫啉胶体金免疫层析试纸条检测样本中吡虫啉的照片图；
图1和图2中：1-样品垫；2-结合垫；3-检测线(T线)；4-质控线(C线)；5-吸水垫；6-NC膜；7-PVC底板；8-加样孔；9-卡壳。
具体实施方式
本发明提供了一种检测吡虫啉的荧光免疫层析试纸条，包括底板和依次搭接在底板上的样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫；所述结合垫上包被有量子点微球标记探针，所述量子点微球标记探针是量子点微球与吡虫啉单克隆抗体的偶联物；所述NC膜由样品垫方向向吸水垫方向依次设有检测线和质控线，所述检测线包被有吡虫啉半抗原-鸡卵清蛋白偶联物，所述质控线包被有兔抗鼠IgG抗体。
在本发明中，所述检测线上吡虫啉半抗原-鸡卵清蛋白偶联物的浓度优选为1.4～1.6mg/mL，更优选为1.5mg/mL；所述吡虫啉半抗原-鸡卵清蛋白偶联物的喷涂量优选为0.6～1.0μL/cm，更优选为0.8μL/cm，在本发明中，所述质控线上兔抗鼠IgG抗体浓度优选为0.4～0.6mg/mL，更优选为0.5mg/mL；在本发明中，所述兔抗鼠IgG抗体的喷涂量优选为0.6～1.0μL/cm，更优选为0.8μL/cm。在本发明中，所述检测线与质控线之间的距离优选为6～8mm，更优选为7mm。
在本发明中，所述结合垫优选为玻璃纤维膜，所述结合垫上包被有量子点微球标记探针，所述量子点微球标记探针是量子点微球与吡虫啉单克隆抗体的偶联物，包被浓度优选为40～60μg/mL，更优选为50μg/mL。
在本发明中，所述样品垫优选为玻璃纤维膜，所述吸水垫优选为滤纸，所述底板优选为聚氯乙烯材料。在本发明中，所述试纸条的宽度优选为3～4mm，更优选为3.5mm。在本发明中，所述样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫搭接的长度优选的分别为2～3mm。
在本发明中，所述试纸条还包括检测壳，本发明对所述检测壳没有特殊限定，采用本领域常规的试纸条检测壳即可。
本发明还提供了所述的检测吡虫啉的荧光免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：将样品垫浸入样品垫处理液中浸湿后干燥获得处理后的样品垫；将结合垫置于结合垫处理液中浸湿后干燥、喷涂量子点微球标记的吡虫啉单克隆抗体获得处理后的结合垫；将NC膜固定于底板中心，然后在所述NC膜上喷涂检测线和质控线；将处理后的样品垫、处理后的结合垫和吸水垫依次组装于固定有NC膜的底板上。
在本发明中，将样品垫浸入样品垫处理液中浸湿后干燥获得处理后的样品垫。在本发明中，所述样品垫处理液以水为溶剂，优选的包括以下组分：0.008～0.012mol/L PBS、质量分数1.5％～2.5％的BSA、质量分数2％～3％的蔗糖和质量分数0.01％～0.03％的NaN3，更优选的包括0.01mol/L PBS、质量分数2％的BSA、质量分数2.5％的蔗糖和质量分数0.02％的NaN3。在本发明中，所述干燥的温度优选为36～38℃，更优选为37℃，所述干燥的时间优选为10～14h，更优选为12h。
在本发明中，将结合垫置于结合垫处理液中浸湿后干燥、喷涂量子点微球标记探针获得处理后的结合垫。在本发明中，所述结合垫处理液以水为溶剂，优选的包括以下组分：15～25mmol/L Na3PO4·12H2O，质量分数4～6％的BSA，体积分数0.2％～0.3％的Tween-20和质量分数8％～12％的蔗糖，更优选为包括20mmol/L Na3PO4·12H2O，质量分数5％的BSA，体积分数0.25％的Tween-20和质量分数10％的蔗糖。在本发明中，所述干燥的温度优选为36～38℃，更优选为37℃，所述干燥的时间优选为10～14h，更优选为12h。本发明在所述干燥后，向所述结合垫喷涂量子点微球标记探针；所述喷涂优选的采用喷膜仪进行，所述喷涂后优选的进行干燥，所述干燥的温度优选为20～25℃，所述处理后的结合垫优选的置于4℃保存。
在本发明中，所述量子点微球与吡虫啉单克隆抗体偶联方法参见文献：“Ren M,XuH,Huang X,et al.Immunochromatographic assay for ultrasensitive detection ofaflatoxin B1in maize by highly luminescent quantum dotbeads.[J].AcsAppliedMaterials&Interfaces,2014,6(16):14215-14222.”中的记载。
