CN108445210A - 联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒及其制备方法，该联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒包括盒体以及设置在所述盒体中的试纸条；所述试纸条包括底板、以及依次设置在所述底板上的样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸；所述标记垫上设有由量子点标记形成的寨卡病毒重组蛋白量子点标记物和羊抗鸡抗体量子点标记物；所述包被膜包括依次设置在所述底板上的检测区T和质控区C；所述检测区包括含有鼠抗人IgM抗体的第一检测区T1、以及含有鼠抗人IgG抗体第二检测区T2；所述质控区设有鸡IgY抗体。本发明联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒能够快速检测样本中是否存在人寨卡病毒IgM和IgG抗体，操作简便，且对操作人员以及环境要求低。

Description

联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及试剂盒，更具体地说，涉及一种联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒及其制备方法。
背景技术
寨卡病毒(Zika Virμs)属于黄病毒科(Flaviviridae)、黄病毒属(Flavivirμsgenμs)，是一种主要由伊蚊传播的虫媒病毒。该病毒于1947年在乌干达首次发现，此后多年持续发现散在病例或发生小规模疫情。但自2015年以来，由寨卡病毒引起的人类感染不断发生，美洲、西太平洋、非洲及亚洲已累计有32个国家和地区报告寨卡病毒在本地传播。
寨卡病毒的潜伏期目前尚不清楚，有资料显示为3-12天，人感染寨卡病毒后，仅20％出现症状，且症状较轻。小儿感染可能出现神经系统、眼部和听力等改变。孕妇感染寨卡病毒可能导致新生儿小头畸形甚至胎儿死亡。
目前，细胞培养检测寨卡病毒是实验室的金标准，耗时长且要求较高。寨卡病毒主要是通过实时定量PCR的方法，对血液和尿液进行病毒核酸的检测。但目前该方法检测成本较高，耗时较长且对检测人员有一定的资质要求。很难应用于大规模人群快速筛查和既往感染史的调查研究，因此，非常有必要研发基于血清学的快速检测系列试剂，解决目前实际应用中的瓶颈。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，提供一种能够解决检测人寨卡病毒成本高、耗时长、无法应用于大规模人群快速筛查和既往感染史的调查研究等弊端的试剂盒及其制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：构造一种联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒，包括盒体以及设置在所述盒体中的试纸条；所述试纸条包括底板、以及依次设置在所述底板上的样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸；
所述标记垫上设有由量子点标记形成的寨卡病毒重组蛋白量子点标记物和羊抗鸡抗体量子点标记物；
所述包被膜包括依次设置在所述底板上的检测区T和质控区C；
所述检测区T包括含有鼠抗人IgM抗体的第一检测区T1、以及含有鼠抗人IgG抗体第二检测区T2；
所述质控区C设有鸡IgY抗体。
优选地，所述寨卡病毒重组蛋白量子点标记物的浓度为0.5～2mg/ml，在所述标记垫上的用量为0.2～1.5μg/cm2，所述羊抗鸡抗体量子点标记物浓度为0.5～2mg/ml，在所述标记垫上的用量为0.2～1.5μg/cm2。
优选地，所述样品垫通过样品垫处理液处理；
所述样品垫处理液包括以下原料：5％海藻糖、1％聚乙烯吡咯烷酮、1％酪蛋白钠盐、1％吐温溶解于0.002M及pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
优选地，所述鼠抗人IgM抗体的浓度为0.5～2.0mg/ml；在所述第一检测区T1上的用量为25μl/27-30cm；所述鼠抗人IgG抗体的浓度为0.5～2.0mg/ml；在所述第二检测区T2上的用量为25μl/27-30cm。
优选地，所述鸡IgY抗体的浓度为0.5～2.0mg/ml；用量为25μl/27-30cm。
优选地，所述量子点的发射波长为525nm～610nm。
优选地，所述盒体上设有盖板，所述盖板上设有加样孔以及观察窗。
本发明还构造一种联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备量子点；
S2、制备样品垫：将基材裁剪成条状，并用样品垫处理液喷涂到基材上，喷涂后进行烘烤，并置于干燥环境下储存备用；
