CN105548538B - 柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置及制法 - Google Patents

柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置及制法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置及制法，属于医疗检测设备领域。粘贴在塑料板上的硝酸纤维素膜分别与吸收垫、免疫胶体金玻璃纤维膜搭接，免疫胶体金玻璃纤维膜另一端与样品垫搭接；硝酸纤维素膜上设置固相有纯化的高特异CA16抗原的第一检测线、固相有纯化的高特异性EV71抗原的第二检测线、喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控线上，采用多聚赖氨酸处理液对硝酸纤维素膜进行预处理，将CA16抗原与EV71抗原先与二氧化硅纳米颗粒结合再吸附到硝酸纤维素膜上，以及配制合适的喷金缓冲液和样品垫处理液。有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本，检测试纸灵敏度高、特异性强、操作简便省时、实用性强。

Description

柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置及制法
技术领域
本发明涉及医疗检测设备领域，特别涉及一种柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置及制法，可实现柯萨奇病毒A16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71)IgM抗体的灵敏、特异、快速检测。
背景技术
手足口病(HFMD)是一种以手足皮肤和口腔黏膜疱疹为主要症状的小儿急性传染病。本病在国外1957年已有报道，1981年中国上海首次报告了手足口病疫情。近年来，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势，引发HFMD的肠道病毒有20多种(型)，其中柯萨奇病毒A16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71)最为常见。通常情况下，CA16感染引起的HFMD在临床症状等方面与EV71感染所引起的HFMD难以区别。不同的是CA16感染所致的患者可引发心肌炎、心包炎等并发症，而EV71感染容易引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎及由此引发急性弛缓性瘫痪、肺水肿和出血等严重并发症，死亡率较高。由于患者为婴幼儿，病情发展快，所以更需要早期、及时诊断疾病。疾病的早期和及时诊断，可以准确鉴别两种病毒，并对疾病的诊疗和预后判断有重要的临床意义，因此建立HFMD快速分型检测方法尤为重要。
手足口病的临床诊断主要依据三个方面：一是临床表现，二是血清学证据，三是病原学证据，其中血清学检测和病原学检测是目前最主要的依据。病原学检测方法中，病毒分离是最早用于CA16和EV71病毒的检测诊断的方法,这种方法具有较高的特异性,但由于技术操作难度大、周期长，不适合临床使用。RT-PCR技术用于检测病毒RNA，具有快速、简便的优点，而且还有很高的灵敏度和特异性。但其灵敏度一方面依赖于患者携带的病毒与所用引物的匹配性，另一方面也受到扩增片断的高级结构的很大影响。另外，RT-PCR本身对于操作环境及操作人员的要求较高，并且价格昂贵，因此难以在广大基层单位中使用。目前市场上仅少数单位具备RT-PCR能力，且难以找到通用引物，目前所用引物具基因型特异性。HFMD血清学检测可采用酶联免疫吸附实验，检测CA16和EV71病毒IgM临床意义较大，主要用于对早期感染的诊断，可作为临床检测和的初筛指标。CA16和EV71病毒IgM抗体联合检测对初步鉴别诊断早期患者有重要意义。
胶体金免疫层析技术(gold immunochromatography assay，GICA)是一种将胶体金标记技术和蛋白质层析技术结合的以微孔滤膜为载体的固相膜免疫分析技术。胶体金免疫层析技术是一种常用的免疫层析检测方法，由于其操作简单、省时、制造成本较低、结果易判读等特点，非常适合于现场检测，广泛用于生物、医药、食品等领域。由于胶体金免疫层析技术是一步完成检测，因此检测过程的干扰因素较多，其灵敏度低是限制胶体金免疫层析应用范围的主要因素，传统的胶体金免疫层析技术的检测限高于ELISA等方法。
在胶体金免疫层析检测中，蛋白质固着于硝酸纤维素膜(NC膜)作为待测样本的捕获试剂。由于检测结果完全取决于捕获试剂在膜上达到良好的吸附效果，因此蛋白质在膜上均一、良好的吸附对胶体金检测结果非常重要。如果NC膜上结合的蛋白量不足或者蛋白结合力不够强，就会出现相当多的问题，在检测结果的检测线上非常明显。如果膜上结合的蛋白量太低，那么在结果中检测线显色较弱而且检测灵敏度降低。如果蛋白不能牢固的吸附于NC膜，那么在蛋白吸附于NC膜以前发生扩散，从而导致检测线较宽、显色较弱而不是鲜艳而清晰，使检测结果难以解释。在极端条件下，如果蛋白与NC膜的物理吸附作用太弱，流过的蛋白检测物和表面活性剂溶液可能将固着的蛋白从NC膜上洗掉，从而显示较宽或者根本不清晰的检测线，难以解释检测结果。
发明内容
本发明提供一种柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置及制法，以解决现有技术存在的NC膜吸附蛋白量不足、结合力不强的问题。
本发明采取的技术方案是：
柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置，样品垫1、免疫胶体金玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5上，所述硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫胶体金玻璃纤维膜2搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接；所述硝酸纤维素膜3上设置第一检测线T1、第二检测线T2和质控线C，当所述的第一检测线T1上固相有纯化的高特异柯萨奇病毒A16抗原时，所述的第二检测线T2上固相有纯化的高特异性肠道病毒71型抗原，所述的质控线C上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体；当所述的第一检测线T1固相有纯化的高特异性肠道病毒71型抗原时，所述的第二检测线T2上则固相有纯化的高特异性柯萨奇病毒A16抗原；所述的质控线C上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体。
