CN104931693B - 电化学免疫传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供本发明提供一种电化学免疫传感器，包括复合碳纳米管电极、免疫生物探针、待测物。本发明的有益效果在于：通过Layer‑by‑Layer方法，形成层层自组装的致密纳米结构薄膜，并对薄膜进行改性，获得具有良好生物相容性，高导电性，高稳定性的纳米电极材料，提高灵敏度，和检测稳定性，减少检测时间。使得导电率、比表面积等性能更优越，且具有一定的柔韧性；在改性时，官能团的密度可控，给生物分子与电极表面的结合量提供了参考。化学键共价结合法的应用克服了物理吸附法固定过程中的随机导向问题严重，特异选择性不够，生物分子与固体表面的结合不牢固，易脱落、灵敏度差等缺点。

Description

电化学免疫传感器及其制备方法
技术领域
本发明属于检测技术，特别涉及一种电化学免疫传感器及其制备方法。
背景技术
电化学免疫传感器(Electrochemical Immunosensor，ECIS)是一种集微生物学、免疫学、物理学等多学科交叉的先进技术，具有灵敏度高、特异性强、检测快速方便和易实现在线检测等优点，因此成为环境和食品安全检测等多个领域中有害微生物快速检测的研究热点，应用前景广阔。而以往的免疫传感器多使用石墨烯、无序的碳纳米管、介孔碳等材料来制作电极，操作复杂易流失，性能不够好，且在电子的传输速率上有一定的限制，拉伸强度稍欠；同时，电极与生物分子的结合也多采用物理吸附法固定，反应过程中随机导向问题严重，特异选择性不够，且利用物理吸附法固定的生物分子与固体表面的结合不牢固，具有易脱落、灵敏度差等缺点。因此，需要一种新型的电化学免疫传感器来解决或减少这些问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种电化学免疫传感器及其制备方法，以获得具有良好生物相容性，高导电性，高稳定性的纳米电极材料，提高灵敏度，和检测稳定性，减少检测时间。
本发明提供一种电化学免疫传感器，包括复合碳纳米管电极、免疫生物探针、待测物。
优选的，所述的复合碳纳米管为高导电率及双向的基团改性的复合碳纳米管；所述的免疫生物探针包括电极和待结合物。
优选的，所述的双向基团改性包括在碳纳米管电极表面基团进行的羧基化和氨基化改性；所述的高导电率的复合碳纳米管是将碳纳米管经过Layer-by-Layer法层层组装成致密的导电膜后制备而成。
优选的，所述的待结合物为辣根过氧化物酶标记的具有生物活性的分子。
本发明还提供一种电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备碳纳米管电极：所用的羧基化碳纳米管与氨基化碳纳米管在调整pH为2.5-4.5水中超声处理1-3小时，形成碳纳米管浓度为0.5mg/ml的稳定溶液；将电极基体先浸没于氨基化碳纳米管溶液20-60分钟，然后放入去离子水1-5分钟1-2次，反复循环此过程，直至获得层叠的碳纳米管电极；
(2)再构筑碳纳米管表面纳米形貌：将步骤(1)中的碳纳米管电极置于浓度为5nm-100nm或者0.01-10mg/ml的金溶胶中，并在-0.7至+0.7V的电压下以电沉积方式将金纳米颗粒固定在碳纳米管电极表面进行复合；
(3)制备免疫生物探针：用化学键共价交联法将以上步骤获得的碳纳米管电极在浓度为500mg/mL的1-乙基3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐，浓度为250mg/mL的N-羟基硫代湖泊酰亚胺，浓度为0.01-0.1mmol/L且pH值为7.0-7.4的磷酸盐缓冲液中活化1到2小时，磷酸盐缓冲液洗涤2～3次；随后将活化后的碳纳米管电极置于含有1.0-1.8μg/mL的辣根过氧化物酶标记的副溶血性弧菌抗体或单增李斯特菌抗体的磷酸盐缓冲液中反应3小时，磷酸盐缓冲液洗涤2～3次；然后将电极放在含有0.2％-2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭液中封闭1小时，洗涤2～3次，晾干后置4℃冰箱中保存备用；
