CN104155357A - 一种三维立方孔道介孔二氧化硅传感器的制备方法及应用 - Google Patents
一种三维立方孔道介孔二氧化硅传感器的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种三维立方孔道介孔二氧化硅传感器的制备方法及应用，属于新型纳米功能材料与生物传感技术领域。具体是基于金纳米粒子杂化氨基化石墨烯和金纳米粒子杂化KIT-6介孔材料，制备出夹心型电化学免疫传感器，用于检测人血清中的人免疫球蛋白。其特征在于：（1）金纳米粒子杂化氨基化石墨烯的制备；（2）金纳米粒子杂化KIT-6介孔材料/人免疫球蛋白/甲苯胺蓝/1-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体二抗标记物的制备；（3）夹心型电化学免疫传感器的制备。采用的KIT-6介孔材料具有大的比表面积、优异的吸附性能和良好的生物活性，有利于负载大量金纳米粒子来固定更多的二抗，同时可以负载大量的甲苯胺蓝，又引入溶解在羧甲基壳聚糖中的离子液体有效防止甲苯胺蓝泄漏并提供电子转移通道。其优点在于灵敏度高、特异性好、易于操作、检测限低。
Description
技术领域
本发明属于功能化纳米材料、免疫分析及生物传感技术领域，具体涉及一种三维立方孔道介孔二氧化硅传感器的制备方法及应用。
背景技术
近年来，介孔硅材料由于其具有较大的比表面积，较高的孔容和可调节的孔径已经引起了吸附、传感和生物医学等领域的广泛关注。目前，比较常见的介孔硅材料有，MCM-41、MCM-48和SBA-15。在这些介孔硅材料中，KIT-6拥有可持续的Ia3d对称立方结构和互相贯穿的圆柱形孔体系，它特有的三维立方孔道就像一个开口的介孔模板使活性物种的负载变得容易，而且负载物可以在整个孔道内部分散均匀而不形成团聚的大颗粒，因此，利用具有良好吸附性能的KIT-6来吸附甲苯胺蓝作为传感器制作中的二抗标记物，可提供并放大电化学信号，降低分析物的检测限，从而提高检测的灵敏度。在标记物中还引入了1-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体，可以起到加速电子转移的作用。
发明内容
本发明的目的之一是制备一种基于三维立方孔道的介孔二氧化硅传感器。
本发明的目的之二是利用所制备的传感器，通过电化学技术对分析物进行检测。
本发明的技术方案，包括以下步骤。
1.传感材料的制备方法，包括以下步骤：
（1）氨基化石墨烯NH2-GS制备，步骤如下：
将0.3 g的石墨粉和1.8 g高锰酸钾放入三口瓶中，加入40 mL 9∶1混合的硫酸和磷酸混合液，50℃下反应12 h，倾倒至40 mL的冰上，加入300 μL的过氧化氢，缓慢磁力搅拌0.5 h，离心，分别用盐酸、乙醇、乙醚离心洗涤，35℃真空干燥，制得棕黄色氧化石墨烯GO固体粉末。
在10 mL无水乙醇中分散0.1g GO，超声5 h，加入0.2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃回流1.5 h，加入0.1 mL、质量分数为80%的水合肼，95℃回流1.5 h，离心洗涤，35℃真空干燥，制得黑色粉末氨基化石墨烯NH2-GS。
（2）金纳米粒子杂化氨基化石墨烯复合材料AuGS的制备，步骤如下：
室温下，向100 mL超纯水中加入8~12 mg NaBH4，溶解后，搅拌下逐渐滴加1.6 mL、质量分数为1%的HAuCl4溶液，得到宝石红色透明溶液，继续搅拌1 h，超声1 h，制得分散均匀的金纳米粒子AuNPs溶液。
将8~12 mg NH2-GS溶于10 mL超纯水中，加入到25 mL制得的AuNPs溶液中，震荡12 h，离心洗涤，35℃真空干燥，制得黑色粉末AuGS。
（3）氨基化KIT-6纳米材料NH2-KIT-6的制备
