CN115993451B - 一种甲型流感病毒和腺病毒抗原定量检测试剂盒、制备方法及定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种甲型流感病毒和腺病毒抗原定量检测试剂盒、制备方法及定量检测方法，涉及生物技术领域。本发明提供的甲型流感病毒和腺病毒的定量检测试剂盒，包括：量子点微球标记的甲型流感病毒抗体、量子点微球标记的腺病毒抗体、复溶液A、复溶液B和检测试纸；检测试纸的检测线上包被有甲型流感病毒捕获抗体和腺病毒捕获抗体。该甲型流感病毒和腺病毒的定量检测试剂盒灵敏度高、特异性强、稳定性好、对模拟样本反应灵敏，能实现对甲流病毒和腺病毒抗原的同步定量检测，有效提高诊断效率。且检测操作流程简单、高效，能在15min内报告结果，适用于呼吸道感染及发热患者的现场快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种甲型流感病毒和腺病毒抗原定量检测试剂盒、制备方法及定量检测方法。
背景技术
呼吸道病毒感染是临床最常见的疾病之一，其病原学复杂，感染后的症状相似，流行区域重叠，在临床上难以区分。精确的病原学分析是确诊依据，也是合理选择治疗方案的基础，因此呼吸道病毒快速检测已成为当务之急。目前最常见的呼吸道病毒感染是流感病毒和腺病毒。甲型流感病毒(Influenza A Virus，IAV)是流感季节最常见的病毒，通常在冬季流行，约占流感病毒感染总数的75％。我国甲型流感的暴发从未停止。IAV具有很强的变异性，它是引起人类、家畜及禽类流感流行的主要病毒。甲型流感病毒可分为不同的血清亚型，目前已知有16种不同的HA亚型和9种NA亚型。人腺病毒(Human adenovirus，ADV)52种血清型中约有1/3都与人类疾病有关。ADV主要感染儿童及免疫低下人群，该病原体具有强传染性，一旦出现感染很容易导致重症甚至死亡。近日来多个省市出现了关于游泳池引发集体腺病毒感染的新闻。甲型流感病毒的持续流行和腺病毒的暴发给人们的生活和社会公共防疫系统带来了极大的干扰和压力，IAV和ADV已经成为流行病学的主要研究对象之一。因此甲流和腺病毒的检测可作为呼吸道感染患者的重要筛查项目。
在传染性疾病流行期，早期快速诊断对于患者治疗和疫情防控至关重要，目前IAV和ADV常用的实验室检测方法主要包括病毒分离培养、核酸检测、免疫荧光法等。当2009甲型H1N1流感病毒在全球范围内流行后，世界卫生组织(WHO)和美国疾病预防控制中心(CDC)推荐的实验室检测方法均为实时荧光PCR法。但这些方法需要配备完善的实验室及特殊仪器设备，操作复杂且耗时较长，难以满足现场快速检测的需求。由于感染呼吸道病毒的患者呼吸道黏膜中含有高浓度的病毒，因此直接检测病毒抗原的免疫学方法是个理想的选择。目前应用最广泛的现场快速检测(Point-of-care testing,POCT)技术是胶体金免疫层析法，该技术以简便、快速、半定量等优点被视为目前最有潜力的现场快速检测工具，且操作简便，可在15min左右报告结果，非常适合现场快速检测。但胶体金免疫层析法的灵敏度较低，为了提高检测灵敏度，近年来，越来越多的新型纳米材料被用作免疫产品标记物，如纳米荧光染料、上转换纳米颗粒、量子点微球和纳米磁珠等。在这些材料中，荧光量子点微球(Quantum DotMicrosphere Nanobeads，QBs)具备光稳定性好、荧光强度高、发射波长可调等优越的发光性能，且在量子点表面修饰-COOH、-NH2等不同的官能团后很容易与抗体等生物大分子进行偶联。因此，基于荧光量子点微球标记的免疫层析产品的灵敏度与稳定性优于胶体金免疫层析产品，且结合荧光检测设备还能实现定量检测。国内外也有一些提高甲流和腺病毒检测灵敏度及呼吸道病毒联合检测的相关研究，不过联合检测可能会耗时更久，甚至需要使用特殊仪器。过去十年中，多通路现场快速检测技术的研究也越来越多。目前作为呼吸道感染患者的重要筛查项目，甲流和腺病毒抗原联合检测的研究十分必要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种甲型流感病毒和腺病毒的定量检测试剂盒，实现对甲型流感病毒/腺病毒抗原的快速联合检测，以解决上述问题中的至少一种。
本发明的第二目的在于提供上述定量检测试剂盒的制备方法。
本发明的第三目的在于提供一种甲型流感病毒和腺病毒的定量检测方法。
第一方面，本发明提供了一种甲型流感病毒和腺病毒的定量检测试剂盒，包括：量子点微球标记的甲型流感病毒抗体、量子点微球标记的腺病毒抗体、复溶液A、复溶液B和检测试纸；
所述复溶液A包括：0.03-0.125mol/L Tris-HCl、0.5-5wt％Tween-20、1.5-6wt％糖、0.1-1wt％牛血清白蛋白和0.1-1wt％聚乙二醇20000，pH为7.0-10.0；