在本发明中，将NC膜固定于底板中心，然后在所述NC膜上喷涂检测线和质控线。在本发明中，所述喷涂优选的采用Bio-dotXYZ-3050三维喷点仪中的Arijet进行。在本发明中，所述吡虫啉半抗原-鸡卵清蛋白偶联物的制备方法参见文献：“Wang YL,Xu JL,Qiu YLet al.A Highly Specific Monoclonal Antibody and Sensitive Quantum Dot Beads-based Fluorescence Immunochromatographic Test Strip for Tebuconazole Assay inAgricultural Products.[J].JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY,2019,67(32):9096-9103.”中记载；所述兔抗鼠IgG抗体优选的购买于杭州伊佰新生物技术有限公司。
在本发明中，将处理后的样品垫、处理后的结合垫和吸水垫依次组装于固定有NC膜的底板上获得试纸条，本发明对所述组装没有特殊限定，采用本领域常规的试纸条组装方法即可；本发明在所述组装后，优选的进行切割，所述切割优选的采用微电脑自动斩切机进行；切割后的试纸条优选的装于检测壳中。在本发明中，优选的对所述试纸条进行包装，更优选的将所述装有试纸条的检测壳和吸管干燥剂置于铝箔中密封保存。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
吡虫啉单克隆抗体的制备
1、免疫原的制备
采用活性酯法将吡虫啉半抗原与载体蛋白BSA偶联制备免疫抗原，制备方法见参考文献“朱国念,桂文君,郑尊涛,等.吡虫啉人工抗原的合成与鉴定[J].中国农业科学,2005,38(3):511-515.”。
(1)称取60μmol(19.5mg)的吡虫啉半抗原溶解于1mL DMF溶液中，然后再该溶液中加入等当量(60μmol)的二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温下避光搅拌过夜。
(2)次日，将搅拌过夜得到的混合液室温下4000rpm离心30min，手机离心后的上清液备用。
(3)称取90mg牛血清白蛋白，溶解于6mL碳酸盐缓冲液溶液中，再加入(2)中上清液，继续室温搅拌4h，然后装入孔径为14000D(Dalton)的透析袋中，先用蒸馏水透析2～4次(每4h换液一次)，再在0.01mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液中透析三天，离心(10min，5000rpm)后用微量紫外蛋白分析仪测定溶液中蛋白浓度，分装保存于-20℃的冰箱中。
2、免疫原的鉴定
将合成的吡虫啉免疫抗原，半抗原和载体蛋白分别进行紫外200～400nm扫描，并通过比较三者在同一波长下的波长偏移，同时进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪测定其偶联比。
免疫原、半抗原的紫外光谱图与载体蛋白相比最大吸收波长发生位移，则说明半抗原已经与载体蛋白成功偶联制得吡虫啉抗原。经计算，所获人工免疫原吡虫啉半抗原分子与BSA分子的结合比为13:1，证明有较好的偶联效果。
3、吡虫啉单克隆抗体的筛选与制备
用合成的吡虫啉免疫原免疫6-8周龄的BALB/c雌性小鼠，首次免疫与弗氏完全佐剂(FCA)1:1乳化，每只小鼠腹腔注射200μL(100μg免疫原)；首免三周后继续用相同剂量的免疫原与弗氏不完全佐剂(FIA)1:1乳化，每只小鼠腹腔注射200μL(100μg免疫原)加强免疫；之后每隔两周加强免疫一次，总共免疫4～5次。融合实验前3天，选择效价高、竞争好的小鼠，腹腔注射200μL未经乳化的免疫原(共100μg)。取效价最高的免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞混合，以融合剂50％PEG进行细胞融合，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用间接ELISA方法测定细胞上清筛选出阳性杂交瘤细胞。采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，重复2～3次亚克隆，选取效价和竞争较好且稳定的杂交瘤细胞扩大培养；取8～10周龄Balb/c小鼠腹腔注射0.5mL/只液体石蜡致敏，7～10日后腹腔注射杂交瘤细胞1～2×106/只，7～10日后小鼠腹腔有明显膨大，抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价后，于-20℃冻存备用。