将7~9 g三嵌段共聚物表面活性剂P123溶解于15 mL浓盐酸和330 mL超纯水中，搅拌1 h至P123溶解，制成透明溶液，向透明溶液中加入7~9 g正丁醇，搅拌1 h，置于30~45℃的水浴中，缓慢滴加18~20 g TEOS，搅拌2 h，100℃下水热处理24 h，过滤，用超纯水反复洗涤，制得粉体，100℃干燥处理，550℃煅烧除去表面活性剂，制得KIT-6。
取0.1 g KIT-6溶于10 mL无水甲苯中，加入0.1 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃回流1.5 h，离心，于110℃下干燥1 h，制得粉末状氨基功能化的KIT-6，即NH2-KIT-6。
（4）金纳米粒子杂化KIT-6介孔材料AuKIT-6的制备
室温下，向100 mL超纯水中加入4~6 mg NaBH4，溶解，搅拌下逐渐滴加0.8 mL、质量分数为1% 的HAuCl4溶液，观察得到宝石红色透明溶液，继续搅拌1 h后，超声1 h，制得分散均匀的AuNPs溶液；将10 mg NH2-KIT-6溶于10 mL超纯水中，搅拌下，缓缓加入到40 mL制得AuNPs溶液中，溶液立即变为不透明的深紫色，离心，除去上清液，在35℃下真空干燥，制得紫色固体粉末Au KIT-6。
2.二抗标记物AuKIT-6/Ab2/TB/[BPy]BF4的制备方法
取0.5~1.5 mg Au KIT-6溶于1 mL、 pH=7.4的PBS缓冲溶液中，超声1 h使其分散均匀，加入1 mL、5~15μg/mL的人免疫球蛋白二抗Ab2，4℃下震荡24 h，离心，除去上清液，得到Au KIT-6/Ab2。
将1 mLEDC/NHS溶液，1 mL 、1~3 mg/mL甲苯胺蓝溶液，加入到上述制得的AuKIT-6/Ab2中，4℃下震荡24 h；离心除去上清液后，加入0.4~0.6 mL 1-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体[BPy]BF4溶液，震荡1 h、离心，除去上清液，加入0.5 mL、pH=7.4的PBS缓冲溶液，在4℃下储存备用，制得AuKIT-6/Ab2/TB/[BPy]BF4。
所述EDC/NHS溶液为含有2~10 mmol/L EDC和2 mmol/L NHS的pH=6.5的PBS缓冲溶液；所述甲苯胺蓝溶液为含有2mg/mL甲苯胺蓝的pH=7.4的PBS缓冲溶液；所述[BPy]BF4溶液为将[BPy]BF4分散于10 mg/mL的羧甲基壳聚糖溶液中，其浓度为8~12 mg/mL。
3.电化学免疫传感器的制备，步骤如下：
（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV。
（2）将6 μL、0.5 mg/mL的AuGS溶液修饰于玻碳电极表面，室温干燥。
（3）将6 μL、10 μg/mL的人免疫球蛋白一抗(Ab1)、滴涂到步骤（2）修饰的电极表面，置于4℃湿润条件下晾干。
（4）清洗掉未结合的一抗后，将3 μL、10 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）滴涂到步骤（3）Ab1修饰的电极表面，4℃下湿润条件下晾干。
（5）清洗掉未结合的BSA，将6 μL人免疫球蛋白抗原（IgG）滴涂在步骤（4）BSA修饰的电极表面，室温下孵化1 h后，清洗掉没有特异性结合的IgG，4℃下湿润条件下晾干。
（6）将6 μL，2 mg/mL AuKIT-6/Ab2/TB/[BPy]BF4滴涂在步骤（5）IgG修饰的电极表面，在室温下孵化1 h，彻底清洗后，4℃下湿润条件下晾干，电化学免疫传感器制备完成。
所述AuGS的浓度为0.25~1 mg/mL，所述AuKIT-6的浓度为1~3 mg/mL。
4.一种三维立方孔道介孔二氧化硅传感器用于人免疫球蛋白的检测，步骤如下：