S3、量子点的清洗与活化：将硼酸溶液加入步骤S1制备的所述量子点中进行重悬，进行超声处理，加入碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温下旋转混匀后离心10～30min，去除上清液后用硼酸溶液溶解，重复清洗一次后超声重悬备用；
S4、量子点标记寨卡病毒重组蛋白和羊抗鸡抗体：向所述步骤S3中清洗活化后的量子点中分别逐滴加入寨卡病毒重组蛋白和羊抗鸡抗体后混合并通过离心清洗，重悬制得寨卡病毒重组蛋白量子点标记物和羊抗鸡抗体量子点标记物；
S5、制备包被膜：用PBS溶液调节鼠抗人IgM抗体、鼠抗人IgG抗体和鸡IgY抗体浓度，并将其在第一检测区T1、第二检测区T2和质控区C上划膜；烘干备用；
S6、试剂盒的组装：在底板上依次粘贴样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸，并将其相互搭接得到试纸条并置于盒体中。
优选地，所述S1包括以下步骤：将硒粉和硼氢化钠加到密闭容器中，加入去离子水混合均匀，并置于冰浴条件下反应，取反应所得的上清液放于棕色试剂瓶冷藏保存；将CdCl2·2.5h2O置于烧瓶中，加入去离子水，搅拌溶解后加入巯基丙酸，采用氢氧化钾调节pH值至7.8，向烧瓶通入氮气后迅速加入所述上清液，并采用氮气维持；将所述烧瓶置于高压反应釜中持续反应，制得量子点溶液，去除上清液得到量子点。
优选地，所述S4步骤包括：向所述步骤S3中清洗活化后的量子点中分别逐滴加入寨卡病毒重组蛋白和羊抗鸡抗体，室温混合均匀后置于旋转混匀并反应2～3h，进行离心清洗得到寨卡病毒重组蛋白标记物沉淀和羊抗鸡抗体标记物沉淀，采用甘氨酸溶液超声重悬；重悬后室温旋转反应1～2h后进行离心清洗，并用含0.5％～2％BSA的硼酸溶液重悬。
实施本发明的联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒及其制备方法，具有以下有益效果：本发明所述的联合检测人寨卡病毒IgM抗体和IgG抗体的试剂盒的检测原理为抗原抗体夹心法，利用不同激发光的量子点上的羧基、醛基、羟甲基等基团共价偶联到寨卡病毒重组蛋白上，样本经过样品垫前处理后流经标记垫时，样本中的人抗寨卡病毒IgM抗体和IgG抗体与标记垫上的量子点标记的寨卡病毒重组蛋白结合，在层析作用下移动至检测区，被第一检测区的鼠抗人IgM抗体和第二检测区的鼠抗人IgG抗体捕获形成量子点-抗原-抗体-抗抗体复合物并聚集在检测区域，当量子点球受到紫外光源照射时会形成较强的量子点可见荧光，从而可检测样本中是否存在人寨卡病毒IgM和IgG抗体。
本发明将量子点标记技术应用于人寨卡病毒IgM抗体和IgG抗体的检测，相对于免疫胶体金和ELISA等具有更灵敏、更稳定的优点。本发明可联合检测人寨卡病毒IgM和IgG抗体，检测时间10min，较常规的ELISA相比，具有操作简便，时间短，一次检测可检测两个结果的优势，且对操作人员及环境要求较低。本发明与传统胶体金检测试剂相比，量子点具有更稳定的特点，且具有较强激发光，大大提高了检测试剂的灵敏度，优于胶体金检测。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是本发明联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒的结构示意图；
图2是本发明联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒的制备方法的工艺流程图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图详细说明本发明的具体实施方式。
图1示出了本发明联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒的一个优选实施例。
采用本发明的联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒能够快速检测样本中是否存在人寨卡病毒IgM和IgG抗体，操作简便，一次检测可检测两个结果，且对操作人员以及环境要求低，能应用于大规模人群快速筛查和既往感染史的调查研究；本发明与传统胶体金检测试剂相比，量子点具有更稳定的特点，且具有较强发射光，大大提高了检测试剂的灵敏度，优于胶体金检测。
如图1所示，该联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒，包括盒体11以及设置在所述盒体11中的试纸条12；该盒体11可用于保护以及安装该试纸条12，该试纸条12包括底板121、以及依次设置在该底板121上的样品垫122、标记垫123、包被膜、吸水纸125；可用于检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体。