所述复溶液B包括：0.01-0.15mol/L Tris-HCl、0.5-3.5wt％Tween-20、1.5-6wt％糖、0.1-1wt％牛血清白蛋白和0.1-1wt％聚乙二醇20000，pH为7.0-10.0；
所述检测试纸的检测线上包被有甲型流感病毒捕获抗体和腺病毒捕获抗体。
作为进一步技术方案，所述复溶液A包括：0.075mol/L Tris-HCl、3wt％Tween-20、3wt％糖、0.5wt％牛血清白蛋白和0.5wt％聚乙二醇20000，pH为8.5；
所述复溶液B包括：0.075mol/L Tris-HCl、3wt％Tween-20、3wt％糖、0.5wt％牛血清白蛋白和0.5wt％聚乙二醇20000，pH为7.5。
作为进一步技术方案，所述甲型流感病毒抗体和甲型流感病毒捕获抗体为鼠抗甲型流感病毒单克隆抗体。
作为进一步技术方案，所述甲型流感病毒抗体选自菲鹏生物股份有限公司，批号为20201012；所述甲型流感病毒捕获抗体选自菲鹏生物股份有限公司，批号为20200702。
作为进一步技术方案，所述腺病毒抗体和腺病毒捕获抗体为鼠抗腺病毒单克隆抗体。
作为进一步技术方案，所述腺病毒抗体选自中美歆新生物科技有限公司，批号为A016；所述腺病毒捕获抗体选自中美歆新生物科技有限公司，批号为A477。
作为进一步技术方案，所述检测试纸为双通道检测试纸；
所述双通道检测试纸的检测线分别包被有甲型流感病毒捕获抗体和腺病毒捕获抗体，质控线包被羊抗鼠IgG多克隆抗体。
作为进一步技术方案，所述检测线的划膜抗体浓度分别为：
甲型流感病毒捕获抗体：0.3-0.9mg/mL；
腺病毒捕获抗体：0.7-2.0mg/mL。
作为进一步技术方案，所述检测线的划膜抗体浓度分别为：
甲型流感病毒捕获抗体：0.8mg/mL；
腺病毒捕获抗体：1.0mg/mL。
第二方面，本发明提供了上述定量检测试剂盒的制备方法，将所述检测试纸、复溶液A和复溶液B组合得到。
第三方面，本发明提供了一种甲型流感病毒和腺病毒的定量检测方法，采用所述的定量检测试剂盒进行检测，包括如下步骤：
将量子点微球标记的甲型流感病毒抗体采用复溶液A溶解，将量子点微球标记的腺病毒抗体采用复溶液B溶解，然后分别与待测样本混合孵育，再将孵育后的待测样本滴加所述检测试纸检测，根据信号强度计算待测样本中甲型流感病毒和腺病毒的含量。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的甲型流感病毒和腺病毒的定量检测试剂盒灵敏度高、特异性强、稳定性好、对模拟样本反应灵敏，能实现对甲流病毒和腺病毒抗原的同步定量检测，有效提高诊断效率。且检测操作流程简单、高效，能在15min内报告结果，适用于呼吸道感染及发热患者的现场快速检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为IAV/ADV抗原检测试纸(量子点免疫层析法)工作原理；
图2为试纸检测不同浓度培养物的信号值统计，其中a为试纸检测IAV培养物的信号值统计，b为试纸检测ADV培养物的信号值统计；
图3为试纸在不同T线划膜抗体浓度下的检测信号值和信噪比，其中a、b为不同T线浓度的甲流试纸检测结果，c、d为不同T线浓度的腺病毒试纸检测结果；
图4为IAV复溶液不同组分大小、含量下的检测信噪比，其中a为不同的PH值下的检测信噪比，b为不同Tris-HCl浓度下的检测信噪比，c为不同Tween-20含量下的检测信噪比，d为不同糖含量下的检测信噪比；
图5为ADV复溶液不同组分大小、含量下的信噪比，其中a为不同的PH值下的检测信噪比，b为不同Tris-HCl浓度下的检测信噪比，c为不同Tween-20含量下的检测信噪比，d为不同糖含量下的检测信噪比；
图6为层析试纸检测不同浓度培养物构建的标准曲线，其中a为甲流的标准曲线，b为腺病毒的标准曲线，c为甲流试纸检测后的图片，d为腺病毒试纸检测后的图片；
图7为甲流试纸检测国参最低检出限参考品，其中a为L1(2009H1N1)的检测结果，b为L2(季节性H1N1)检测结果，c为L3(甲型H3N 2)检测结果；
图8为甲流试纸特异性检测结果，其中a为试纸特异性检测国参阳性参考品P1-P10的信号均值与对应的凝胶成像仪图片，b为为试纸特异性检测国参阴性参考品N1-N10的信号均值与对应的凝胶成像仪图片，c、e为试纸检测国参最低检出限参考品L1-L3的信号均值和对应的凝胶成像仪图片，d、f为试纸检测国参重复性参考品R的10次检测信号值和对应的凝胶成像仪图片；
图9为腺病毒试纸特异性检测结果，其中a为试纸特异性检测的信号均值和对应的凝胶成像仪图片，b为试纸特异性检测的信号均值和对应的凝胶成像仪图片；