所述的第一检测线T1距离硝酸纤维素膜3的上缘3～12mm。
所述的第二检测线T2距离硝酸纤维素膜3的上缘5～15mm。
所述的质控线C距离硝酸纤维素膜3的上缘10～18mm。
本发明提供一种柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置的制备方法，包括如下步骤：
(a)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
(b)采用步骤(a)中制得的胶体金标记鼠抗人IgM抗体获得免疫胶体金；
(c)采用喷金缓冲液稀释步骤(b)的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金玻璃纤维膜；
(d)将硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液预处理后，喷点与二氧化硅纳米颗粒结合柯萨奇病毒A16型抗原和肠道病毒71型抗原，在质控线上喷点羊抗鼠IgG，制得免疫硝酸纤维素膜；
(e)将预处理的样品垫、步骤(c)制备的免疫胶体金玻璃纤维膜、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在塑料板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
本发明步骤(a)所述的采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金颗粒粒径为20～60nm。
本发明步骤(c)所述的喷金缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5～20％，海藻糖浓度为1～5％，BSA浓度为0.5～1％。
本发明步骤(d)所述的将硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液预处理是：用多聚赖氨酸处理液浸泡硝酸纤维素膜1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
本发明步骤(d)所述的二氧化硅纳米颗粒分别结合柯萨奇病毒A16和肠道病毒71是：以二氧化硅作为载体，分别取1mL柯萨奇病毒A16和肠道病毒71抗原溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，9000rpm和7500rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍。
本发明步骤(e)所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂吐温-80组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％，酪蛋白浓度为0.1～0.2％、表面活性剂浓度为0.5～1％。
本发明步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸稀释到浓度为0.5％组成，经0.22μm滤膜过滤，其中多聚赖氨酸，SIGMA,150KD～300KD，备用。
本发明步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为8％，经0.22μm滤膜过滤，其中多聚赖氨酸，SIGMA,150KD～300KD，备用。
本发明步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为8％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，其中多聚赖氨酸，SIGMA,150KD～300KD，备用。
本发明步骤(d)所述的二氧化硅纳米颗粒制备方法：将2.48mL体积分数25的氨水和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35C左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴人3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声3分钟，即可制得粒径120nm均一的粒子，分别以12000rpm，9000rpm和7500rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散，反复多次洗涤至近中性，最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用。
本发明制备的柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合快速检测装置可同时检测患者体内是否感染柯萨奇病毒A16和肠道病毒71病毒，为临床手足口病的感染诊断具有重要意义疗。
本发明由固相有纯化的高特异性柯萨奇病毒A16和肠道病毒71抗原(检测线T1、T2)和抗鼠IgG抗体(质控线)的硝酸纤维素膜、吸附有鼠抗人IgM抗体的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料粘贴制成。本发明可同时检测患者体内是否感染柯萨奇病毒A16和肠道病毒71病毒，具有特异、快速、灵敏的特点。采用多聚赖氨酸对硝酸纤维素膜进行预处理，将柯萨奇病毒A16和肠道病毒71抗原先与二氧化硅纳米颗粒结合再吸附到硝酸纤维素膜上，以及配制合适的喷金缓冲液和样品垫处理液，在保证免疫胶体金释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本。
多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine,PLL)的结构中含有多个氨基可供偶联,活化过程简单，方便NC膜表面固定蛋白。多聚赖氨酸带有大量的正电荷，可以显著增加NC膜上活性位点的正电荷数量，而抗体在常规包被条件下是带负电荷的，这样单位面积的NC膜上可以结合更多数量的抗体，这可以显著增加抗体的包被效率。常规条件下，单位面积的NC膜上结合抗体的数量是有限的，采用多聚赖氨酸处理之后，可以让单位面积的NC膜上结合抗体数量增加，进而可以实现更高的检测灵敏度。研究发现甲醇具有良好的重润湿性，可以保证在预处理NC膜的时候不产生气泡以免气泡的存在导致NC膜处理局部不充分，同时也能够活化NC膜，让NC膜带正电荷，这个与聚赖氨酸相似，两者协同作用，效果更好。PEG20000可与NC膜的位点发生吸附作用，在蛋白包被后，可以吸收蛋白的结合水，导致蛋白更加疏水，这样蛋白与NC膜的结合更加牢固，通过疏水作用明显提高蛋白的包被效率。综上，多聚赖氨酸、甲醇和PEG20000组合配方，可以从电荷作用和疏水作用两方面来提高NC膜蛋白的包被效率。
