CN211478342U - 基于量子点荧光微球的戊唑醇免疫层析试纸条 - Google Patents
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Abstract
本实用新型涉及一种基于量子点荧光微球的戊唑醇免疫层析试纸条，该试纸条包括：PVC底板、样品垫、NC膜和吸水垫；样品垫和吸水垫分别覆盖在NC膜的两端对应的底板上；所述的NC膜上由样品垫方向向吸水垫方向依次设有与底板端面平行的检测线和质控线，检测线上设有戊唑醇抗原涂层，质控线上设有兔抗鼠IgG抗体涂层；本实用新型与传统胶体金免疫层析法试纸条相比，具有稳定性好、检测灵敏度高、可实现对目标物的定量检测，适用于现场监测和大规模快速筛查检测。
Description
技术领域
本发明涉及农药残留免疫分析技术领域，具体涉及一种基于量子点荧光微球标记抗体的检测戊唑醇的免疫层析试纸条，该方法可以快速定量检测农产品中戊唑醇残留。
背景技术
戊唑醇(Tebuconazole)是一种羟乙基三唑衍生物，属广谱、高效、低毒、内吸性强的新型三唑类杀菌剂，是甾醇脱甲基化抑制剂，通过破坏和阻止病菌的细胞膜中麦角甾醇的生物合成，使病原菌不能形成细胞膜而致死，能有效防治禾谷类作物的锈病和白粉病；苹果和香蕉的叶斑病、轮纹病和黑星病等病害。然而长期大量地将戊唑醇用于田间病害防治，由于其持效期长，会造成严重的“3R”问题；另外，研究发现戊唑醇对斑马鱼胚胎发育具有一定的致死、致畸和抑制发育等不良影响，对老鼠具有毒性蓄积和遗传效应，美国环保署(EPA)将其归为潜在人类致癌物，因此亟需建立快速、高灵敏检测戊唑醇杀菌剂的方法。
目前，检测戊唑醇残留的方法主要有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法 (HPLC)、气相色谱质谱联用法(GC/MS)、液相色谱质谱联用技术(LC/MS)和酶联免疫吸附法(ELISA)等。虽然这些方法较为准确、灵敏和重现性好，但需要复杂的操作过程与技术培训，只有在专业实验室，专门从事仪器分析的人员才能进行检测，不能满足现场的快速、高通量检测，特别是在对大量样品进行低成本快速筛选时，优势不足。
免疫层析技术是20世纪80-90年代发展起来的一种将免疫技术和色谱层析技术相结合的快速免疫分析方法，是最常用的即时检测技术(Point of care test, POCT)，该方法因具有通量高、检测快速、成本低且不需要复杂的仪器设备等优势，近年来已被广泛应用到生物医药、农药残留、食品安全检测等领域。胶体金免疫层析试纸条法因具有检测速度快、抗基质干扰能力强、操作简单、无需复杂仪器等优势，是现场快速筛查的首选方法，但该方法存在检测灵敏度不高、人为因素干扰大等缺陷。与传统胶体金标记物相比，荧光标记物具有更高的检测灵敏度，适用于定量分析。基于荧光标记物的免疫层析技术近年来得到了广泛关注，其中量子点具有激发光谱宽、发射光谱窄且对称、高量子产率、摩尔消光系数大、荧光寿命长等优点，是一种具有巨大开发潜力的新型荧光标记材料。量子点微球 (Quantumdot submicrobeads，QBs)通过将大量的量子点包裹于聚合物材料中，表现出更高的荧光强度，并且提高了方法学的灵敏度。
发明内容
本实用新型的目的在于研发一种操作简单、灵敏度高，适用于农产品中戊唑醇农药残留的现场快速检测与筛查的基于量子点荧光微球免疫层析试纸条。为实现上述目的,本实用新型采用以下技术方案：
一种基于量子点荧光微球的戊唑醇免疫层析试纸条，包括PVC底板，样品垫、NC膜和吸水垫，其特征在于，NC膜位于PVC底板的中段，样品垫和吸水垫分别覆盖在NC膜的两端对应的底板上；所述的NC膜上由样品垫方向向吸水垫方向依次设有与底板端面平行的检测线和质控线；
所述底板为聚氯乙烯材料，样品垫为玻璃纤维膜，NC膜为硝酸纤维素膜，吸水垫为滤纸材质；
所述检测线上设有戊唑醇抗原线状涂层，质控线上设有兔抗鼠IgG抗体线状涂层。
所述的戊唑醇抗原是戊唑醇半抗原与鸡卵清白蛋白的偶联物，该偶联物的制备方法为本领域的常规方法，如文献““Wang Y L,Xu J L,Qiu Y L et al.A Highly SpecificMonoclonal Antibody and Sensitive Quantum Dot Beads-based FluorescenceImmunochromatographic Test Strip for Tebuconazole Assay in AgriculturalProducts. [J].JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY,2019,67(32): 9096-9103.”中公开报的的方法制备该偶联物。