（1）采用pH=6.8 PBS溶液，配制在10-5~102 ng·mL-1范围内不同浓度的IgG溶液，将6 μL不同浓度的IgG溶液分别滴涂至权利要求2中步骤（4）BSA修饰的电极表面，晾干后，按照权利要求2中步骤（6）修饰电极，连接至电化学工作站中，分别将电极置于pH=6.8的PBS缓冲溶液中，采用差分脉冲伏安法在-0.6~0 V下进行扫描，记录电流变化。
（2）根据所得电流差值与IgG浓度呈线性关系，绘制工作曲线。
（3）依据工作曲线的绘制方法进行样品中IgG的检测，检测结果从工作曲线中查得。
实验结果表明，本免疫传感器的差分脉冲伏安氧化峰电流与抗原浓度在10-5~102 ng/mL范围内保持良好的线性关系，相关系数为0.9905，检测限为3.3 fg/mL。
本发明的有益成果
（1）采用一种三维立方孔道介孔二氧化硅KIT-6作为传感材料，其具有大的比表面积、优异的吸附性能和良好的生物活性，有利于负载大量金纳米粒子来固定更多的二抗，使检测信号显著增加，提高检测灵敏度。
（2）三维立方孔道介孔二氧化硅KIT-6还可以负载大量的甲苯胺蓝。
（3）引入溶解在羧甲基壳聚糖中的离子液体，可以有效防止甲苯胺蓝泄漏，又同时提供电子转移通道。
（4）本发明传感器检测限低，对人免疫球蛋白的检测限为3.3 fg/mL，达到了高灵敏快速检测人免疫球蛋白的目的。
具体实施方式
实施例1
传感材料的制备方法，包括以下步骤：
（1）氨基化石墨烯NH2-GS制备，步骤如下：
将0.3 g的石墨粉和1.8 g高锰酸钾放入三口瓶中，加入40 mL 9∶1混合的硫酸和磷酸混合液，50℃下反应12 h，倾倒至40 mL的冰上，加入300 μL的过氧化氢，缓慢磁力搅拌0.5 h，离心，分别用盐酸、乙醇、乙醚离心洗涤，35℃真空干燥，制得棕黄色氧化石墨烯GO固体粉末。
在10 mL无水乙醇中分散0.1g GO，超声5 h，加入0.2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃回流1.5 h，加入0.1 mL 、质量分数为80%的水合肼，95℃回流1.5 h，离心洗涤，35℃真空干燥，制得黑色粉末氨基化石墨烯NH2-GS。
（2）金纳米粒子杂化氨基化石墨烯复合材料AuGS的制备，步骤如下：
室温下，向100 mL超纯水中加入8 mg NaBH4，溶解后，搅拌下逐渐滴加1.6 mL、质量分数为1%的HAuCl4溶液，得到宝石红色透明溶液，继续搅拌1 h，超声1 h，制得分散均匀的金纳米粒子AuNPs溶液。
将8 mg NH2-GS溶于10 mL超纯水中，加入到25 mL制得的AuNPs溶液中，震荡12 h，离心洗涤，35℃真空干燥，制得黑色粉末AuGS。
（3）氨基化KIT-6纳米材料NH2-KIT-6的制备
将7 g三嵌段共聚物表面活性剂P123溶解于15 mL浓盐酸和330 mL超纯水中，搅拌1 h至P123溶解，制成透明溶液，向透明溶液中加入7 g正丁醇，搅拌1 h，置于30℃的水浴中，缓慢滴加18 g TEOS，搅拌2 h，100℃下水热处理24 h，过滤，用超纯水反复洗涤，制得粉体，100℃干燥处理，550℃煅烧除去表面活性剂，制得KIT-6。
取0.1 g KIT-6溶于10 mL无水甲苯中，加入0.1 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃回流1.5 h，离心，于110℃下干燥1 h，制得粉末状氨基功能化的KIT-6，即NH2-KIT-6。
（4）金纳米粒子杂化KIT-6介孔材料AuKIT-6的制备
室温下，向100 mL超纯水中加入4 mg NaBH4，溶解，搅拌下逐渐滴加0.8 mL、质量分数为1%的HAuCl4溶液，观察得到宝石红色透明溶液，继续搅拌1 h后，超声1 h，制得分散均匀的AuNPs溶液；将10 mg NH2-KIT-6溶于10 mL超纯水中，搅拌下，缓缓加入到40 mL制得AuNPs溶液中，溶液立即变为不透明的深紫色，离心，除去上清液，在35℃下真空干燥，制得紫色固体粉末Au KIT-6。
实施例2