在改善NC膜对蛋白吸附基础上，探讨蛋白对NC膜吸附效果也是提高胶体金灵敏度的另一途径。二氧化硅纳米颗粒具有较好的稳定性、易于制备、生物相容性较好及较低的免疫原性等优势，在生物医学领域研究较为广泛。但在胶体金免疫层析技术中尚未有报道应用。本研究探讨了二氧化硅纳米颗粒对NC膜包被抗原的影响，先将划膜用的抗原先与二氧化硅纳米颗粒结合，封闭，离心纯化，去掉未结合的抗体，然后复溶到一定比例，然后划膜，这样一个二氧化硅粒子可以结合多个抗原，从而增加了包被抗原的效率，灵敏度也会大大提高。又由于二氧化硅纳米颗粒是无色透明的，所以不会影响显色，只是借助其更大的表面积增加抗体的包被效率，提高胶体金实验的灵敏度。
为了提高胶体金免疫层析技术的灵敏度，我们通过对硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液进行了预处理，将包被NC的抗原与二氧化硅纳米颗粒结合，达到了提高试纸灵敏度的目的。
本发明的有益效果在于：1、本发明的检测装置结构简单，构思新颖，将柯萨奇病毒A16型(CA16)抗原和肠道病毒71型(EV71)抗原包被于硝酸纤维膜膜上，特异性强，既能同时检测标本中柯萨奇病毒A16型(CA16)抗原和肠道病毒71型(EV71)IgM抗体，又没有增加生产操作的复杂度。2、免疫胶体金制备步骤中，通过配合合适的喷金缓冲液和样品垫处理液，可保证免疫胶体金释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本。3、本发明的检测装置不需要任何特殊仪器设备，检测成本低。4、本发明对硝酸纤维素膜进行预处理，对包被硝酸纤维素膜的抗原进行了修饰，提高了检测试纸灵敏度、特异性。5、本发明的检测装置不需要专业人员操作，操作简便省时，灵敏度高、特异性强。实用性强。
附图说明
图1为本发明的结构示意图。
具体实施方式
参见图1所示，本发明的柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置，其结构包括样品垫(1)、免疫胶体金玻璃纤维膜(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸收垫(4)分别粘贴在塑料板(5)上，所述硝酸纤维素膜(3)的两端分别与吸收垫(4)、免疫胶体金玻璃纤维膜(2)搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜(2)的另一端与样品垫(1)搭接；所述硝酸纤维素膜(3)上设置第一检测线(T1)、第二检测线(T2)和质控线(C)，当所述的第一检测线(T1)上固相有纯化的高特异柯萨奇病毒A16抗原时，所述的第二检测线(T2)上固相有纯化的高特异性肠道病毒71型抗原，所述的质控线(C)上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体；当所述的第一检测线(T1)固相有纯化的高特异性肠道病毒71型抗原时，所述的第二检测线(T2)上则固相有纯化的高特异性柯萨奇病毒A16抗原；所述的质控线(C)上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体。
所述的第一检测线T1距离硝酸纤维素膜3的上缘3～12mm。
所述的第二检测线T2距离硝酸纤维素膜3的上缘5～15mm。
所述的质控线C距离硝酸纤维素膜3的上缘10～18mm。
本发明的柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置的制备方法，包括下列步骤：
(a)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
(b)采用步骤(a)中制得的胶体金标记鼠抗人IgM抗体获得免疫胶体金；
(c)采用喷金缓冲液稀释步骤(b)的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金玻璃纤维膜；
(d)将硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液预处理后，喷点与二氧化硅纳米颗粒结合柯萨奇病毒A16型抗原和肠道病毒71型抗原，在质控线上喷点羊抗鼠IgG，制得免疫硝酸纤维素膜；
(e)将预处理的样品垫、步骤(c)制备的免疫胶体金玻璃纤维膜、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在塑料板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
步骤(a)所述的采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金颗粒粒径为20～60nm。
步骤(c)所述的喷金缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5～20％，海藻糖浓度为1～5％，BSA浓度为0.5～1％。
步骤(d)所述的将硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液预处理是：用多聚赖氨酸处理液浸泡硝酸纤维素膜1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
步骤(d)所述的二氧化硅纳米颗粒分别结合柯萨奇病毒A16和肠道病毒71是：以二氧化硅作为载体，分别取1mL柯萨奇病毒A16和肠道病毒71抗原溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，9000rpm和7500rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍。
步骤(e)所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂(吐温-80)组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％，酪蛋白浓度为0.1～0.2％、表面活性剂浓度为0.5～1％。
步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸(SIGMA,150KD～300KD)稀释到浓度为0.5％组成，经0.22μm滤膜过滤，备用。