该盒体11可采用塑料板、金属板材、纸板、木板等制成；该盒体11上设有盖板111，该盖板111与该盒体11可以为可拆卸连接，以便于更换试纸条12；该盖板111上设有加样孔113以及观察窗112，该加样孔113与该样品垫122相对设置，以便于进行加样，该观察窗112与该包被膜相对设置以便于观察。
该样品垫122可以为玻璃纤维材料，其经过样品处理液处理后再进行烘干处理后切片制成。其中样品处理液可以包括以下原料：5％海藻糖、1％聚乙烯吡咯烷酮、1％酪蛋白钠盐、1％吐温溶解于0.002M及pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
该标记垫123可以为奥斯龙8964玻璃纤维材料；该标记垫123上设有由量子点标记形成的寨卡病毒重组蛋白量子点标记物和羊抗鸡抗体量子点标记物，优选地，该量子点的发射波长为525nm～610nm；该寨卡病毒重组蛋白量子点标记物的浓度为0.5～2mg/ml，在该标记垫上的用量为0.2～1.5μg/cm2；该羊抗鸡抗体量子点标记物浓度为0.5～2mg/ml，在该标记垫上的用量为0.2～1.5μg/cm2。
该量子点具有以下优势：相比于胶体金颗粒，该量子点具有较宽的连续激发光谱，使用紫外照射既可发射出较强的量子点可见荧光，本材料表面含有-COOH基团，可与生物材料共价偶联，较胶体金物理吸附更稳定。相比于有机荧光染料，该量子点具有抗酸碱、有机溶剂、抗漂白、高温等因素干扰的化学性能稳定性优势，且该量子点的发光效率为有机荧光的几十倍。
该包被膜为硝酸纤维素膜，其包括依次设置在该底板121上的检测区T124和质控区C 125；该检测区124包括含有鼠抗人IgM抗体的第一检测区T1 1241、含有鼠抗人IgG抗体第二检测区T2 1242；优选地，该鼠抗人IgM抗体的浓度为0.5～2.0mg/ml，其在该第一检测区T1 1241的用量为25μl/27-30cm；该鼠抗人IgG抗体的浓度为0.5～2.0mg/ml，其在第二检测区T2 1242的用量为25μl/27-30cm；该质控区125上设有鸡IgY抗体，优选地，该鸡IgY抗体的浓度为0.5～2.0mg/ml；在质控区C的用量为25μl/27-30cm。
该联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒的检测原理为：若所检测的样本中存在IgG和IgM抗体，当该样品从样品垫122流经标记垫123时,形成量子点-抗原-抗体复合物，再流经检测区124，被鼠抗人IgM抗体和鼠抗人IgG抗体捕获形成量子点-抗原-抗体-抗抗体复合物并聚集在检测区T124，采用紫外光源照射时，该复合物会形成较强的量子点可见荧光，在该检测区124和该质控区125可以见到荧光，从而可检测样本中存在人寨卡病毒IgM和IgG抗体。若该所检测的样本中不存在IgG和IgM抗体时，当该样品从样品垫122流经标记垫123,流经检测区T124，该检测区124中的鼠抗人IgM抗体以及鼠抗人IgG抗体无法与标记垫中寨卡病毒重组蛋白量子点标记物形成量子点-抗原-抗体-抗抗体复合物，则采用光源照射时，无法看到荧光现象发生，当流经该质控区C125时，该鸡IgY抗体捕获该标记垫上的羊抗鸡抗体量子点标记物形成量子点-抗原-抗抗体的复合物，并聚集在质控区C125，采用紫外光源照射时，该复合物会形成较强的量子点可见荧光。因此通过观察该检测区T124可得到样本中是否存在人寨卡病毒IgM和IgG抗体。
图2示出了本发明联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒的制备方法的一个优选实施例。
如图2所示，该联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备量子点。
具体地，将硒粉和硼氢化钠加到密闭容器中，加入去离子水混合均匀，并置于冰浴条件下反应，取反应所得的上清液放于棕色试剂瓶冷藏保存；将CdCl2·2.5h2O置于烧瓶中，加入去离子水，搅拌溶解后加入巯基丙酸，采用氢氧化钾调节pH值至7.8，向烧瓶通入氮气后迅速加入所述上清液，并采用氮气维持；将所述烧瓶置于高压反应釜中持续反应，制得含有水溶性羧基，且浓度为8μM的量子点溶液，将制得的量子点溶液置于离心管中，并置于低温超速离心机以40000～50000×g的转速离心10～30min后静置，去除该上清液得到量子点，该量子点的发射波长为610nm。
S2、制备样品垫：将基材裁剪成条状，并用样品垫处理液喷涂到基材上，喷涂后进行烘烤，并置于干燥环境下储存备用。