所述兔抗鼠IgG抗体同样为市售产品，如本申请中所使用的兔抗鼠IgG抗体即购自杭州伊佰新生物技术有限公司。
进一步，本申请所提供的的基于量子点荧光微球的戊唑醇免疫层析试纸条，样品垫需要用封闭缓冲液浸泡30min后，放入37℃烘箱内干燥过夜，最后放入恒温干燥箱内密封保存备用；
该封闭缓冲液由0.01M PBS，终浓度2％BSA，终浓度2.5％蔗糖，终浓度 0.02％NaN3组成，该缓冲液同样为本领域常规缓冲液，其制备方法参见文献： Zhang D,Li P,LiuW,et al.Development of a detector-free semiquantitative immunochromatographicassay with major aflatoxins as target analytes[J].Sensors and Actuators B:Chemical,2013,185:432-437.中公开的内容。
进一步，本申请所提供的的基于量子点荧光微球的戊唑醇免疫层析试纸条，在NC膜上戊唑醇抗原和兔抗鼠IgG抗体的喷涂浓度为0.6mg/mL和0.8mg/mL，检测线和质控线之间的间隔为7mm，上述喷涂浓度为优选包被浓度，能够提高试纸条的检测灵敏度。
本申请中，样品垫长8mm，宽3.5mm；硝酸纤维素膜长25mm，宽3.5mm；吸水垫长17mm，宽3.5mm；在PVC底板上，样品垫，硝酸纤维素膜、吸水垫各交叠区域的长度均为2mm。
本申请中，NC膜是指硝酸纤维素膜。
本申请提供的一种基于量子点荧光微球的戊唑醇免疫层析试纸条,操作简便、快速、灵敏度高、成本低,可实现现场检测。与现有技术相比，具有以下优点：
(1)本发明方法采用量子点荧光微球为信号标签，可克服外界环境对量子点荧光微球的干扰，更重要的是量子点荧光微球粒径较大，表面提供了很多的羧基化位点，可以与抗体、核酸等生物分子进行特异性的连接，只需很少量样品就能检测，可以起到信号放大作用，大大提高了检测灵敏度并且降低了其它物质的非特异性干扰。
(2)本发明与传统胶体金免疫层析试纸条相比，具有量子点荧光微球标记物稳定性好，检测灵敏度高，可实现对低浓度目标物的定量检测，与胶体金法相比，检测限能提高2-3个数量级。
附图说明
图1为基于量子点荧光微球的戊唑醇免疫层析试纸条的示意图；
图中，1、PVC底板；2、吸水垫；3、样品垫；4、NC膜；5、检测线(T 线)；6、质控线(C线)。
图2为基于量子点荧光微球的戊唑醇免疫层析试纸条的原理图。
图3为基于量子点荧光微球的戊唑醇免疫层析试纸条对加标样品的检测结果图及标准曲线。
图4为基于量子点荧光微球的戊唑醇免疫层析试纸条的特异性检测结果示意图。
具体实施方式
本实施例给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1戊唑醇量子点荧光微球免疫层析试纸条的制备
本实例中，量子点荧光微球免疫层析试纸条是通过如下方法制备、组装的：
1.1量子点荧光微球偶联戊唑醇单克隆抗体的制备
本申请采用EDC活化的方法制备量子点偶联探针，制备方法见参考文献“Ren M,XuH,Huang X,et al.Immunochromatographic assay for ultrasensitive detection ofaflatoxin B1 in maize by highly luminescent quantum dot beads.[J].Acs AppliedMaterials & Interfaces,2014,6(16):14215-14222.”，详细步骤如下：
(1)用超声仪对羧基化量子点荧光微球(制备方法参见文献：“Renguo X, Ute K,Jixue L,et al.Synthesis and characterization of highly luminescent CdSe-coreCdS/Zn0.5 Cd0.5 S/ZnS multishell nanocrystals[J].Journal of the AmericanChemical Society,2005,36(36):7480-7488.”进行超声波处理3-4次，直到量子点荧光微球分布均匀；