传感材料的制备方法，包括以下步骤：
（1）氨基化石墨烯NH2-GS制备，步骤如下：
将0.3 g的石墨粉和1.8 g高锰酸钾放入三口瓶中，加入40 mL 9∶1混合的硫酸和磷酸混合液，50℃下反应12 h，倾倒至40 mL的冰上，加入300 μL的过氧化氢，缓慢磁力搅拌0.5 h，离心，分别用盐酸、乙醇、乙醚离心洗涤，35℃真空干燥，制得棕黄色氧化石墨烯GO固体粉末。
在10 mL无水乙醇中分散0.1g GO，超声5 h，加入0.2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃回流1.5 h，加入0.1 mL 、质量分数为80%的水合肼，95℃回流1.5 h，离心洗涤，35℃真空干燥，制得黑色粉末氨基化石墨烯NH2-GS。
（2）金纳米粒子杂化氨基化石墨烯复合材料AuGS的制备，步骤如下：
室温下，向100 mL超纯水中加入10 mg NaBH4，溶解后，搅拌下逐渐滴加1.6 mL、质量分数为1%的HAuCl4溶液，得到宝石红色透明溶液，继续搅拌1 h，超声1 h，制得分散均匀的金纳米粒子AuNPs溶液。
将10 mg NH2-GS溶于10 mL超纯水中，加入到25 mL制得的AuNPs溶液中，震荡12 h，离心洗涤，35℃真空干燥，制得黑色粉末AuGS。
（3）氨基化KIT-6纳米材料NH2-KIT-6的制备
将8 g三嵌段共聚物表面活性剂P123溶解于15 mL浓盐酸和330 mL超纯水中，搅拌1 h至P123溶解，制成透明溶液，向透明溶液中加入8 g正丁醇，搅拌1 h，置于40℃的水浴中，缓慢滴加19 g TEOS，搅拌2 h，100℃下水热处理24 h，过滤，用超纯水反复洗涤，制得粉体，100℃干燥处理，550℃煅烧除去表面活性剂，制得KIT-6。
取0.1 g KIT-6溶于10 mL无水甲苯中，加入0.1 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃回流1.5 h，离心，于110℃下干燥1 h，制得粉末状氨基功能化的KIT-6，即NH2-KIT-6。
（4）金纳米粒子杂化KIT-6介孔材料AuKIT-6的制备
室温下，向100 mL超纯水中加入5 mg NaBH4，溶解，搅拌下逐渐滴加0.8 mL、质量分数为1%的HAuCl4溶液，观察得到宝石红色透明溶液，继续搅拌1 h后，超声1 h，制得分散均匀的AuNPs溶液；将10 mg NH2-KIT-6溶于10 mL超纯水中，搅拌下，缓缓加入到40 mL制得AuNPs溶液中，溶液立即变为不透明的深紫色，离心，除去上清液，在35℃下真空干燥，制得紫色固体粉末Au KIT-6。
实施例3
传感材料的制备方法，包括以下步骤：
（1）氨基化石墨烯NH2-GS制备，步骤如下：
将0.3 g的石墨粉和1.8 g高锰酸钾放入三口瓶中，加入40 mL 9∶1混合的硫酸和磷酸混合液，50℃下反应12 h，倾倒至40 mL的冰上，加入300 μL的过氧化氢，缓慢磁力搅拌0.5 h，离心，分别用盐酸、乙醇、乙醚离心洗涤，35℃真空干燥，制得棕黄色氧化石墨烯GO固体粉末。
在10 mL无水乙醇中分散0.1g GO，超声5 h，加入0.2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃回流1.5 h，加入0.1 mL 、质量分数为80%的水合肼，95℃回流1.5 h，离心洗涤，35℃真空干燥，制得黑色粉末氨基化石墨烯NH2-GS。
（2）金纳米粒子杂化氨基化石墨烯复合材料AuGS的制备，步骤如下：
室温下，向100 mL超纯水中加入12 mg NaBH4，溶解后，搅拌下逐渐滴加1.6 mL、质量分数为1%的HAuCl4溶液，得到宝石红色透明溶液，继续搅拌1 h，超声1 h，制得分散均匀的金纳米粒子AuNPs溶液。
将12 mg NH2-GS溶于10 mL超纯水中，加入到25 mL制得的AuNPs溶液中，震荡12 h，离心洗涤，35℃真空干燥，制得黑色粉末AuGS。