具体地，将5％海藻糖、1％聚乙烯吡咯烷酮、1％酪蛋白钠盐、1％吐温溶解于0.002M及pH值为7.4的磷酸盐缓冲液混合制得样品垫处理液，将基材裁剪成条状，并将该样品垫处理液以4μl/cm，压力0.04MPa喷涂到基材上，喷涂两条，间距5-7mm，间距优选为7mm，喷涂后在40～50℃的条件下进行热烘烤，并储存与干燥环境备用，在烘干后的基材上喷涂喷涂0.5～1.5mg/ml的鼠IgG，以消除样本中的人抗鼠IgG，防止其对T、C区域测试的影响。优选地，该基材可以为玻璃纤维，且其可以裁剪成30cm*1.6cm的大小的条状。
S3、量子点的清洗与活化：将硼酸溶液加入步骤S1制备的所述量子点进行重悬，进行超声处理，加入碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温下旋转混匀后离心10～30min，去除上清液后用硼酸溶液重悬，重复清洗一次后超声重悬备用。
具体地，加入用5～20mM pH值7.0～7.5的硼酸溶液至沉淀物中，进行重悬，并以100～300W的超声波处理20～50s，得到终浓度为1μM的量子点溶液，再加入50～100μl的10～50mg/ml碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺在室温下混匀15～30min后以40000～50000×g的转速离心10～30min，去除上清液后用5～20mM pH值7.0～8.5的硼酸溶液重悬，重复清洗一次后超声重悬备用。
S4、量子点标记寨卡病毒重组蛋白和羊抗鸡抗体：向所述步骤S3中清洗活化后的量子点中分别逐滴加入寨卡病毒重组蛋白和羊抗鸡抗体后混合并通过离心清洗，重悬制得寨卡病毒重组蛋白量子点标记物和羊抗鸡抗体量子点标记物。
具体地，向所述步骤S3中清洗活化后的量子点中逐滴加入寨卡病毒重组蛋白，混合均匀后在室温条件下旋转，并反应2～3h；以40000～50000×g的转速进行离心，清洗1～2次，去除上清液，用5％～10％的甘氨酸溶液对所得到的沉淀进行超声重悬，将重悬后的沉淀在室温条件下，旋转并反应1～2h后以40000～50000×g转速离心清洗1～2次，用0.5％～2％BSA的1～20mM硼酸溶液重悬，得到最终浓度为0.5～2.0mg/ml的寨卡病毒重组蛋白量子点标记物。
向所述步骤S3中清洗活化后的量子点中逐滴加入羊抗鸡抗体，混合均匀后在室温条件下旋转，并反应2～3h；以40000～50000×g的转速进行离心，清洗1～2次，去除上清液，用5％～10％的甘氨酸溶液对所得到的沉淀进行超声重悬，将重悬后的沉淀在室温条件下，旋转并反应1～2h后以40000～50000×g转速离心清洗1～2次，用0.5％～2％BSA的1～20mM硼酸溶液重悬，得到最终浓度为0.5～2.0mg/ml的羊抗鸡抗体量子点标记物。
将所制得的最终浓度为0.5～2.0mg/ml的寨卡病毒重组蛋白量子点标记物用标记垫稀释液按照1:1～1:10的稀释比例稀释；将所制得的最终浓度为0.5～2.0mg/ml羊抗鸡抗体量子点标记物用标记垫稀释液按照1:100～1:200的稀释比例稀释，并分别以0.2～1.5μg/cm2的用量喷涂在标记垫上，热烘干24h后置于湿度<30％的环境中储存备用。优选地，标记垫为奥斯龙8964玻璃纤维材料，其可以裁剪为长30cm，宽12mm，该标记垫稀释液可以包括以下原料：15％海藻糖，2％BSA，0.5％PEG-20000，2％Tween溶解于0.002M硼酸(pH值8.0)缓冲液。
S5、制备包被膜：用PBS溶液调节鼠抗人IgM抗体、鼠抗人IgG抗体和鸡IgY抗体浓度，并将其在第一检测区T1、第二检测区T2和质控区C上划膜；烘干备用。
具体地，分别将鼠抗人IgM抗体、鼠抗人IgG抗体和鸡IgY抗体用1～10mM的PBS溶液调节浓度至0.5～2.0mg/ml，以25μl/27-30cm的包被液量在第一检测区T1、第二检测区T2和质控区C划膜，其间间隔5-8mm,在湿度<20％、温度45～50℃的环境中热烘干36～48h后置于湿度<30％的室温下备用。
S6、试剂盒的组装：在底板上依次粘贴样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸，并将其相互搭接得到试纸条并置于盒体中。
具体地，在底板上依次粘贴样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸，并将其相互搭接，各组分之间相重叠的部分为2～3mm，并按产品要求切割成合适宽度的试纸条，将试纸条放置于盒体中，并盖上盖板，使得加样孔正对样品垫，观察窗正对包被膜。
结合以下具体实施例来详细说明本发明：
实施例1、一种联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备量子点：
分别称取880mg Se粉和450mgNaBH4置于密闭容器中，加入10ml去离子水混合均匀，冰浴条件下反应20小时，反应完成后取所得上清液，放入棕色试剂瓶4℃冷藏保存。