(4)结合免疫生物探针与待测物：将免疫生物探针与副溶血性弧菌、单增李斯特菌溶液在室温下孵育，缓冲液洗涤2～3次，并在待测液中加入具有氧化还原特性的硫堇后进行待测。
优选的，所述步骤(1)中是将已有铜电极的基板在氨基化碳管溶液和羧基化碳管溶液中反复交替浸泡数次，获得层层自组装碳纳米管电极。
优选的，所述步骤(2)中是将金纳米颗粒固定在碳纳米管电极表面进行复合。
优选的，所述步骤(3)中是采用化学键共价交联法，使待固定物上的基团与电极表面的基团进行结合，形成化学键。
优选的，所述步骤(3)中还可在化学键共价交联法的基础上采用夹心法、竞争法、间接法、直接法结合固定物。
优选的，所述步骤(4)中：
采用三电极体系以循环伏安法作为免疫电极表征和定性判定的方法，以免疫反应前、后还原峰电流下降的比例来判断被测样品中是否含有副溶血性弧菌或单增李斯特菌抗原；或者采用电阻型生物探针，在不同浓度下，测量不同期电阻值的变换，获得定量数据。
本发明的有益效果在于：通过Layer-by-Layer方法，形成层层自组装的致密纳米结构薄膜，并对薄膜进行改性，获得具有良好生物相容性，高导电性，高稳定性的纳米电极材料，提高灵敏度，和检测稳定性，减少检测时间。使得导电率、比表面积等性能更优越，且具有一定的柔韧性；在改性时，官能团的密度可控，给生物分子与电极表面的结合量提供了参考。化学键共价结合法的应用克服了物理吸附法固定过程中的随机导向问题严重，特异选择性不够，生物分子与固体表面的结合不牢固，易脱落、灵敏度差等缺点。
附图说明
图1为复合碳纳米管电极的制备、生物分子固定及间接法、夹心法、竞争法三种方法下抗体与电极表面的结合示意图；
图2为免疫传感器的电化学表征图；
图3为化学键共价交联法处理的传感器的稳定性测试图；
图4为物理吸附固定法处理的传感器的稳定性测试图；
图5为在不同pH缓冲液中免疫传感器在加入双氧水后的还原峰电流峰值的对比图；
图6为向测试液中加入不同浓度双氧水前后还原峰电流峰值的对比图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将结合实施例进行详细说明。
本发明提供的电化学免疫传感器，包括复合碳纳米管电极、免疫生物探针、待测物。所述的复合碳纳米管为高导电率及双向的基团改性的复合碳纳米管；所述的免疫生物探针包括电极和待结合物。所述的双向基团改性包括在碳纳米管电极表面基团进行的羧基化和氨基化改性；所述的高导电率的复合碳纳米管是将碳纳米管经过Layer-by-Layer法层层组装成致密的导电膜后制备而成。所述的待结合物为辣根过氧化物酶标记的具有生物活性的分子。
本发明还提供一种电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)，关于碳纳米管电极的制备，所用的羧基化碳纳米管(MWNT-COOH)与氨基化碳纳米管(MWNT-NH2)在调整pH为2.5-4.5水中超声处理1-3小时，形成碳纳米管浓度为0.5mg/ml的稳定溶液。电极基体先浸没于MWNT-NH2溶液20-60分钟，然后放入去离子水1-5分钟1-2次，然后在放入到MWNT-COOH20-60分钟，然后放入去离子水1-5分钟1-2次，然后浸没于MWNT-NH2溶液20-60分钟，后放入去离子水中，过程被不断反复。反复循环此过程，获得良好层叠的layer-by-layer碳管膜电极。最终制得的碳纳米管电极如图1所示。
步骤(2)，将没有固定生物分子的电极室温下在0.1mol/L、pH7.0的含有硫堇的PBS磷酸盐测试液中进行电化学循环伏安法测试；洗涤后采用化学键共价交联法将一定量的酶标抗体固定在碳纳米管电极表面，洗涤后将其在测试液中进行测试，然后加入0.5m mol/L过氧化氢反应，测试结束后洗涤；将104cfu/mL的副溶血性弧菌、单增李斯特菌溶液与电极室温下孵育，洗涤后测试即得到图2。