（3）氨基化KIT-6纳米材料NH2-KIT-6的制备
将9 g三嵌段共聚物表面活性剂P123溶解于15 mL浓盐酸和330 mL超纯水中，搅拌1 h至P123溶解，制成透明溶液，向透明溶液中加入9 g正丁醇，搅拌1 h，置于45℃的水浴中，缓慢滴加20 g TEOS，搅拌2 h，100℃下水热处理24 h，过滤，用超纯水反复洗涤，制得粉体，100℃干燥处理，550℃煅烧除去表面活性剂，制得KIT-6。
取0.1 g KIT-6溶于10 mL无水甲苯中，加入0.1 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃回流1.5 h，离心，于110℃下干燥1 h，制得粉末状氨基功能化的KIT-6，即NH2-KIT-6。
（4）金纳米粒子杂化KIT-6介孔材料AuKIT-6的制备
室温下，向100 mL超纯水中加入6 mg NaBH4，溶解，搅拌下逐渐滴加0.8 mL、质量分数为1% 的HAuCl4溶液，观察得到宝石红色透明溶液，继续搅拌1 h后，超声1 h，制得分散均匀的AuNPs溶液；将10 mg NH2-KIT-6溶于10 mL超纯水中，搅拌下，缓缓加入到40 mL制得AuNPs溶液中，溶液立即变为不透明的深紫色，离心，除去上清液，在35℃下真空干燥，制得紫色固体粉末Au KIT-6。
实施例4
二抗标记物AuKIT-6/Ab2/TB/[BPy]BF4的制备方法
取0.5 mg Au KIT-6溶于1 mL、pH=7.4的PBS缓冲溶液中，超声1 h使其分散均匀，加入1 mL、5 μg/mL的人免疫球蛋白二抗Ab2，4℃下震荡24 h，离心，除去上清液，得到AuKIT-6/Ab2。
将1 mL EDC/NHS溶液，1 mL、1 mg/mL甲苯胺蓝溶液，加入到上述制得的AuKIT-6/Ab2中，4℃下震荡24 h；离心除去上清液后，加入0.4 mL 1-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体[BPy]BF4溶液，震荡1 h、离心，除去上清液，加入0.5 mL、pH=7.4的PBS缓冲溶液，在4℃下储存备用，制得AuKIT-6/Ab2/TB/[BPy]BF4。
所述EDC/NHS溶液为含有2 mmol/L EDC和2 mmol/L NHS的pH=6.5的PBS缓冲溶液；所述甲苯胺蓝溶液为含有2 mg/mL甲苯胺蓝的pH=7.4的PBS缓冲溶液；所述[BPy]BF4溶液为将[BPy]BF4分散于10 mg/mL的羧甲基壳聚糖溶液中，其浓度为8 mg/mL。
实施例5
二抗标记物AuKIT-6/Ab2/TB/[BPy]BF4的制备方法
取1.0 mg Au KIT-6溶于1 mL、pH=7.4的PBS缓冲溶液中，超声1 h使其分散均匀，加入1 mL、10 μg/mL的人免疫球蛋白二抗Ab2，4℃下震荡24 h，离心，除去上清液，得到AuKIT-6/Ab2。
将1 mL EDC/NHS溶液，1 mL、2 mg/mL甲苯胺蓝溶液，加入到上述制得的AuKIT-6/Ab2中，4℃下震荡24 h；离心除去上清液后，加入0.5 mL 1-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体[BPy]BF4溶液，震荡1 h、离心，除去上清液，加入0.5 mL、pH=7.4的PBS缓冲溶液，在4℃下储存备用，制得AuKIT-6/Ab2/TB/[BPy]BF4。
所述EDC/NHS溶液为含有10 mmol/L EDC和2 mmol/L NHS的pH=6.5的PBS缓冲溶液；所述甲苯胺蓝溶液为含有2 mg/mL甲苯胺蓝的pH=7.4的PBS缓冲溶液；所述[BPy]BF4溶液为将[BPy]BF4分散于10 mg/mL的羧甲基壳聚糖溶液中，其浓度为10 mg/mL。
实施例6