称取400mg CDCl2·2.5h2O置于250ml三颈烧瓶中，加入100ml去离子水，搅拌溶解后加入0.35ml巯基丙酸，1M氢氧化钾调节pH值至7.8，向三颈瓶通入氮气后迅速加入1.2ml的上一步骤保存的上清液，维持氮气15min。
将烧瓶置于高压反应釜，调节反应温度至140℃，持续反应3.5小时后设置退火时间45min，反应结束后所得量子点溶液置于玻璃试剂瓶保存备用。
将制得的量子点溶液置于离心管并置于低温超速离心机中，以40000×g的转速离心20min后静置，去除该上清液得到量子点，所制得的量子点的发射波长为610nm。
S2、制备样品垫：
将5％海藻糖、1％聚乙烯吡咯烷酮、1％酪蛋白钠盐、1％吐温溶解于0.002M及pH值为7.4的磷酸盐缓冲液混匀制备样品垫处理液，将玻璃纤维裁切成30cm×16mm的条状，用样品垫处理液喷涂，喷涂后后置于湿度<20％，温度45℃的环境中烘干，烘干后上面喷涂0.5mg/ml的鼠IgG，喷涂量为10μg/cm2。
S3、量子点的清洗与活化：
将步骤S1制得的量子点置于离心管中，加入5mM pH值7.5的硼酸溶液重悬，置于超声波处理器中以100W处理50s，得到终浓度为1μM的量子点溶液，加入50μl的50mg/ml碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，置于旋转混匀仪，室温混匀15min后置于低温超速离心机中以40000×g的转速离心30min，去除上清后用5mM pH值8.5的硼酸溶液重悬，重复清洗一次后超声重悬备用。
S4、量子点标记寨卡病毒重组蛋白和羊抗鸡抗体：
向所述步骤S3中清洗活化后的量子点中逐滴加入寨卡病毒重组蛋白，混合均匀后置于旋转混匀仪并在室温条件下混匀反应3h后；置于低温超速离心机中以40000×g的转速进行离心，清洗2次，去除上清液，用5％的甘氨酸溶液对所得到的沉淀进行超声重悬，将重悬后的沉淀在室温条件下，置于旋转混匀仪旋转并反应2h后置于低温超速离心机中以40000×g转速离心清洗2次，用0.5％BSA的20mM硼酸溶液重悬，得到最终浓度为0.5mg/ml的寨卡病毒重组蛋白量子点标记物。
向所述步骤S3中清洗活化后的量子点中逐滴加入羊抗鸡抗体，混合均匀后在室温条件下旋转，并反应3h；置于低温超速离心机中以40000×g的转速进行离心，清洗2次，去除上清液，用5％的甘氨酸溶液对所得到的沉淀进行超声重悬，将重悬后的沉淀在室温条件下，置于旋转混匀仪旋转并反应2h后置于低温超速离心机中以40000×g转速离心清洗2次，用0.5％BSA的20mM硼酸溶液重悬，得到最终浓度为0.5mg/ml的羊抗鸡抗体量子点标记物。
将15％海藻糖，2％BSA，0.5％PEG-20000，2％Tween溶解于0.002M硼酸(pH值8.0)缓冲液混合制备标记垫稀释液，并将奥斯龙8964玻璃纤维材料裁剪为长30cm，宽12mm制得标记垫，将所制得的最终浓度为0.5mg/ml的寨卡病毒重组蛋白量子点标记物用标记垫稀释液按照1:1的稀释比例稀释；将所制得的最终浓度为0.5mg/ml羊抗鸡抗体量子点标记物用标记垫稀释液按照按照1:100稀释比例稀释，并分别以1.5μg/cm2的用量喷涂在标记垫上，热烘24h后置于湿度<30％的环境中储存备用。
S5、制备包被膜：
分别将鼠抗人IgM抗体、鼠抗人IgG抗体和鸡IgY抗体用1mM的PBS溶液调节浓度至0.5mg/ml，以25μl/27-30cm的包被液量在第一检测区T1、第二检测区T2和质控区C划膜，其间间隔5mm,在湿度<20％、温度45℃的环境中热烘干36h后置于湿度<30％的室温下备用。
S6、试剂盒的组装：
在底板上依次粘贴样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸，并将其相互搭接，各组分之间的相重叠的部分为2mm，并按产品要求切割成合适宽度为4mm的试纸条，将试纸条放置于盒体中，并盖上盖板，使得加样孔正对样品垫，观察窗正对包被膜。
实施例2、一种联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备量子点：
分别称取880mg Se粉和450mgNaBH4到密闭容器中，加入10ml去离子水混合均匀，冰浴条件下反应20小时，反应完成后取所得上清液，放入棕色试剂瓶4℃冷藏保存。
称取400mg CDCl2·2.5h2O于250ml三颈烧瓶中，加入100ml去离子水，搅拌溶解后加入0.35ml巯基丙酸，1M氢氧化钾调节pH值至7.8，向三颈瓶通入氮气后迅速加入1.2ml的上一步骤保存的上清液，维持氮气15min。
将烧瓶置于高压反应釜，调节反应温度至140℃，持续反应3.5小时后设置退火时间45min，反应结束后所得量子点置于玻璃试剂瓶保存备用。
将制得的量子点溶液置于离心管中并置于低温超速离心机中，以45000×g的转速离心20min后静置，去除该上清液得到量子点，所制得的量子点发射波长为610nm。