(2)取12.5μg的量子点荧光微球加入到500μL的PB缓冲液中，混匀，加入终浓度为5μg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)进行活化，搅拌反应30min；
(3)加入10μL戊唑醇单克隆抗体腹水(0.62mg/mL)，搅拌反应30min；
(4)加入终浓度为1％的BSA溶液，再加入5μg EDC溶液，搅拌反应30 min；
(5)13500rpm，离心15min，弃上清，加入40μL复溶液进行复溶，混匀，得到量子点荧光微球戊唑醇单克隆抗体偶联探针，放入4℃保存待用。该探针及抗体能够与试纸条上包被的抗体结合显荧光，通过测定试纸条的T线和C 线的荧光值从而实现定量检测的目的。
1.2样品垫的预处理与试纸条检测区的制备
将样品垫(玻璃纤维膜，型号为Millipore GFCP000800)浸入样品垫处理液(0.01M PBS，2％BSA，2.5％蔗糖，0.02％NaN3)浸湿后，37℃烘干后，保存备用。
在大小为60mm×3.5mm PVC底板(型号SM31-40，购自上海金标科技生物有限公司)上，首先将NC膜(型号为Sartorius CN 140)贴于PVC底板的中部，用Bio-dot XYZ-3050三维喷点仪中的Arijet喷膜，将戊唑醇抗原(制备方法参见文献：“Wang YL,Xu JL,Qiu YL etal.A Highly Specific Monoclonal Antibody and Sensitive Quantum Dot Beads-based Fluorescence Immunochromatographic Test Strip for Tebuconazole Assay inAgricultural Products.[J].JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY,2019,67(32):9096-9103.”)和兔抗鼠 IgG抗体(购买于杭州伊佰新生物技术有限公司)分别线状喷涂包被于NC膜4 上，作为检测线(T线)5和质控线(C线)6，检测线上的喷涂的戊唑醇抗原浓度为30μg/mm，质控线喷涂羊抗鼠IgG抗体，浓度为40μg/mm；本实施例中，检测线与质控线之间的距离为7mm。
1.3试纸条的组装
将步骤1.2获得的样品垫3，NC膜4(步骤1.2制备)和吸水垫2(滤纸，型号为SX27，购自上海金标科技生物有限公司)按照一定顺序(如图1所示) 相互重叠2mm并压紧固定于PVC底板1上，用切条机将组装好的试纸板切成 3.5mm的试纸条，置于锡箔袋中加入干燥剂密封保存备用，即获得所述戊唑醇量子点荧光微球免疫层析试纸条。
实施例2戊唑醇量子点荧光微球免疫层析试纸条定量检测标准曲线的建立
量子点荧光微球免疫层析试纸条检测流程如图2所示：用0.6μL实例1.1 种制备的量子点荧光微球探针与75μL待检样品体外孵育5min，将孵育物加入到水平放置的试纸条加样孔中，反应15min后用试纸条荧光免疫分析仪(苏州和迈精密仪器有限公司)进行检测。试纸条进入读取仪后，经过光学元件激发，试纸条T、C线处量子点荧光微球发射出荧光信号，仪器将荧光信号转换成数字信号显示在读取仪显示器上。若试纸条T、C线显色为阴性结果；若T线不显色，C线显色，则为阳性结果；若C线不显色，则试纸条判定无效。
取5％甲醇-PBS配制戊唑醇浓度分别为0、0.0098、0.0195、0.0391、0.0781、0.156、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10和20ng/mL的标准溶液，分别取75μ L加入0.6μL实例1.1种制备的量子点荧光微球探针，混匀反应5min，每个浓度做三个平行，滴加到试纸条样品垫上，反应15min后用荧光免疫分析仪 (苏州和迈精密仪器有限公司)读取试纸条FIT/FIC，浓度为0ng/mL的空白标准液FIT/FIC的值记为B0，其他含有戊唑醇标准溶液FIT/FIC记为B，以结合率B/B0×100(％)为纵坐标，戊唑醇浓度为横坐标，绘制竞争抑制曲线，计算 50％抑制率时的TEB浓度及确定线性定量范围。
检测结果如附图3所示：