二抗标记物AuKIT-6/Ab2/TB/[BPy]BF4的制备方法
取1.5 mg AuKIT-6溶于1 mL、pH=7.4的PBS缓冲溶液中，超声1 h使其分散均匀，加入1 mL、15 μg/mL的人免疫球蛋白二抗Ab2，4℃下震荡24 h，离心，除去上清液，得到AuKIT-6/Ab2。
将1 mL EDC/NHS溶液，1 mL、3 mg/mL甲苯胺蓝溶液，加入到上述制得的AuKIT-6/Ab2中，4℃下震荡24 h；离心除去上清液后，加入0.6 mL 1-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体[BPy]BF4溶液，震荡1 h、离心，除去上清液，加入0.5 mL、pH=7.4的PBS缓冲溶液，在4℃下储存备用，制得AuKIT-6/Ab2/TB/[BPy]BF4。
所述EDC/NHS溶液为含有6 mmol/L EDC和2 mmol/L NHS的pH=6.5的PBS缓冲溶液；所述甲苯胺蓝溶液为含有2 mg/mL甲苯胺蓝的pH=7.4的PBS缓冲溶液；所述[BPy]BF4溶液为将[BPy]BF4分散于10 mg/mL的羧甲基壳聚糖溶液中，其浓度为12 mg/mL。
实施例7
电化学免疫传感器的制备，步骤如下：
（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV。
（2）将6 μL、0.25 mg/mL的AuGS溶液修饰于玻碳电极表面，室温干燥。
（3）将6 μL、10 μg/mL的人免疫球蛋白一抗(Ab1)、滴涂到步骤（2）修饰的电极表面，置于4℃湿润条件下晾干。
（4）清洗掉未结合的一抗后，将3 μL、10 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）滴涂到步骤（3）Ab1修饰的电极表面，4℃下湿润条件下晾干。
（5）清洗掉未结合的BSA，将6 μL人免疫球蛋白抗原（IgG）滴涂在步骤（4）BSA修饰的电极表面，室温下孵化1 h后，清洗掉没有特异性结合的IgG，4℃下湿润条件下晾干。
（6）将6 μL，1 mg/mL AuKIT-6/Ab2/TB/[BPy]BF4滴涂在步骤（5）IgG修饰的电极表面，在室温下孵化1 h，彻底清洗后，4℃下湿润条件下晾干，电化学免疫传感器制备完成。
实施例8
电化学免疫传感器的制备，步骤如下：
（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV。
（2）将6 μL、0.5 mg/mL的AuGS溶液修饰于玻碳电极表面，室温干燥。
（3）将6 μL、10 μg/mL的人免疫球蛋白一抗(Ab1)、滴涂到步骤（2）修饰的电极表面，置于4℃湿润条件下晾干。
（4）清洗掉未结合的一抗后，将3 μL、10 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）滴涂到步骤（3）Ab1修饰的电极表面，4℃下湿润条件下晾干。
（5）清洗掉未结合的BSA，将6 μL人免疫球蛋白抗原（IgG）滴涂在步骤（4）BSA修饰的电极表面，室温下孵化1 h后，清洗掉没有特异性结合的IgG，4℃下湿润条件下晾干。
（6）将6 μL，2 mg/mL AuKIT-6/Ab2/TB/[BPy]BF4滴涂在步骤（5）IgG修饰的电极表面，在室温下孵化1 h，彻底清洗后，4℃下湿润条件下晾干，电化学免疫传感器制备完成。
实施例9
电化学免疫传感器的制备，步骤如下：
（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV。
（2）将6 μL、1 mg/mL的AuGS溶液修饰于玻碳电极表面，室温干燥。
（3）将6 μL、10 μg/mL的人免疫球蛋白一抗(Ab1)、滴涂到步骤（2）修饰的电极表面，置于4℃湿润条件下晾干。