S2、制备样品垫：
将5％海藻糖、1％聚乙烯吡咯烷酮、1％酪蛋白钠盐、1％吐温溶解于0.002M及pH值为7.4的磷酸盐缓冲液混匀制备样品垫处理液，将玻璃纤维裁切成30cm×16mm的条状，用样品垫处理液喷涂，喷涂后后置于湿度<20％，温度47.5℃的环境中烘干，烘干后上面喷涂1mg/ml的鼠IgG，喷涂量为15μg/cm2。
S3、量子点的清洗与活化：
将步骤S1制得的量子点置于离心管中，加入12.5mM pH值7.5的硼酸溶液重悬，置于超声波处理器中以200W处理35s，得到终浓度为1μM的量子点溶液，加入75μl的30mg/ml碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，置于旋转混合仪，室温混匀15min后置于低温超速离心机中以45000×g的转速离心20min，去除上清后用12.5mM pH值7.5的硼酸溶液重悬，重复清洗一次后超声重悬备用。
S4、量子点标记寨卡病毒重组蛋白和羊抗鸡抗体：
向所述步骤S3中清洗活化后的量子点中逐滴加入寨卡病毒重组蛋白，混合均匀后置于旋转混匀仪并在室温条件下旋转，并反应2.5h；置于低温超速离心机中以45000×g的转速进行离心，清洗2次，去除上清液，用7.5％的甘氨酸溶液对所得到的沉淀进行超声重悬，将重悬后的沉淀在室温条件下，置于旋转混匀仪旋转并反应1.5h后置于低温超速离心机中以45000×g转速离心清洗2次，用1％BSA的10mM硼酸溶液重悬，得到最终浓度为1.25mg/ml的寨卡病毒重组蛋白量子点标记物。
向所述步骤S3中清洗活化后的量子点中逐滴加入羊抗鸡抗体，混合均匀后在室温条件下旋转，并反应2.5h；置于低温超速离心机中以45000×g的转速进行离心，清洗2次，去除上清液，用7.5％的甘氨酸溶液对所得到的沉淀进行超声重悬，将重悬后的沉淀在室温条件下，置于旋转混匀仪旋转并反应1.5h后置于低温超速离心机中以45000×g转速离心清洗2次，用1％BSA的10mM硼酸溶液重悬，得到最终浓度为1.25mg/ml的羊抗鸡抗体量子点标记物。
将15％海藻糖，2％BSA，0.5％PEG-20000，2％Tween溶解于0.002M硼酸(pH值8.0)缓冲液混合制备标记垫稀释液，并将奥斯龙8964玻璃纤维材料裁剪为长30cm，宽12mm制得标记垫，将所制得的最终浓度为1mg/ml的寨卡病毒重组蛋白量子点标记物用标记垫稀释液按照1:5的稀释比例稀释；将所制得的最终浓度为1mg/ml的羊抗鸡抗体量子点标记物用标记垫稀释液按照1:150的稀释比例稀释，并分别以0.85μg/cm2的用量喷涂在标记垫上，热烘24h后置于湿度<30％的环境中储存备用。
S5、制备包被膜：
分别将鼠抗人IgM抗体、鼠抗人IgG抗体和鸡IgY抗体用1mM的PBS溶液调节浓度至1.25mg/ml，以25μl/27-30cm的包被液量在第一检测区T1、第二检测区T2和质控区C划膜，其间隔6mm,在湿度<20％、温度47.5℃的环境中热烘干42h后置于湿度<30％的室温下备用。
S6、试剂盒的组装：
在底板上依次粘贴样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸，并将其相互搭接，各组分之间的相重叠的部分为2.5mm，并按产品要求切割成合适宽度为4.5mm的试纸条，将试纸条放置于盒体中，并盖上盖板，使得加样孔正对样品垫，观察窗正对包被膜。
实施例3、一种联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备量子点：
分别称取880mg Se粉和450mgNaBH4置于密闭容器中，加入10ml去离子水混合均匀，冰浴条件下反应20小时，反应完成后取所得上清液，放入棕色试剂瓶4℃冷藏保存。
称取400mg CDCl2·2.5h2O置于250ml三颈烧瓶中，加入100ml去离子水，搅拌溶解后加入0.35ml巯基丙酸，1M氢氧化钾调节pH值至7.8，向三颈瓶通入氮气后迅速加入1.2ml的上一步骤保存的上清液，维持氮气15min。
将烧瓶置于高压反应釜，调节反应温度至140℃，持续反应3.5小时后设置退火时间45min，反应结束后所得量子点置于玻璃试剂瓶保存备用。
将制得的量子点溶液置于离心管并置于低温超速离心机中，以50000×g的转速离心30min后静置，去除该上清液得到量子点，所制得的量子点发射波长为610nm。
S2、制备样品垫：
将5％海藻糖、1％聚乙烯吡咯烷酮、1％酪蛋白钠盐、1％吐温溶解于0.002M及pH值为7.4的缓冲液混匀制备样品垫处理液，将玻璃纤维裁切成30cm×16mm的条状，用样品垫处理液喷涂，喷涂后置于湿度<20％，温度50℃的环境中烘干，烘干后上面喷涂1.5mg/ml的鼠IgG，喷涂量为20μg/cm2。
S3、量子点的清洗与活化：