4、吡虫啉单克隆抗体的纯化
采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化吡虫啉单克隆抗体腹水，具体操作步骤如下：
(1)用腹水3倍体积的醋酸盐缓冲液(0.06mmol/L，pH 4.0)稀释小鼠腹水，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH到4.5；
(2)在室温条件下搅拌，然后向溶液中缓慢滴加辛酸(33μL/mL腹水稀释液)，继续搅拌30min；
(3)将搅拌后的溶液4℃静置2h，之后4℃10000rpm离心30min，收集上清液；
(4)0.1mol/LPBS缓冲液(pH 7.4)稀释上清液10倍，并用1mol/LNaOH调节溶液pH至7.4，4℃预冷15min；
(5)向溶液中缓慢加入(NH4)2SO4(边加边搅拌)，使溶液中(NH4)2SO4的最终浓度为0.277g/mL，之后继续反应30min；
(6)将溶液于4℃冰箱内静置2h，4℃12000rpm离心30min，弃去上清液；
(7)用少量PBS缓冲液溶解沉淀物，并用提前预冷的PBS缓冲液透析3天，每天换液3～5次，透析好后分装于-20℃冷冻保存。
吡虫啉单克隆抗体的筛选制备和纯化方法参考“闫莉婷.通用有机磷、喜树碱单克隆抗体的制备及免疫检测技术研究[D].兰州大学,2015.”
实施例2
本实例中，基于量子点微球的检测吡虫啉荧光免疫层析试纸条是通过如下方法制备、组装的：
量子点微球标记吡虫啉单克隆抗体的制备
采用EDC活化的方法制备量子点偶联探针，制备方法见参考文献“Ren M,Xu H,Huang X,et al.Immunochromatographic assay for ultrasensitive detection ofaflatoxin B1in maize by highly luminescent quantum dot beads.[J].Acs AppliedMaterials&Interfaces,2014,6(16):14215-14222.”，详细步骤如下：
(1)用超声仪对羧基化量子点荧光微球进行超声波处理3-4次，超声功率70W，每次超声5s，直到量子点荧光微球分布均匀；
(2)取12.5μg的量子点荧光微球加入到500μL的PB缓冲液中，混匀，加入终浓度为5μg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)进行活化，搅拌反应30min；
(3)加入10μL吡虫啉单克隆抗体(1mg/mL)，搅拌反应30min；
(4)加入终浓度为1％的BSA溶液，再加入5μg EDC溶液，搅拌反应30min；
(5)13500rpm，离心15min，弃上清，加入40μL复溶液(含有2％果糖，5％蔗糖，1％BSA，1％PEG 20000和0.4％Tween-20的0.01M,p H 7.4的PBS缓冲液)进行复溶，混匀，得到量子点荧光微球标记的吡虫啉单克隆抗体探针，放入4℃保存待用。该探针及抗体能够与试纸条上包被的抗体结合显荧光，通过测定试纸条的T线和C线的荧光值从而实现定量检测的目的。
样品垫和结合垫的预处理与试纸条检测区的制备
将样品垫1(玻璃纤维膜，型号为Millipore GFCP000800)浸入样品垫处理液(0.01M PBS，2％BSA，2.5％蔗糖，0.02％NaN3)浸湿1h后，37℃烘干12h后，密封保存备用。
将结合垫2(玻璃纤维膜，型号为Millipore GFCP000800)浸入结合垫处理液(20mMNa3PO4·12H2O，5％BSA，0.25％Tween-20，10％蔗糖)浸湿后，37℃烘干待用；
将量子点微球标记探针均匀喷涂于结合垫表面，喷涂量为150ng，室温干燥，4℃保存备用。