（4）清洗掉未结合的一抗后，将3 μL、10 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）滴涂到步骤（3）Ab1修饰的电极表面，4℃下湿润条件下晾干。
（5）清洗掉未结合的BSA，将6 μL人免疫球蛋白抗原（IgG）滴涂在步骤（4）BSA修饰的电极表面，室温下孵化1 h后，清洗掉没有特异性结合的IgG，4℃下湿润条件下晾干。
（6）将6 μL，3 mg/mL AuKIT-6/Ab2/TB/[BPy]BF4滴涂在步骤（5）IgG修饰的电极表面，在室温下孵化1 h，彻底清洗后，4℃下湿润条件下晾干，电化学免疫传感器制备完成。
实施例10
一种三维立方孔道介孔二氧化硅传感器用于人免疫球蛋白的检测，步骤如下：
（1）采用pH=6.8 PBS溶液，配制在10-5~102 ng·mL-1范围内不同浓度的IgG溶液，将6 μL不同浓度的IgG溶液分别滴涂至权利要求2中步骤（4）BSA修饰的电极表面，晾干后，按照权利要求2中步骤（6）修饰电极，连接至电化学工作站中，分别将电极置于pH=6.8的PBS缓冲溶液中，采用差分脉冲伏安法在-0.6~0 V下进行扫描，记录电流变化；
（2）根据所得电流差值与IgG浓度呈线性关系，绘制工作曲线。
（3）依据工作曲线的绘制方法进行样品中IgG的检测，检测结果从工作曲线中查得。
实验结果表明，本免疫传感器的差分脉冲伏安氧化峰电流与抗原浓度在10-5~102 ng/mL范围内保持良好的线性关系，相关系数为0.9905，检测限为3.3 fg/mL。
Claims (3)
1.一种三维立方孔道介孔二氧化硅传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）氨基化石墨烯NH2-GS制备，步骤如下：
将0.3 g的石墨粉和1.8 g高锰酸钾放入三口瓶中，加入40 mL 9∶1混合的硫酸和磷酸混合液，50℃下反应12 h，倾倒至40 mL的冰上，加入300 μL的过氧化氢，缓慢磁力搅拌0.5 h，离心，分别用盐酸、乙醇、乙醚离心洗涤，35℃真空干燥，制得棕黄色氧化石墨烯GO固体粉末；
在10 mL无水乙醇中分散0.1g GO，超声5 h，加入0.2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃回流1.5 h，加入0.1 mL、质量分数为80%的水合肼，95℃回流1.5 h，离心洗涤，35℃真空干燥，制得黑色粉末氨基化石墨烯NH2-GS；
（2）金纳米粒子杂化氨基化石墨烯复合材料AuGS的制备，步骤如下：
室温下，向100 mL超纯水中加入8~12 mg NaBH4，溶解后，搅拌下逐渐滴加1.6 mL、质量分数为1%的HAuCl4溶液，得到宝石红色透明溶液，继续搅拌1 h，超声1 h，制得分散均匀的金纳米粒子AuNPs溶液；
将8~12 mg NH2-GS溶于10 mL超纯水中，加入到25 mL制得的AuNPs溶液中，震荡12 h，离心洗涤，35℃真空干燥，制得黑色粉末AuGS；
（3）氨基化KIT-6纳米材料NH2-KIT-6的制备
将7~9 g三嵌段共聚物表面活性剂P123溶解于15 mL浓盐酸和330 mL超纯水中，搅拌1 h至P123溶解，制成透明溶液，向透明溶液中加入7~9 g正丁醇，搅拌1 h，置于30~45℃的水浴中，缓慢滴加18~20 g TEOS，搅拌2 h，100℃下水热处理24 h，过滤，用超纯水反复洗涤，制得粉体，100℃干燥处理，550℃煅烧除去表面活性剂，制得KIT-6；
取0.1 g KIT-6溶于10 mL无水甲苯中，加入0.1 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃回流1.5 h，离心，于110℃下干燥1 h，制得粉末状氨基功能化的KIT-6，即NH2-KIT-6；
（4）金纳米粒子杂化KIT-6介孔材料AuKIT-6的制备