图10为IAV和ADV咽拭子模拟样本检测结果，其中a为甲流咽拭子中添加随机浓度的病毒培养物制备的模拟样本检测结果，b为腺病毒咽拭子中添加随机浓度的病毒培养物制备的模拟样本检测结果，c为甲流病毒模拟样本试纸加样层析后再凝胶成像仪下的照片、d为腺病毒模拟样本试纸加样层析后再凝胶成像仪下的照片。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面，本发明提供了一种甲型流感病毒和腺病毒的定量检测试剂盒，包括：量子点微球标记的甲型流感病毒抗体、量子点微球标记的腺病毒抗体、复溶液A、复溶液B和检测试纸；
所述复溶液A包括：0.03-0.125mol/L Tris-HCl、0.5-5wt％Tween-20、1.5-6wt％糖、0.1-1wt％牛血清白蛋白和0.1-1wt％聚乙二醇20000，pH为7.0-10.0；
所述复溶液B包括：0.01-0.15mol/L Tris-HCl、0.5-3.5wt％Tween-20、1.5-6wt％糖、0.1-1wt％牛血清白蛋白和0.1-1wt％聚乙二醇20000，pH为7.0-10.0；
所述检测试纸的检测线上包被有甲型流感病毒捕获抗体和腺病毒捕获抗体。
本发明提供的甲型流感病毒和腺病毒的定量检测试剂盒灵敏度高、特异性强、稳定性好、对模拟样本反应灵敏，能实现对甲流病毒和腺病毒抗原的同步定量检测，有效提高诊断效率。且检测操作流程简单、高效，能在15min内报告结果，适用于呼吸道感染及发热患者的现场快速检测。
在一些优选的实施方式中，量子点微球标记的甲型流感病毒抗体或量子点微球标记的腺病毒抗体的制备方法包括：将量子点微球活化后与抗体孵育，然后依次经过封闭和清洗后制备得到量子点标记的抗体。
在一些优选的实施方式中，量子微球例如可以为水溶性羧基化CdSe/ZnS量子点微球。
在一些优选的实施方式中，所述复溶液A包括：0.075mol/L Tris-HCl、3wt％Tween-20、3wt％糖、0.5wt％牛血清白蛋白和0.5wt％聚乙二醇20000，pH为8.5；
所述复溶液B包括：0.075mol/L Tris-HCl、3wt％Tween-20、3wt％糖、0.5wt％牛血清白蛋白和0.5wt％聚乙二醇20000，pH为7.5。
经发明人研究发现，复溶液各组分的大小、含量对检测信号强度和背景值都有很大影响，通过对复溶液的pH值，Tris-HCl离子浓度，Tween-20和糖的含量进行优化得到最佳复溶液配比。
在一些优选的实施方式中，所述甲型流感病毒抗体和甲型流感病毒捕获抗体为鼠抗甲型流感病毒单克隆抗体。
优选地，所述甲型流感病毒抗体选自菲鹏生物股份有限公司，批号为20201012；所述甲型流感病毒捕获抗体选自菲鹏生物股份有限公司，批号为20200702。
在一些优选的实施方式中，所述腺病毒抗体和腺病毒捕获抗体为鼠抗腺病毒单克隆抗体。
优选地，所述腺病毒抗体选自中美歆新生物科技有限公司，批号为A016；所述腺病毒捕获抗体选自中美歆新生物科技有限公司，批号为A477。
在一些优选的实施方式中，所述检测试纸为双通道检测试纸，能够分别实现对甲型流感病毒抗原和腺病毒抗原的检测。
所述双通道检测试纸的检测线分别包被有甲型流感病毒捕获抗体和腺病毒捕获抗体，质控线包被羊抗鼠IgG多克隆抗体。
在一些优选的实施方式中，所述检测线的划膜抗体浓度分别为：
甲型流感病毒捕获抗体：0.3-0.9mg/mL，优选为0.8mg/mL；
腺病毒捕获抗体：0.7-2.0mg/mL，优选为1.0mg/mL。
第二方面，本发明提供了上述定量检测试剂盒的制备方法，包括将所述检测试纸、复溶液A和复溶液B组合得到。
该制备方法简单方便。
第三方面，本发明提供了一种甲型流感病毒和腺病毒的定量检测方法，采用所述的定量检测试剂盒进行检测，包括如下步骤：
将量子点微球标记的甲型流感病毒抗体采用复溶液A溶解，将量子点微球标记的腺病毒抗体采用复溶液B溶解，然后分别与待测样本混合孵育，再将孵育后的待测样本滴加所述检测试纸检测，根据信号强度计算待测样本中甲型流感病毒和腺病毒的含量。
该方法简单高效，适用于呼吸道感染及发热患者的现场快速检测。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试剂
水溶性羧基化CdSe/ZnS量子点微球(型号：FM610C；粒径：120nm；批号：QBB12120D17586M)购自北京纳晶生物科技有限公司。鼠抗甲型流感病毒单克隆抗体Ab06(浓度：7.9mg/mL；批号：20201012)和Ab07(浓度：4.1mg/mL；批号：20200702)购自菲鹏生物股份有限公司。鼠抗腺病毒单克隆抗体Ab01(浓度：2.1mg/mL；批号：A016)和Ab02(浓度：5.1mg/mL；批号：A477)、羊抗鼠IgG多克隆抗体(浓度：9.8mg/mL；批号：1713)、甲型流感病毒培养物(批号：A431)均购自中美歆新生物科技有限公司。腺病毒培养物ADV5、ADV7、ADV14、ADV55均为本院自制，腺病毒培养物ADV41(批号：2022011)购自广州邦德盛生物科技有限公司。甲型流感病毒抗原检测试剂国家参考品(批号：370003-202002)购自中国食品药品检定研究院。用于腺病毒试纸特异性检测的甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟菌培养物均来自于甲型流感病毒抗原检测试剂国家参考品。