在大小为60mm×3.5mm PVC底板6(型号SM31-40，购自上海金标科技生物有限公司)上，首先将NC膜(型号为Sartorius CN 140)贴于PVC底板的中部，用Bio-dot XYZ-3050三维喷点仪中的Arijet喷膜，将吡虫啉半抗原-鸡卵清蛋白偶联物(制备方法参见文献：“Wang YL,Xu JL,Qiu YL et al.A Highly Specific Monoclonal Antibody andSensitive Quantum Dot Beads-based Fluorescence Immunochromatographic TestStrip for Tebuconazole Assay in Agricultural Products.[J].JOURNAL OFAGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY,2019,67(32):9096-9103.”)和兔抗鼠IgG抗体(购买于杭州伊佰新生物技术有限公司)分别线状喷涂包被于NC膜6上，作为检测线(T线)3和质控线(C线)4，检测线上的喷涂的吡虫啉半抗原-鸡卵清蛋白偶联物浓度为1.5mg/mL，质控线上喷涂兔抗鼠IgG抗体浓度为0.5mg/mL，检测线与质控线之间的距离为7mm。
试纸条的组装
将处理后的样品垫1，结合垫2，固定有NC膜6的底板和吸水垫5(滤纸，型号为SX27，购自上海金标科技生物有限公司)按照顺序(如图1所示)相互重叠2mm并压紧固定，采用微电脑自动斩切机(型号ZQ2000，上海金标生物科技有限公司)将组装好的试纸板切成3.5mm的试纸条，并放入塑料卡壳9中，卡壳卡底压紧，即得到检测吡虫啉的免疫层析试纸条(如图2所示)，最后将做好的试纸条与吸管干燥剂放入铝箔袋中密封。
实施例2
实施例1中制备的荧光免疫层析试纸条检测原理：待测样品滴加到水平放置的试纸条加样孔8中，通过毛细作用沿着试纸条方向(自样品垫端向吸水垫端)泳动，泳动到结合垫时，固态化的量子点荧光微球标记抗体溶解释放，随样品溶液一起沿着试纸条泳动至检测线，当样品中含有吡虫啉时，则其会与相应的量子点荧光微球标记的单克隆抗体发生反应，形成免疫复合物，抑制了量子点荧光微球标记的单克隆抗体与检测线(T线)包被的抗原的结合，在紫外灯照射下，试纸条T线颜色明显变浅或消失，而包被于质控线上的兔抗鼠IgG可与量子点荧光微球标记的抗体结合，形成荧光条带，结果为阳性。反之样品溶液中不含吡虫啉时，量子点荧光微球标记的抗体与检测线(T线)包被的抗原的结合，在紫外灯照射下，试纸条T线显荧光条带，过量的量子点荧光微球标记的抗体被包被于质控线上的兔抗鼠IgG截获，形成荧光条带，结果为阴性。如果紫外灯照射下，质控线没有荧光条带显示，无论检测线是否有显色，均视为试纸条无效。
用体积分数5％甲醇-PBS配制一系列浓度梯度的吡虫啉的标准溶液，分别取100μL梯度标准溶液，滴加到试纸卡的加样孔8中，每个浓度做三个平行，反应10min后用荧光免疫分析仪(苏州和迈精密仪器有限公司)读取试纸条，经过光学元件激发，试纸条T、C线处量子点荧光微球发射出荧光信号，仪器将荧光信号转换成数字信号显示在读取仪显示器上。记录试纸条T线荧光值(FIT)和C线的荧光值(FIC)，并计算其FIT/FIC比值。不含吡虫啉的标准溶液FIT/FIC的值记为B0，含有吡虫啉的梯度标准溶液FIT/FIC记为B，以结合率B/B0×100(％)为纵坐标，吡虫啉浓度为横坐标，建立间接竞争标准曲线。如图4中的A所示，随着吡虫啉浓度的增加，B/B0×100(％)的值逐渐减小，抑制率逐渐变大，吡虫啉IC50＝0.082ng/mL，最低检测限为0.012ng/mL，线性范围为0.023～0.546ng/mL。图4中的B是量子点微球免疫层析试纸条在紫外灯照射下荧光图，随着吡虫啉浓度的增加，检测线上荧光强度逐渐减弱，在浓度为0.5ng/mL时检测线近乎消失，此现象与免疫学竞争规律相符合。
实施例3
以浓度为1μg/mL的吡虫啉、噻虫胺、噻虫啉、烯啶虫胺、啶虫脒的标准品为样品，分别用量子点荧光微球试纸条进行检测，5％甲醇-PBS作阴性对照，结果显示，该试纸条对噻虫胺、噻虫啉、烯啶虫胺、啶虫脒均呈阴性结果，而只有吡虫啉标准样品呈阳性结果。说明本发明对吡虫啉具有较好的特异性，对其他结构类似的农药化合物均未出现明显的交叉反应。
实施例4
与胶体金试纸条的灵敏度比较
采用相同批次的吡虫啉单克隆抗体制备的胶体金免疫层析试纸条进行灵敏度检测比较。用体积分数5％甲醇-PBS配制一系列浓度梯度的吡虫啉的标准溶液，分别取100μL梯度标准溶液，滴加到胶体金免疫层析试纸条的样品垫上，反应10min后观察胶体金试纸条的视觉检测限(T线消失)。结果如图5所示，检测吡虫啉的胶体金免疫层析试纸条的视觉检测限为1.25ng/mL，与本发明制备的基于量子点微球的免疫层析试纸条的视觉检测限相比灵敏度低了25倍。由此可以看出，量子点荧光微球作为标记物在免疫层析检测中具有巨大的优势。