室温下，向100 mL超纯水中加入4~6 mg NaBH4，溶解，搅拌下逐渐滴加0.8 mL、质量分数为1%的HAuCl4溶液，观察得到宝石红色透明溶液，继续搅拌1 h后，超声1 h，制得分散均匀的AuNPs溶液；将10 mg NH2-KIT-6溶于10 mL超纯水中，搅拌下，缓缓加入到40 mL制得AuNPs溶液中，溶液立即变为不透明的深紫色，离心，除去上清液，在35℃下真空干燥，制得紫色固体粉末Au KIT-6；
（5）二抗标记物AuKIT-6/Ab2/TB/[BPy]BF4的制备
取0.5~1.5 mg Au KIT-6溶于1 mL、 pH=7.4的PBS缓冲溶液中，超声1 h使其分散均匀，加入1 mL、5~15μg/mL的人免疫球蛋白二抗Ab2，4℃下震荡24 h，离心，除去上清液，得到Au KIT-6/Ab2；
将1 mL EDC/NHS溶液，1 mL、1~3 mg/mL甲苯胺蓝溶液，加入到上述制得的AuKIT-6/Ab2中，4℃下震荡24 h；离心除去上清液后，加入0.4~0.6 mL 1-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体[BPy]BF4溶液，震荡1 h、离心，除去上清液，加入0.5 mL、pH=7.4的PBS缓冲溶液，在4℃下储存备用，制得AuKIT-6/Ab2/TB/[BPy]BF4；
所述EDC/NHS溶液为含有2~10 mmol/L EDC和2 mmol/L NHS的pH=6.5的PBS缓冲溶液；所述甲苯胺蓝溶液为含有2 mg/mL甲苯胺蓝的pH=7.4的PBS缓冲溶液；所述[BPy]BF4溶液为将[BPy]BF4分散于10 mg/mL的羧甲基壳聚糖溶液中，其浓度为8~12 mg/mL。
2.如权利要求1所述的一种三维立方孔道介孔二氧化硅传感器的制备方法，其特征在于，所述的电化学免疫传感器的制备，步骤如下：
（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV；
（2）将6 μL AuGS溶液修饰于玻碳电极表面，室温干燥；
（3）将6 μL、10 μg/mL的人免疫球蛋白一抗(Ab1)、滴涂到步骤（2）修饰的电极表面，置于4℃湿润条件下晾干；
（4）清洗掉未结合的一抗后，将3 μL、10 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）滴涂到步骤（3）Ab1修饰的电极表面，4℃下湿润条件下晾干；
（5）清洗掉未结合的BSA，将6 μL人免疫球蛋白抗原（IgG）滴涂在步骤（4）BSA修饰的电极表面，室温下孵化1 h后，清洗掉没有特异性结合的IgG，4℃下湿润条件下晾干；
（6）将6 μL AuKIT-6/Ab2/TB/[BPy]BF4滴涂在步骤（5）IgG修饰的电极表面，在室温下孵化1 h，彻底清洗后，4℃下湿润条件下晾干，电化学免疫传感器制备完成；
所述AuGS的浓度为0.25~1 mg/mL，所述AuKIT-6的浓度为1~3 mg/mL。
3.如权利要求1~2之一一种三维立方孔道介孔二氧化硅传感器的制备方法，其特征在于，所述电化学免疫传感器的应用，用于人免疫球蛋白的检测，步骤如下：
（1）采用pH=6.8 PBS溶液，配制在10-5~102 ng·mL-1范围内不同浓度的IgG溶液，将6 μL不同浓度的IgG溶液分别滴涂至权利要求2中步骤（4）BSA修饰的电极表面，晾干后，按照权利要求2中步骤（6）修饰电极，连接至电化学工作站中，分别将电极置于pH=6.8 的 PBS缓冲溶液中，采用差分脉冲伏安法在-0.6~0 V下进行扫描，记录电流变化；
（2）根据所得电流差值与IgG浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
（3）依据工作曲线的绘制方法进行样品中IgG的检测，检测结果从工作曲线中查得。
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