N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3-(3′-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC)均购自北京百灵威科技有限公司，二甲亚砜(DMSO)购自北京伊诺凯科技有限公司，吗啉乙磺酸(MES)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，聚乙二醇-20000(PEG-20000)、蔗糖和牛血清白蛋白(BSA)购自国药集团化学试剂有限公司，海藻糖(无水)购自上海梯希爱化成工业有限公司，吐温-20(Tween-20)购自美国Sigma公司。
硝酸纤维素膜(NC膜，CN 140)购自德国Sartorius公司，样品垫、吸水纸和PVC底板均购自上海杰一生物技术有限公司。
1.1.2仪器
自动喷金划膜仪(型号：WRF-HPY001)购自海宁威尔芬自动化设备有限公司，微电脑自动斩切机(型号：ZQ2000)、数控裁条机(型号：CTS300)均购自上海金标生物科技有限公司，干式荧光免疫分析仪(型号：FIC-S100)购自苏州和迈精密仪器有限公司，全自动凝胶成像仪(型号：Fusion FXSpectra)产自法国VILBER LOURMAT公司，小型超声清洗机(型号：JP-3800S)购自深圳市洁盟清洗设备有限公司，小型台式高速冷冻离心机(型号：Centrifuge5430R)产自德国Eppendorf公司。数字PCR平台(型号：TD-1)购自北京新羿科技生物有限公司，全自动核酸提取仪(型号：GeneRotex 96)购自西安天隆科技有限公司。
1.2方法
1.2.1量子点标记抗体的制备
取25μLMES(20mmol/L，PH6.0)与25μL量子点微球(QBs，1μmol/L)超声混合3min，加入20mg/mL的EDC和NHS的DMSO溶液各1μL，涡旋混匀，共制备两管，37℃避光活化15min；10000g离心20min后弃上清液，加25μLMES(10mmol/L，PH6.0)溶液重悬沉淀，涡旋混匀；再在上述两管中分别加入10μgIAV抗体Ab07(制备IAV抗体偶联物QBs-Ab07)、10μgADV抗体Ab02(制备ADV抗体偶联物QBs-Ab02)，涡旋混匀后37℃、800rpm避光振荡孵育1h；随后加入10％的BSA溶液25μL，涡旋混匀后37℃避光封闭30min，10000g离心15min，弃上清液；再加入50μL硼酸缓冲液(5mmol/L，PH8.0)+1％BSA溶液重悬洗涤1次，10000g离心15min，弃上清液；最后加入25μL硼酸缓冲液(5mmol/L，PH8.0)+1％BSA溶液重悬，得到IAV和ADV偶联物母液，4℃保存备用。
1.2.2试纸的组装
将两张硝酸纤维素膜(NC膜)分别粘贴在两条底板上，使用自动喷金划膜仪将IAV捕获抗体Ab06(0.8mg/mL)和ADV捕获抗体Ab01(1.0mg/mL)分别包被在两张NC膜上作为检测线(T线)，将羊抗鼠IgG多克隆抗体(0.5mg/mL)包被在NC膜上作为质控线(C线)。划膜完成后将两个板子置于烘箱37℃烘干3h，干燥完成后将样品垫和吸水纸依次组装到底板上并压实，使用数控裁条机裁切成3mm宽的条子，干燥、避光保存备用。
1.2.3检测步骤
分别取适量保存的IAV和ADV偶联物母液用复溶液(0.01-0.15mol/LTris-HCl、0.5-5wt％Tween-20、1.5-6wt％糖、0.1-1wt％牛血清白蛋白和0.1-1wt％聚乙二醇20000，pH为7.0-10.0)稀释1000倍，再分别加入IAV培养物、ADV培养物得到阳性样本，不加抗原的作为阴性对照；800rpm、37℃振荡孵育2min；分别取60μL孵育后的样本滴加到双通道检测试纸IAV、ADV对应的样品垫上，层析15min。
1.2.4信号采集与统计学分析
层析15min后，将试纸插入干式荧光免疫分析仪，读取并记录C线和T线的荧光值。接着立即使用凝胶成像仪对试纸进行拍照。整个流程在样本层析的18min内完成。
每组数据做三次平行实验，使用GraphPad Prism(版本：9.1.1)对实验数据进行处理和图片制作。使用Adobe Photoshop(版本：2017.1.0)进行图片编辑。使用AdobeIllustrator(版本：2019)进行原理图绘制。
2结果
2.1体系优化