如图3(A)可知，随着戊唑醇浓度的增加，B/B0×100(％)的值逐渐减小，抑制率逐渐变大，当戊唑醇浓度在0.02～1.25ng/mL时，具有很好的线性关系，见图 3(B)，其线性回归方程为y＝-19.2ln(x)+15.485，R2＝0.9874，根据线性方程求得 IC50＝0.166ng/mL，IC10＝0.021ng/mL。图3(C)是戊唑醇浓度分别为0、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10和20ng/mL紫外灯照射下荧光试纸条实体图，随着戊唑醇浓度的增加，检测线上荧光强度逐渐减弱，在浓度为2.5ng/mL 时检测线近乎消失，此现象与免疫学竞争规律相符合。
实施例3戊唑醇量子点荧光微球免疫层析试纸条特异性测定
将浓度均为1μg/mL的戊唑醇、丙环唑、腈菌唑、多效唑、己唑醇标准品用胶体金试纸条进行交叉反应检测，5％甲醇-PBS作阴性对照，结果见图4，图 4中，泳道1-6分别为空白对照、戊唑醇、丙环唑、腈菌唑、多效唑和己唑醇。
由图4可见，试纸条对丙环唑、腈菌唑、多效唑、己唑醇标准品均呈阴性结果，而只有戊唑醇标准样品呈阳性结果。该结果表明戊唑醇量子点荧光微球免疫层析试纸条对浓度为1μg/mL的其他杀菌剂无交叉反应，即在用戊唑醇量子点荧光微球免疫层析试纸条进行快速检测时其他杀菌剂不会对其造成干扰。因此该戊唑醇量子点荧光微球免疫层析试纸条具有较好的特异性。
实施例4在农产品样品中对戊唑醇的加标回收试验
为了进一步探索本发明在复杂样品中的应用，设计并进行了实际样品的加标回收试验。
4.1样品提取溶剂的选择
将黄瓜、甘蓝用粉碎机打碎成泥浆状，然后取5g样品于50mL离心管中，添加戊唑醇农药标准品，添加浓度分别为：0、0.02、0.05、0.1mg/kg。在涡旋仪上震荡15min，分别加入10mL的5％甲醇-PBS、甲醇、乙腈和丙酮，除5％甲醇-PBS外均加入3g NaCl，振荡混匀30min，随后5,000rpm离心5min使试样残渣、水相和有机相分层。
结果见表1，4种提取溶剂的提取效果乙腈≥丙酮＞甲醇＞5％甲醇-PBS，乙腈平均回收率为79％～95.5％，因此选取乙腈为本实验添加回收的提取溶剂。
表1不同提取溶剂的提取效果比较(n＝3)
注：“ND”表示未检出
4.2样品基质影响的消除
在黄瓜、甘蓝样品中添加戊唑醇浓度为0mg/kg，经乙腈提取后氮气吹干，用5％甲醇-PBS复溶后，用5％甲醇-PBS分别稀释2倍、5倍、10倍、20倍得到相应倍数的空白基质溶液，分别配制0、3.125、6.25ng/mL的戊唑醇基质标准溶液用于量子点荧光微球试纸条，对照组为5％甲醇-PBS配制的0、3.125、6.25 ng/mL TEB标准溶液。选择消除基质影响的最佳稀释倍数。结果发现，乙腈提取后，溶液替换5％甲醇-PBS稀释10倍以上基质影响消失。
4.3农产品样品的添加回收试验
黄瓜、甘蓝样品中戊唑醇的添加浓度分别0、0.02、0.05和0.1mg/kg，称取 5g样品中加入20mL乙腈提取，吸取5mL上层乙腈氮气吹干，加入等体积5％甲醇-PBS复溶，且稀释20倍(灵敏度为0、0.25、0.625、1.25ng/mL)来消除基质影响应用到量子点荧光微球试纸条和LC-MS/MS检测，检测结果如表2所示：
表2不同添加浓度下量子点荧光微球试纸条与LC-MS/MS的添加回收率
由表2可见，黄瓜和甘蓝的基质在稀释20倍后对试纸条的灵敏度均无影响，量子点荧光微球试纸条平均添加回收率范围从70％～95％，量子点荧光微球试纸条检测结果与LC-MS/MS检测结果基本吻合，证实了该量子点荧光微球试纸条用于戊唑醇分析的可靠性和实用性，可作为快速、简便地检测蔬菜中戊唑醇残留的一种有价值的分析工具。
Claims (3)
1.基于量子点荧光微球的戊唑醇免疫层析试纸条，包括PVC底板，样品垫、NC膜和吸水垫，其特征在于，NC膜位于PVC底板的中段，样品垫和吸水垫分别覆盖在NC膜的两端对应的底板上；所述的NC膜上由样品垫方向向吸水垫方向依次设有与底板端面平行的检测线和质控线，检测线上设有戊唑醇抗原涂层，质控线上设有兔抗鼠IgG抗体涂层。
2.根据权利要求1所述的基于量子点荧光微球的戊唑醇免疫层析试纸条，其特征在于，底板为聚氯乙烯材料，样品垫为玻璃纤维膜，NC膜为硝酸纤维素膜，吸水垫为滤纸。
3.根据权利要求1所述的基于量子点荧光微球的戊唑醇免疫层析试纸条，其特征在于，样品垫、NC膜、吸水垫三者之间交叠区域的长度为2mm，检测线与质控线之间的距离为7mm，切割宽度为3.5mm。
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