将步骤S1制得的量子点置于离心管中，加入20mM pH值7.0的硼酸溶液重悬，置于超声波处理器中以300W处理50s，得到终浓度为1μM的量子点，加入100μl的50mg/ml碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，置于旋转混匀仪，室温混匀15min后，置于低温超速离心机中以50000×g的转速离心30min，去除上清后用20mM pH值7.0的硼酸溶液重悬，重复清洗一次后超声重悬备用。
S4、量子点标记寨卡病毒重组蛋白和羊抗鸡抗体：
向所述步骤S3中清洗活化后的量子点中逐滴加入寨卡病毒重组蛋白，混合均匀后置于旋转混匀仪并在室温条件下旋转混匀反应2h后；置于低温超速离心机中以50000×g的转速进行离心，清洗2次，去除上清液，用10％的甘氨酸溶液对所得到的沉淀进行超声重悬，将重悬后的沉淀在室温条件下，置于旋转混匀仪旋转并反应1h后置于低温超速离心机中以50000×g转速离心清洗2次，用2％BSA的20mM硼酸溶液重悬，得到最终浓度为2mg/ml的寨卡病毒重组蛋白量子点标记物。
向所述步骤S3中清洗活化后的量子点中逐滴加入羊抗鸡抗体，混合均匀后在室温条件下旋转混匀反应2h后；置于低温超速离心机中以50000×g的转速进行离心，清洗2次，去除上清液，用2％的甘氨酸溶液对所得到的沉淀进行超声重悬，将重悬后的沉淀在室温条件下，置于旋转混匀仪旋转并反应1h后置于低温超速离心机中以45000×g转速离心清洗2次，用2％BSA的10mM硼酸溶液重悬，得到最终浓度为2mg/ml的羊抗鸡抗体量子点标记物。
将15％海藻糖，2％BSA，0.5％PEG-20000，2％Tween溶解于0.002M硼酸(pH值8.0)缓冲液混合制备标记垫稀释液，并将奥斯龙8964玻璃纤维材料裁剪为长30cm，宽12mm制得标记垫，将所制得的最终浓度为2mg/ml的寨卡病毒重组蛋白量子点标记物用标记垫稀释液按照1:10的稀释比例稀释；将所制得的最终浓度为2mg/ml羊抗鸡抗体量子点标记物用标记垫稀释液按照1:200的稀释比例稀释，并分别以1.5μg/cm2的用量喷涂在标记垫上，热烘24h后置于湿度<30％的环境中储存备用。
S5、制备包被膜：
分别将鼠抗人IgM抗体、鼠抗人IgG抗体和鸡IgY抗体用1mM的PBS溶液调节浓度至2mg/ml，以25μl/27-30cm的包被液量在第一检测区T1、第二检测区T2和质控区C划膜，其间隔6mm,在湿度<20％、温度50℃的环境中热烘干48h后置于湿度<30％的室温下备用。
S6、试剂盒的组装：
在底板上依次粘贴样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸，并将其相互搭接，各组分之间相重叠的部分为3mm，并按产品要求切割成合适宽度为5mm的试纸条，将试纸条放置于盒体中，并盖上盖板，使得加样孔正对样品垫，观察窗正对包被膜。
利用本发明的联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒对深圳疾控1例阳性样本进行不同浓度梯度的验证，验证结果如下表：
实验结果表明，本发明的试剂盒和现有金标产品相比，具有更高的灵敏度，大大提高的样本的检出效率。
本发明中所制备的量子点，相比有机荧光染料，具有更高的发光效率，是一般荧光的几十倍，且本材料几乎不受温度、溶剂、pH等因素影响。
本发明中所制备的量子点具有较宽的激发光谱和窄而对称的发射光谱，激发光谱覆盖紫外到红外区，常规紫外电筒即激发，对仪器设备要求低。
本发明中所述试剂盒，相比于现有PCR检测方法学，具有更灵活便捷、快速的特点，不受操作地点的限制，对检测人员的技术要求低，更适用于区域性疫情的监控研究。
本发明中所述的试剂盒，只需少量样本，10min内即可显示结果，操作中只需配置常规紫外电筒既可，不受操作地点限制，相对于常规ELISA检测试剂盒具有快速便捷的优势。
本发明的试剂盒与现有市场上金标检测人寨卡病毒IgG/IgM试纸条相比，具有更灵敏，更稳定的优势，对疫情的监控和寨卡病毒的研究更有意义。
本发明将首次将量子点标记技术应用与人寨卡病毒IgM和IgG抗体检测，量子点技术对于胶体金具有更灵敏，更稳定的的优势。
可以理解的，以上实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，可以对上述技术特点进行自由组合，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围；因此，凡跟本发明权利要求范围所做的等同变换与修饰，均应属于本发明权利要求的涵盖范围。

Claims (10)

1.一种联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒，包括盒体以及设置在所述盒体中的试纸条；其特征在于，所述试纸条包括底板、以及依次设置在所述底板上的样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸；