IAV/ADV量子点免疫层析试纸检测原理如图1所示。试纸由样品垫、NC膜与吸水纸共同组装在底板上组成。首先采用活化酯法将羧基化量子点微球(QBs)与病毒特异性单抗Ab1进行偶联制备量子点标记病毒特异性抗体偶联物QBs-Ab1。NC膜上包被有病毒捕获抗体Ab2(T线)和羊抗鼠IgG(C线)。当采集的含有病毒的口咽拭子或鼻咽拭子样本与复溶液稀释后的偶联物混合后，Ab1与样本中的抗原结合形成QBs-Ab1-抗原复合物；将复合物滴加在样品垫上，向上层析到T线时，捕获抗体与复合物中的抗原结合，形成QBs-Ab1-抗原-Ab2复合物沉积在T线；过量的偶联物QBs-Ab1继续向上层析，复合物中的Ab1与羊抗鼠IgG反应沉积在C线。
影响检测信号强弱的原因有很多，一般认为检测样本的病毒滴度和NC膜上捕获抗体的浓度产生的影响较大。复溶液作为反应体系中偶联物的稀释液，对检测信号也有一定影响。因此除了筛选培养物浓度和T线抗体浓度外，对复溶液的pH和离子浓度大小以及各组分含量的优化也是本研究的重要工作。
2.1.1检测培养物浓度筛选
由于IAV和ADV培养物没有标定浓度，所以本实验使用全自动数字PCR仪对培养物进行核酸定量，得到IAV和ADV培养物浓度分别为1.0x107copies/mL和5.0x1010copies/mL。使用组装的IAV/ADV抗原联合检测试纸分别检测不同浓度的IAV和ADV5培养物，以筛选出合适的实验培养物浓度。检测时使用复溶液将IAV培养物检测终浓度稀释至1.0x104、2.5x104、5.0x104、1.0x105copies/mL，将ADV培养物检测终浓度稀释至1.0x106、2.5x106、5.0x106、1.0x107copies/mL。每个浓度平行检测三根条子，每根条子进行三次独立信号检测，取信号平均值，图2中的a和图2中的b(a为试纸检测IAV培养物，适宜抗原使用浓度为5.0x104copies/mL；b为试纸检测ADV培养物，适宜抗原使用浓度为5.0x106 copies/mL)分别为检测不同浓度IAV和ADV培养物的信号均值统计。从图中可以知道，IAV和ADV培养物浓度分别为5.0x104 copies/mL和5.0x106 copies/mL时的信号值已经可以产生清晰的信号条带，因此后续选择该浓度的培养物进行体系筛选。
2.1.2T线划膜抗体浓度优化
分别制备四种T线抗体浓度的甲流试纸(T线抗体浓度设定为0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)和腺病毒试纸(T线抗体浓度设定为0.8、1.0、1.5、2.0mg/mL)，取适量保存的IAV偶联物母液和ADV偶联物母液分别使用复溶液稀释1000倍后，对应加入IAV和ADV5培养物，使得培养物浓度分别为5.0x104copies/mL和5.0x106 copies/mL，得到阳性样本，不加培养物的阴性样本作为对照。检测阳性样本得到的信号均值与检测阴性对照得到的信号均值的比值记做信噪比(Signal-Noise ratio)，通过对信噪比的比较得到试纸的T线划膜抗体浓度。
图3(a、b为不同T线浓度的甲流试纸检测结果，c、d为不同T线浓度的腺病毒试纸检测结果)记录了试纸在不同T线抗体浓度下的检测信噪比。从图中可以看出，信号值随着T线抗体浓度的增大而增大，信噪比随着T线抗体浓度的增大呈现先增大后减小的趋势。当抗体浓度为0.8mg/mL时，甲流试纸信噪比最大，当抗体浓度为1.0mg/mL时，腺病毒试纸信噪比最大，所以甲流和腺病毒试纸T线的划膜抗体浓度分别选择0.8和1.0mg/mL。
2.1.3复溶液组分优化
复溶液各组分的大小、含量对检测信号强度和背景值都有很大影响，实验通过对复溶液的pH值，Tris-HCl离子浓度，Tween-20和糖的含量进行优化得到最佳复溶液配比。单个参数筛选时，复溶液其他参数保持一致。检测培养物浓度选择2.1.1筛选出的最佳实验培养物浓度，试纸T线浓度选择2.1.2筛选出的最佳T线浓度。
图4和图5(a为不同pH值；b为不同Tris-HCl浓度；c为不同Tween-20含量；d为不同糖含量)为IAV和ADV复溶液体系筛选结果。从图4中的a和5中的a可以看出，IAV和ADV体系pH分别为8.5和7.5时的检测信噪比最大，继续增大pH，信噪比又会减小。一般认为抗体水化程度在pH接近抗体等电点时比较小，能让标记后的偶联物更稳定，使用时不易在溶液中发生团聚或沉淀，从实验结果来看IAV和ADV复溶液最佳pH分别为8.5和7.5。缓冲液的离子浓度对层析过程也有很大影响，从4中的b和5中的b可以看出信噪比随着Tris-HCl离子浓度的增大而呈现先增大后减小的趋势，主要是因为适当增大离子浓度可以有效减小背景值，但离子浓度太大可能会造成偶联物释放、层析不理想。当离子浓度为0.075mol/L时，IAV和ADV信噪比均达到最大值，继续增大离子浓度信噪比又会减小，所以两者复溶液离子浓度选择0.075mol/L。复溶液Tween-20的含量与偶联物在NC膜上的毛细管位移有关，从4中的c和5中的c可以看出Tween-20含量为3％时的信噪比最大，因此两者复溶液Tween-20含量选择3％。糖对偶联在微球上的抗体起到“保护剂”的作用，从4中的d和5中的d可以看出，IAV和ADV复溶液的最佳糖含量均为3％。