步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸(SIGMA,150KD～300KD)与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为8％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸(SIGMA,150KD～300KD)、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为8％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
步骤(d)所述的二氧化硅纳米颗粒制备方法：将2.48mL氨水(体积分数25)和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35C左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声3分钟，即可制得粒径120nm均一的粒子，分别以12000rpm，9000rpm和7500rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散，反复多次洗涤至近中性，最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用。
实施例1：
(a)胶体金溶液制备
在加热的100ml纯化水中快速加入氯化金，待溶液再次沸腾后，迅速加入柠檬酸三钠，氯化金：柠檬酸三钠1：0.5，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，计时继续加热10分钟即可，胶体金颗粒为20nm。
(b)免疫胶体金制备
1)分别取100毫升20nm胶体金溶液，加入pH调节剂140μl，混匀；静置5min；
2)在20nm胶体金溶液中，按照每毫升胶体金溶液14μg的比例加入鼠抗人IgM，共1.4mg，混匀，静置5min；
3)分别按照0.4％的比例加入胶体金稳定剂0.4毫升，混匀，静置5分钟；
4)10000、12000、14000rpm离心10min，分别收集沉淀，合并三次收集的沉淀。
(c)采用优化的喷金缓冲液稀释免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体玻璃纤维膜；所述的喷金缓冲液包括：浓度为20mMTris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、BSA浓度为1％，pH为8.5；
(d)固相硝酸纤维素膜
1)多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜
配制多聚赖氨酸处理液：多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)、浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入多聚赖氨酸处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)二氧化硅纳米颗粒修饰柯萨奇病毒A16(CA16)和肠道病毒71(EV71)抗原
二氧化硅纳米颗粒制备:将2.48mL氨水(体积分数25)和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35C左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声3分钟，即可制得粒径120nm均一的粒子，分别以12000rpm，9000rpm和7500rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散.反复多次洗涤至近中性。最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用。
二氧化硅纳米颗粒修饰抗萨奇病毒A16(CA16)和肠道病毒71(EV71)抗原：
以二氧化硅作为载体，分别取1mL萨奇病毒A16(CA16)和肠道病毒71(EV71)抗原溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，9000rpm和7500rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍；
3)硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.4μl/cm，将二氧化硅纳米颗粒-萨奇病毒A16(CA16)和二氧化硅纳米颗粒-肠道病毒71(EV71)抗原稀释至1.5mg/ml，质控线抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用，硝酸纤维膜的检测线喷点二氧化硅纳米颗粒-萨奇病毒A16(CA16)和肠道病毒71(EV71)抗原，其中萨奇病毒A16(CA16)在前，肠道病毒71(EV71)在后，萨奇病毒A16检测线距硝酸纤维素膜上缘距离3mm，肠道病毒71(EV71)检测线距硝酸纤维素膜上缘距离5mm；质控线上喷点抗鼠IgG抗体距硝酸纤维素膜上缘10mm；
4)样品垫预处理
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，其种样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5％、酪蛋白浓度为0.1％、表面活性剂浓度为0.5％，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
e、组装
将预处理的样品垫、免疫胶体金玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
实施例2：
(a)胶体金溶液制备
在加热的100ml纯化水中快速加入氯化金，待溶液再次沸腾后，迅速加入柠檬酸三钠，氯化金：柠檬酸三钠1：1，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，计时继续加热10分钟即可，胶体金颗粒为40nm。
(b)免疫胶体金制备
1)分别取100毫升40nm胶体金溶液，加入pH调节剂140μl，混匀；静置5min；
2)在40nm胶体金溶液中，按照每毫升胶体金溶液14μg的比例加入鼠抗人IgM，共1.4mg，混匀，静置5min；
3)分别按照0.4％的比例加入胶体金稳定剂0.4毫升，混匀，静置5分钟；
4)10000、12000、14000rpm离心10min，分别收集沉淀，合并三次收集的沉淀。
(c)采用优化的喷金缓冲液稀释免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体玻璃纤维膜；所述的喷金缓冲液包括：浓度为20mMTris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、BSA浓度为1％，pH为8.5；