实施例5
在农产品样品中对吡虫啉的加标回收
为了进一步探索本发明在复杂样品中的应用，设计并进行了实际样品的加标回收实验。向黄瓜、小麦样品中添加吡虫啉标准品，使添加终浓度分别10、5和2ng/g，称取5g样品中加入10mL乙腈提取，涡旋震荡10min，4000转离心5min，吸取2mL上清氮气吹干，用1mL 5％甲醇-PBS复溶，稀释10倍应用实施例1中的试纸条和高效液相色谱质谱联用仪(LC-MS/MS)检测，实施例1中的试纸条平均添加回收率范围从77.9％～102.1％，结果与LC-MS/MS检测结果基本吻合，证实了本发明提供的试纸条用于吡虫啉分析的可靠性和实用性，可作为快速、简便地检测农产品中吡虫啉残留的一种有价值的分析工具。
表1不同添加浓度下试纸条与LC-MS/MS的添加回收率
Figure BDA0002605284780000121
由上述实施例可知，本发明提供的试纸条具有快速、简便；检测灵敏度高、特异性好的优势。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测吡虫啉的荧光免疫层析试纸条，包括底板和依次搭接在底板上的样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫，其特征在于，
所述结合垫上包被有量子点微球标记探针，所述量子点微球标记探针是量子点微球与吡虫啉单克隆抗体的偶联物，包被浓度为40～60μg/mL；
所述NC膜由样品垫方向向吸水垫方向依次设有检测线和质控线，所述检测线包被有吡虫啉半抗原-鸡卵清蛋白偶联物，所述质控线包被有兔抗鼠IgG抗体。
2.根据权利要求1所述的检测吡虫啉的荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述检测线上吡虫啉半抗原-鸡卵清蛋白偶联物的浓度为1.4～1.6mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的检测吡虫啉的荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述质控线上兔抗鼠IgG抗体浓度为0.4～0.6mg/mL。
4.根据权利要求3所述的检测吡虫啉的荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述检测线与质控线之间的距离为6～8mm。
5.根据权利要求1所述的检测吡虫啉的荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述搭接的长度为2～3mm。
6.根据权利要求1所述的检测吡虫啉的荧光免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
将样品垫浸入样品垫处理液中浸湿后干燥获得处理后的样品垫；
将结合垫置于结合垫处理液中浸湿后干燥、喷涂量子点微球标记的吡虫啉单克隆抗体获得处理后的结合垫；
将NC膜固定于底板中心后，在所述NC膜上喷涂检测线和质控线；
将处理后的样品垫、处理后的结合垫和吸水垫依次组装于固定有NC膜的底板上。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述样品垫处理液以水为溶剂，包括以下组分：0.008～0.012mol/L PBS、质量分数1.5％～2.5％的BSA、质量分数2％～3％的蔗糖和质量分数0.01％～0.03％的NaN3。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述结合垫处理液以水为溶剂，包括以下组分：15～25mmol/LNa3PO4·12H2O，质量分数4～6％的BSA，体积分数0.2％～0.3％的Tween-20和质量分数8％～12％的蔗糖。
9.权利要求1～5任意一项所述的试纸条在检测吡虫啉中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述试纸条的检测限为0.012ng/mL，所述试纸条的检测线性范围为0.023～0.546ng/mL。
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