2.2试纸性能考察
2.2.1检测灵敏度
使用筛选出的IAV和ADV最佳复溶液体系稀释对应偶联物后，各自添加不同浓度的IAV培养物(1.0×103、2.5×103、5.0×103、1.0×104、2.5×104、5.0×104、1.0×105、2.5×105copies/mL)和ADV5培养物(1.0×105、2.5×105、5.0×105、1.0×106、2.5×106、5.0×106、1.0×107、2.5×107、5.0×107copies/mL)，孵育后进行上样检测。图6(a为甲流的标准曲线，b为腺病毒的标准曲线。横坐标为培养物浓度的log值)以及检测结果在凝胶成像仪下的照片(c为甲流试纸检测后的图片，d为腺病毒试纸检测后的图片。Blank为阴性对照组)为使用干式荧光免疫分析仪检测出的荧光信号值构建的标准曲线和凝胶成像仪拍摄的上样层析后的试纸图片，IAV和ADV标准曲线分别如图6中的a和图6中的b所示，图中纵坐标表示荧光信号均值，横坐标取培养物浓度的log值。拟合出的四参数曲线方程分别为：IAV： R2＝0.9951；ADV：/>R2＝0.9958。误差条代表3根试纸9个独立测试的标准偏差(SD)。IAV和ADV培养物的最低检出限(LOD)分别约为8.6×102copies/mL和1.1×104copies/mL，LOD通过IUPAC(国际纯粹与应用化学联合会)标准方法计算，即LOD＝Yblank+3SD，其中Yblank代表空白对照的平均信号值，3SD代表空白对照信号值标准差的3倍。图7(a、b、c分别为L1(2009H1N1)、L2(季节性H1N1)、L3(甲型H3N2)的检测结果，Blank为阴性对照组)为甲流试纸检测甲型流感病毒抗原检测试剂国家参考品最低检出限参考品L1(2009H1N1)、L2(季节性H1N1)、L3(甲型H3N2)的结果。从图7可以知道，L1、L2、L3的浓度分别为2.2×103copies/mL、4.8×104copies/mL和2.0×104copies/mL时的检测信号值最接近Yblank+3SD，上述浓度即为试纸对L1、L2、L3的最低检出限估算值，分别比图6中的a中标准曲线的计算结果高出2.6、55.8、23.3倍。标曲和检测L参考品估算得到的LOD总体出入不大，说明本研究标曲构建合理，其中L1的LOD值最低，表明试纸对2009H1N1培养物的检测最为灵敏。有研究(D.Lee,C.-H.Chu,A.F.Sarioglu,Point-of-Care Toolkit forMultiplex Molecular Diagnosis of SARS-CoV-2and Influenza A and B Viruses,ACSsensors 6(9)(2021)3204-3213.)表明甲型流感病毒检测的LOD值为5.0×104copies/mL，比本研究检测IAV的LOD值高出58倍。其他文献(F.-z.Qiu,X.-x.Shen,M.-c.Zhao,L.Zhao,S.-x.Duan,C.Chen,J.-J.Qi,G.-x.Li,L.Wang,Z.-s.Feng,A triplex quantitativereal-time PCR assay for differential detection of human adenovirus serotypes2,3and 7,Virology Journal 15(1)(2018)1-6.)报道的实时荧光PCR法检测腺病毒的LOD为1.0×104copies/mL，本研究检测ADV的LOD值基本与之相当。对IAV和ADV的检测，除PCR法外，还有许多生物、化学免疫传感平台以及SERS免疫层析法、Elisa法，不过这些方法目前需要耗费的时间周期比较长，检测时间也大都以小时计，且很多方法都需要借助精密仪器。本研究制备的量子点免疫层析试纸使用时无需借助昂贵的仪器，能在15min根据测定信号值报告病毒定量结果，更适合现场快速检测。
表1IAV和ADV检测数据统计
注：[1]W.Teixeira,Y.Pallás-Tamarit,A.Juste-Dolz,A.Sena-Torralba,R.Gozalbo-Rovira,J.Rodríguez-Díaz,D.Navarro,J.Carrascosa,D.Gimenez-Romero,Maquieira,An all-in-one point-of-care testing device for multiplexeddetection of respiratory infections,Biosensors and Bioelectronics(2022)114454.