(d)固相硝酸纤维素膜
1)多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜
配制多聚赖氨酸处理液：多聚赖氨酸(SIGMA,200KD)、浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入多聚赖氨酸处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)二氧化硅纳米颗粒修饰柯萨奇病毒A16(CA16)和肠道病毒71(EV71)抗原
二氧化硅纳米颗粒制备：将2.48mL氨水(体积分数25)和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35C左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声3分钟，即可制得粒径120nm均一的粒子，分别以12000rpm，9000rpm和7500rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散.反复多次洗涤至近中性。最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用。
二氧化硅纳米颗粒修饰抗萨奇病毒A16(CA16)和肠道病毒71(EV71)抗原：
以二氧化硅作为载体，分别取1mL萨奇病毒A16(CA16)和肠道病毒71(EV71)抗原溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，9000rpm和7500rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍；
3)硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.4μl/cm，将二氧化硅纳米颗粒-萨奇病毒A16(CA16)和二氧化硅纳米颗粒-肠道病毒71(EV71)抗原稀释至1.5mg/ml，质控线抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用，硝酸纤维膜的检测线喷点二氧化硅纳米颗粒-萨奇病毒A16(CA16)和肠道病毒71(EV71)抗原，其中萨奇病毒A16(CA16)在前，肠道病毒71(EV71)在后，萨奇病毒A16检测线距硝酸纤维素膜上缘距离6mm，肠道病毒71(EV71)检测线距硝酸纤维素膜上缘距离10mm；质控线上喷点抗鼠IgG抗体距硝酸纤维素膜上缘15mm；
4)样品垫预处理
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，其种样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5％、酪蛋白浓度为0.1％、表面活性剂浓度为0.5％，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
e、组装
将预处理的样品垫、免疫胶体金玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
实施例3：
(a)胶体金溶液制备
在加热的100ml纯化水中快速加入氯化金，待溶液再次沸腾后，迅速加入柠檬酸三钠，氯化金：柠檬酸三钠1：2，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，计时继续加热10分钟即可，胶体金颗粒为60nm。
(b)免疫胶体金制备
1)分别取100毫升60nm胶体金溶液，加入pH调节剂140μl，混匀；静置5min；
2)在60nm胶体金溶液中，按照每毫升胶体金溶液14μg的比例加入鼠抗人IgM，共1.4mg，混匀，静置5min；
3)分别按照0.4％的比例加入胶体金稳定剂0.4毫升，混匀，静置5分钟；
4)10000、12000、14000rpm离心10min，分别收集沉淀，合并三次收集的沉淀。
(c)采用优化的喷金缓冲液稀释免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体玻璃纤维膜；所述的喷金缓冲液包括：浓度为20mMTris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、BSA浓度为1％，pH为8.5；
(d)固相硝酸纤维素膜
1)多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜
配制多聚赖氨酸处理液：多聚赖氨酸(SIGMA,300KD)、浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入多聚赖氨酸处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)二氧化硅纳米颗粒修饰柯萨奇病毒A16(CA16)和肠道病毒71(EV71)抗原
二氧化硅纳米颗粒制备：将2.48mL氨水(体积分数25)和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35C左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声3分钟，即可制得粒径120nm均一的粒子，分别以12000rpm，9000rpm和7500rpm离心10分钟收集,倒掉上清液，再加水超声分散.反复多次洗涤至近中性。最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用。
二氧化硅纳米颗粒修饰抗萨奇病毒A16(CA16)和肠道病毒71(EV71)抗原：
以二氧化硅作为载体，分别取1mL萨奇病毒A16(CA16)和肠道病毒71(EV71)抗原溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，9000rpm和7500rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍；
3)硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.4μl/cm，将二氧化硅纳米颗粒-萨奇病毒A16(CA16)和二氧化硅纳米颗粒-肠道病毒71(EV71)抗原稀释至1.5mg/ml，质控线抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用，硝酸纤维膜的检测线喷点二氧化硅纳米颗粒-萨奇病毒A16(CA16)和肠道病毒71(EV71)抗原，其中萨奇病毒A16(CA16)在前，肠道病毒71(EV71)在后，萨奇病毒A16检测线距硝酸纤维素膜上缘距离12mm，肠道病毒71(EV71)检测线距硝酸纤维素膜上缘距离15mm；质控线上喷点抗鼠IgG抗体距硝酸纤维素膜上缘18mm；