所述标记垫上设有由量子点标记形成的寨卡病毒重组蛋白量子点标记物和羊抗鸡抗体量子点标记物；
所述包被膜包括依次设置在所述底板上的检测区T和质控区C；
所述检测区T包括含有鼠抗人IgM抗体的第一检测区T1、以及含有鼠抗人IgG抗体的第二检测区T2；
所述质控区C设有鸡IgY抗体。
2.根据权利要求1所述的联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒，其特征在于，所述寨卡病毒重组蛋白量子点标记物的浓度为0.5～2mg/ml，在所述标记垫上的用量为0.2～1.5μg/cm2，所述羊抗鸡抗体量子点标记物浓度为0.5～2mg/ml，在所述标记垫上的用量为0.2～1.5μg/cm2。
3.根据权利要求1所述的联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒，其特征在于，所述样品垫通过样品垫处理液处理；
所述样品垫处理液包括以下原料：5％海藻糖、1％聚乙烯吡咯烷酮、1％酪蛋白钠盐、1％吐温溶解于0.002M及pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒，其特征在于，所述鼠抗人IgM抗体的浓度为0.5～2.0mg/ml；在所述第一检测区T1上的用量为25μl/27-30cm；所述鼠抗人IgG抗体的浓度为0.5～2.0mg/ml；在所述第二检测区T2上的用量为25μl/27-30cm。
5.根据权利要求1所述的联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒，其特征在于，所述鸡IgY抗体的浓度为0.5～2.0mg/ml；用量为25μl/27-30cm。
6.根据权利要求1所述的联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒，其特征在于，所述量子点的发射波长为525nm～610nm。
7.根据权利要求1所述的联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒，其特征在于，所述盒体上设有盖板，所述盖板上设有加样孔以及观察窗。
8.一种联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备量子点；
S2、制备样品垫：将基材裁剪成条状，并用样品垫处理液喷涂到基材上，喷涂后进行烘烤，并置于干燥环境下储存备用；
S3、量子点的清洗与活化：将硼酸溶液加入步骤S1制备的所述量子点进行重悬，进行超声处理，加入碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温下旋转混匀后离心10～30min，去除上清液后用硼酸溶液溶解，重复清洗一次后超声重悬备用；
S4、量子点标记寨卡病毒重组蛋白和羊抗鸡抗体：向所述步骤S3中清洗活化后的量子点中分别逐滴加入寨卡病毒重组蛋白和羊抗鸡抗体后混匀并通过离心清洗，重悬制得寨卡病毒重组蛋白量子点标记物和羊抗鸡抗体量子点标记物；
S5、制备包被膜：用PBS溶液调节鼠抗人IgM抗体、鼠抗人IgG抗体和鸡IgY抗体浓度，并将其在第一检测区T1、第二检测区T2和质控区C上划膜；烘干备用；
S6、试剂盒的组装：在底板上依次粘贴样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸，并将其相互搭接得到试纸条并置于盒体中。
9.根据权利要求8所述的联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述S1包括以下步骤：将硒粉和硼氢化钠加到密闭容器中，加入去离子水混合均匀，并置于冰浴条件下反应，取反应所得的上清液放于棕色试剂瓶冷藏保存；将CdCl2·2.5h2O置于烧瓶中，加入去离子水，搅拌溶解后加入巯基丙酸，采用氢氧化钾调节pH值至7.8，向烧瓶通入氮气后迅速加入所述上清液，并采用氮气维持；将所述烧瓶置于高压反应釜中持续反应，制得量子点溶液，去除上清液得到量子点。
10.根据权利要求8所述的联合检测人寨卡病毒IgG和IgM抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述S4步骤包括：向所述步骤S3中清洗活化后的量子点分别逐滴加入寨卡病毒重组蛋白和羊抗鸡抗体，室温混合均匀后置于旋转混匀并反应2～3h，进行离心清洗得到寨卡病毒重组蛋白标记物沉淀和羊抗鸡抗体标记物沉淀，采用甘氨酸溶液超声重悬；重悬后室温旋转反应1～2h后进行离心清洗，并用含0.5％～2％BSA的硼酸溶液重悬。
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