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表中“H”是指以小时计时长。
2.2.2分析特异性
用组装好的IAV/ADV抗原联合检测试纸的甲流试纸分别检测稀释20倍(国参说明书中不稀释)的国参阳性参考品P1(2009H1N1)、P2(2009H1N1)、P3(2009H1N1)、P4(2009H1N1)、P5(季节性H1N1)、P6(季节性H1N1)、P7(甲型H3N2)、P8(甲型H3N2)、P9(甲型H3N2)、P10(甲型H7N9)和国参原液阴性参考品N1(呼吸道合胞病毒培养物)、N2(副流感病毒培养物)、N3(腺病毒培养物)、N4(金黄色葡萄球菌培养物)、N5(脑膜炎奈瑟菌培养物)、N6(肺炎链球菌培养物)、N7(乙型流感病毒培养物)、N8(乙型流感病毒培养物)、N9(乙型流感病毒培养物)、N10(乙型流感病毒培养物)，检测结果如图8(a、b为试纸特异性检测国参阳性参考品P1-P10和阴性参考品N1-N10的信号均值与对应的凝胶成像仪图片，Blank为阴性对照组；c、e为试纸检测国参最低检出限参考品L1-L3的信号均值和对应的凝胶成像仪图片；d、f为试纸检测国参重复性参考品R的10次检测信号值和对应的凝胶成像仪图片。P1-P4，L1:2009H1N1；P5、P6、L2:季节性H1N1；P7-P9，L3、R:甲型H3N2；P10:甲型H7N9；N1:呼吸道合胞病毒；N2：副流感病毒；N3:腺病毒；N4:金黄色葡萄球菌；N5:脑膜炎奈瑟菌；N6:肺炎链球菌；N7-N10：乙型流感病毒)中的a和b所示，可以观测到阳性参考品的检测结果均为阳性，阳性符合率为10/10。阴性参考品的检测结果均为阴性，阴性符合率为10/10。同时检测稀释160倍的最低检出限参考品L1(2009H1N1)、L2(季节性H1N1)、L3(甲型H3N2)以及稀释20倍(国参说明书中稀释10倍)的重复性参考品R(甲型H3N2)，检测结果见图8中的c、d、e、f，可以观测到稀释160倍的最低检出限参考品和10次重复性参考品的检测结果均为阳性。用组装好的联合检测试纸的腺病毒试纸分别检测浓度为1.0×107copies/mL的ADV5、ADV7、ADV14、ADV55培养物和浓度为1.0×106copies/mL的ADV41培养物以及浓度为1.0×107copies/mL的甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟菌培养物，检测结果如图9(a、b为试纸特异性检测的信号均值和对应的凝胶成像仪图片，Blank为阴性对照组。ADV5、7、14、55、41:腺病毒5、7、14、55、41型培养物；IAV：甲型流感病毒；IBV：乙型流感病毒；PIV：副流感病毒；RSV：呼吸道合胞病毒；SP：肺炎链球菌；SA：金黄色葡萄球菌；MC：脑膜炎奈瑟菌。)所示，可以观测到ADV5、7、14、55以及41型培养物检测结果均为阳性，其他病毒检测结果均为阴性。表明制备的联合检测试纸具有良好的特异性，与其他相关病原体无交叉反应。
2.2.3稳定性
将IAV偶联物、ADV偶联物使用对应的复溶液稀释后，分装至200μL离心管中，每管分装60μL，然后使用冷冻干燥机进行冻干(冷冻干燥机程序设置：先-65℃冷冻2h，再-65℃真空冷冻干燥24h)。冻干完成后，将冻干粉、装入卡壳的试纸、干燥剂放入铝箔袋，使用封口机进行封口，放入烘箱37℃进行稳定性实验。根据阿伦尼乌斯加速模型，37℃加速91天相当于常温放置1年，加速实验提示本研究的IAV/ADV联合检测试纸可以常温稳定4个月以上。
2.2.4模拟样本检测
本研究采用检测咽拭子模拟样本的方式来进一步评估试纸性能。取正常人咽拭子样本5例，每例样本置于500μl复溶液中充分洗脱，从洗脱液中分别取适量加入随机量的IAV/ADV培养物，混合后各得到3例IAV和3例ADV阳性模拟样本，同时做不加培养物的阴性对照组。在模拟样本中对应加入终稀释倍数为1000倍的IAV/ADV偶联物，孵育后分别进行甲流和腺病毒试纸上样层析，试纸对15例阳性模拟样本的检测结果均为阳性，对5例阴性模拟样本的检测结果均为阴性，图10(a、b为咽拭子中添加随机浓度的病毒培养物制备的模拟样本检测结果，其中Blank为不添加病毒的阴性对照组。c、d为试纸加样层析后在凝胶成像仪下的照片)为部分模拟样本的检测结果。试纸对模拟样本检测的阳性符合率和阴性符合率均为100％，说明制备的联合检测层析试纸对样本检测反应较为灵敏。同时图10中的a和b的荧光信号值结合标准曲线方程，可以得出甲流病毒S1-S5模拟样本的病毒浓度分别为3.0×104copies/mL、2.7×104copies/mL、2.6×104copies/mL、2.2×104copies/mL、3.2×104copies/mL，腺病毒S1-S5模拟样本病毒浓度分别为2.6×106copies/mL、3.2×106copies/mL、3.2×106copies/mL、2.2×106copies/mL、1.3×106copies/mL。