4)样品垫预处理
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，其种样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5％、酪蛋白浓度为0.1％、表面活性剂浓度为0.5％，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
e、组装
将预处理的样品垫、免疫胶体金玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
实施例4：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为8％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
其余同实施例2。
实施例5：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,200KD)与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为8％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
其余同实施例2。
实施例6：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,300KD)与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为8％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
其余同实施例2。
实施例7：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为8％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
其余同实施例2。
实施例8：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,200KD)、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为8％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
其余同实施例2。
实施例9：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,300KD)、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为8％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
其余同实施例2。
下边通过实验来进一步说明本发明的效果。
实验例1：
1、多聚赖氨酸处理液对硝酸纤维素膜蛋白吸附能力的比较
1.1材料与方法
1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司，多聚赖氨酸购自Sigma公司
1.2硝酸纤维素膜处理方法
1.2.1配制多聚赖氨酸处理液
配制三种多聚赖氨酸处理液：多聚赖氨酸组，多聚赖氨酸浓度为0.5％组成；多聚赖氨酸处理液甲醇组，多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为8％；多聚赖氨酸、甲醇和PEG20000组，，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为8％，PEG20000浓度为0.1％，三组处理液均经0.22μm滤膜过滤，备用。
1.2.2硝酸纤维素膜处理方法
将硝酸纤维素膜放入多聚赖氨酸处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
1.3实验方法
分别将未处理和已处理过的硝酸纤维素膜按照上述实施例工艺流程制备柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较硝酸纤维素膜未处理和处理后吸附力和稳定性指标差异。
1.4结果
1.4.1蛋白吸附力比较
取3组处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过观察显色情况判断处理后膜对蛋白吸附能力，结果见表1。结果显示，处理后的硝酸纤维素膜在溶液浸润性方面要明显优于未处理膜，处理后膜阳性条带颜色略深，尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明蛋白吸附能力明显增强，提高了反应灵敏度。多聚赖氨酸、甲醇和PEG20000处理组吸附效果明显优于多聚赖氨酸组和多聚赖氨酸甲醇组。
表1硝酸纤维素膜吸附能力比较
1.4.2硝酸纤维素膜稳定性比较
取3组处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察显色情况来判断处理后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，结果见表2。表2结果与表1结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表2硝酸纤维素膜加速稳定性比较(37℃放置10天)
实验例2：
2、二氧化硅纳米颗粒修饰柯萨奇病毒A16和肠道病毒71抗原
2.1材料与方法
2.1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司，正硅酸乙酯购自汕头陇西化工厂
2.1.2二氧化硅纳米颗粒制备
将2.48mL氨水(体积分数25)和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35C左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴人3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声3分钟，即可制得粒径均一的粒子(120nm)。分别以12000rpm，9000rpm和7500rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散。反复多次洗涤至近中性。最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用。