3讨论
本研究采用荧光量子点微球作为标记物制备甲型流感病毒/腺病毒抗原联合检测层析试纸，该试纸可实现对IAV和ADV抗原的联合检测，且能在15min内借助紫外设备判定结果，结合检测的荧光信号值还可以实现病毒定量，非常适合现场快速检测。实验制备的免疫层析联合检测试纸具有较强的特异性，能够与IAV/ADV产生特异性反应，而与乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒等常见的呼吸道病原体无交叉反应。同时，试纸稳定性比较好，可以室温稳定保存4个月以上。联合检测试纸对IAV和ADV抗原的检测灵敏度分别能达到8.6×102copies/mL和1.1×104copies/mL。IAV的LOD比甲型流感病毒RNA检测集成工具标出的LOD值(5.0×104copies/mL)低58倍，同时ADV的LOD基本与实时荧光PCR法检测腺病毒的LOD(1.0×104copies/mL)值相当。虽然有一些方法也做到了较低的检出限(表1)，但是这些方法耗费更多时间和成本，相比而言，本研究制备的试纸更适合现场快速检测，且能做到对IAV和ADV的同步检测，减少疾病筛查时间，对甲流或腺病毒疫情的有效控制提供了新的技术手段。
本研究制备的IAV/ADV抗原联合检测试纸灵敏度高、特异性强，且在实现对发热患者重要筛查项目甲流和腺病毒抗原的联合检测的同时实现病毒定量检测，整个检测过程只需15min。本研究采集正常人的咽拭子样本，加入不同浓度的病毒培养物制备模拟样本，对试纸进行性能评估，后续工作仍应采用大量临床实际样本对试纸进行进一步评价。同时考虑到核酸定量结果包含不确定量的死病毒，这些死病毒没有抗原性，故核酸定量结果与病毒抗原量之间没有直接的对应关系，因此后续还需基于模拟样本对抗原定量进行深入研究。本研究建立的IAV/ADV抗原联合检测免疫层析方法为我国流感及腺病毒疫情防控提供了技术支撑，也为进一步研制特异的IAV/ADV快速诊断试剂提供方法学参考。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (7)
1.一种甲型流感病毒和腺病毒的定量检测试剂盒，其特征在于，包括：量子点微球标记的甲型流感病毒抗体、量子点微球标记的腺病毒抗体、复溶液A、复溶液B和检测试纸；
所述复溶液A包括：0.075mol/L Tris-HCl、3wt％Tween-20、3wt％糖、0.5wt％牛血清白蛋白和0.5wt％聚乙二醇20000，pH为8.5；
所述复溶液B包括：0.075mol/L Tris-HCl、3wt％Tween-20、3wt％糖、0.5wt％牛血清白蛋白和0.5wt％聚乙二醇20000，pH为7.5；
所述检测试纸的检测线上包被有甲型流感病毒捕获抗体和腺病毒捕获抗体；
所述检测试纸为双通道检测试纸；
所述双通道检测试纸的检测线分别包被有甲型流感病毒捕获抗体和腺病毒捕获抗体，质控线包被羊抗鼠IgG多克隆抗体；
所述检测线的划膜抗体浓度分别为：
甲型流感病毒捕获抗体：0.8mg/mL；
腺病毒捕获抗体：1.0mg/mL。
2.根据权利要求1所述的定量检测试剂盒，其特征在于，所述甲型流感病毒抗体和甲型流感病毒捕获抗体为鼠抗甲型流感病毒单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的定量检测试剂盒，其特征在于，所述甲型流感病毒抗体选自菲鹏生物股份有限公司，批号为20201012；所述甲型流感病毒捕获抗体选自菲鹏生物股份有限公司，批号为20200702。
4.根据权利要求1所述的定量检测试剂盒，其特征在于，所述腺病毒抗体和腺病毒捕获抗体为鼠抗腺病毒单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的定量检测试剂盒，其特征在于，所述腺病毒抗体选自中美歆新生物科技有限公司，批号为A016；所述腺病毒捕获抗体选自中美歆新生物科技有限公司，批号为A477。
6.权利要求1-5任一项所述的定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，将所述检测试纸、复溶液A和复溶液B组合得到。
7.一种非疾病诊断或治疗目的的甲型流感病毒和腺病毒的定量检测方法，其特征在于，采用权利要求1-6任一项所述的定量检测试剂盒进行检测，包括如下步骤：
将量子点微球标记的甲型流感病毒抗体采用复溶液A溶解，将量子点微球标记的腺病毒抗体采用复溶液B溶解，然后分别与待测样本混合孵育，再将孵育后的待测样本滴加所述检测试纸检测，根据信号强度计算待测样本中甲型流感病毒和腺病毒的含量。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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