2.1.3二氧化硅纳米颗粒修饰柯萨奇病毒A16和肠道病毒71抗原
以二氧化硅作为载体，取1mL柯萨奇病毒A16和肠道病毒71抗原溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍。
2.2实验方法
分别将二氧化硅纳米颗粒修饰的柯萨奇病毒A16和肠道病毒71抗原与未修饰的柯萨奇病毒A16和肠道病毒71抗原按照上述实施例工艺流程制备柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM联合检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较二氧化硅纳米颗粒处理和未处理对蛋白吸附力和稳定性指标差异。
2.3结果
2.3.1蛋白吸附力比较
取二氧化硅纳米颗粒处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过观察显色情况判断处理后膜对蛋白吸附能力，结果见表3。结果显示，二氧化硅纳米颗粒修饰组膜阳性条带颜色略深，尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明蛋白吸附能力明显增强，提高了反应灵敏度。
表3二氧化硅纳米颗粒修饰对蛋白吸附能力比较
2.3.2稳定性比较
取二氧化硅纳米颗粒处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察显色情况来判断二氧化硅修饰后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，结果见表4。表4结果与表3结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表2加速稳定性比较(37℃放置10天)
以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(a)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
(b)采用步骤(a)中制得的胶体金标记鼠抗人IgM抗体获得免疫胶体金；
(c)采用喷金缓冲液稀释步骤(b)的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金玻璃纤维膜；
(d)将硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液预处理后，喷点与二氧化硅纳米颗粒结合柯萨奇病毒A16型抗原和肠道病毒71型抗原，在质控线上喷点羊抗鼠IgG，制得免疫硝酸纤维素膜；
所述的将硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液预处理是：用多聚赖氨酸处理液浸泡硝酸纤维素膜1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
所述的二氧化硅纳米颗粒分别结合柯萨奇病毒A16和肠道病毒71是：以二氧化硅作为载体，分别取1mL柯萨奇病毒A16和肠道病毒71抗原溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，9000rpm和7500rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍；
所述的二氧化硅纳米颗粒制备方法：将2.48mL体积分数25的氨水和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35C和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声3分钟，即可制得粒径120nm均一的粒子，分别以12000rpm，9000rpm和7500rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散，反复多次洗涤至近中性，最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用；
(e)将预处理的样品垫、步骤(c)制备的免疫胶体金玻璃纤维膜、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在塑料板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
2.根据权利要求1所述的柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(a)所述的采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金颗粒粒径为20～60nm。
3.根据权利要求1所述的柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(c)所述的喷金缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5～20％，海藻糖浓度为1～5％，BSA浓度为0.5～1％。
4.根据权利要求1所述的柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(e)所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂吐温-80组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％，酪蛋白浓度为0.1～0.2％、表面活性剂吐温-80浓度为0.5～1％。
5.根据权利要求1所述的柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸稀释到浓度为0.5％组成，经0.22μm滤膜过滤，其中多聚赖氨酸，SIGMA,150KD～300KD，备用。
6.根据权利要求1所述的柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为8％，经0.22μm滤膜过滤，其中多聚赖氨酸，SIGMA,150KD～300KD，备用。
7.根据权利要求1所述的柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为8％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，其中多聚赖氨酸，SIGMA,150KD～300KD，备用。
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