步骤(3)，选取表观形貌相近的碳纳米管电极，室温下均置于各含有5μL的1-乙基3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基硫代湖泊酰亚胺(NHS)的50μL的PBS缓冲混合液中活化两个小时，洗涤；再把电极放置于含有一定量酶标抗体的PBS缓冲液中，反应三个小时；洗涤后，用含有0.2％BSA的PBS溶液封闭一小时，洗涤晾干后4℃保存待测，得到表一中相应的数据。测试液为0.1mol/L、pH7.0的含有硫堇的PBS磷酸盐溶液，加入的过氧化氢浓度为0.5mmol/L。
步骤(4)，选取表观形貌相近的碳纳米管电极，直接将与实施例2中相同量的酶标抗体滴涂至电极表面，室温下干燥成膜，洗涤晾干后4℃保存待测(实施例2、3中测试液的体积及加入的过氧化氢的量均相同)，测试后，得到表1中相应的数据。液为0.1mol/L、pH7.0的含有硫堇的PBS磷酸盐溶液，加入的过氧化氢浓度为0.5mmol/L。
表1
生物分子固定法 化学键共价交联法 物理吸附固定法
加双氧水后电流(μA) 5.808 5.486
菌液孵育后电流(μA) 3.217 5.259
电流变化△I(μA) 2.591 0.227
步骤(5)，采用与上述操作相同的化学键共价交联法、物理吸附法固定生物分子，在测试液中进行循环测试，得图4。测试液为0.1mol/L、pH7.0的含有硫堇的PBS磷酸盐溶液。
步骤(6)，取3个碳纳米管电极室温下分别置于有等量的EDC、NHS混合的PBS缓冲混合液中活化两个小时，洗涤；再把电极分别放置于含有4.5μL、13.5μL、22.5μL(浓度均为1.1μg/mL)酶标抗体的PBS缓冲液中，反应三个小时，洗涤；用含有0.2％BSA的PBS溶液封闭，洗涤晾干后4℃过夜。待加入0.5mmol/L过氧化氢测试后，用102cfu/mL的菌液37℃孵育半小时，测试，得到表二中的数据。测试液为0.1mol/L、pH7.0的含有硫堇的PBS磷酸盐溶液。
步骤(7)，选取6个碳纳米管电极，室温下分别进行活化、抗体偶联、封闭、洗涤等操作，各操作平行，洗涤晾干后4℃过夜。将其分别在不同pH的测试液中测试，得图4。测试液的pH分别为5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、7.8，加入的过氧化氢浓度为0.5mmol/L。
步骤(8)，选取6个碳纳米管电极，室温下分别进行活化、抗体偶联、封闭、洗涤等操作，各操作平行，洗涤晾干后4℃过夜。各电极分别进行加入过氧化氢前后的测试，得图5。测试液为0.1mol/L、pH7.4的含有硫堇的PBS磷酸盐溶液。加入的过氧化氢的浓度分别为0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L。
步骤(9)，选取5个碳纳米管电极，室温下分别进行活化、抗体偶联、封闭、洗涤等操作，各操作平行，洗涤晾干后4℃过夜。将其分别进行加入过氧化氢前后的测试，然后用105cfu/mL的菌液在不同温度下各孵育半小时，测试，得到表三中相应的数据。抗原抗体的孵育温度分别为20℃、25℃、30℃、37℃、40℃，测试液为0.1mol/L、pH7.4的含有硫堇的PBS磷酸盐溶液，加入的过氧化氢的浓度为0.7mmol/L。
本发明的实验结果如下：
图2为不同操作步骤下传感器的电化学表征图。
空白的碳纳米管电极表面没有处理，碳纳米材料的高导电性和电子传输速率使其在单位时间内的导电量比较大，表现出的电流峰值较高；将酶标抗体固定到电极表面后，蛋白分子的导电性及电子传递性相较于碳纳米材料而言下降许多，因此电流峰值下降；CV法测试中加入双氧水后，双氧水与酶标抗体上的HRP发生反应，在H2O2、HRP、Thi之间形成电子传输通道，使电流增加；将相应的一定量的抗原——VP在电极表面孵育一定时间后，由于形成了抗原抗体复合物，阻碍了电子在H2O2、HRP、Thi之间的传递，使电流下降。
图3及图4为化学键共价交联法和物理吸附固定法处理的传感器的稳定性测试。
由图3及图4看出，共价交联法在电极孵育前后还原峰的电流差值△I要大于物理吸附固定法。主要是由于共价交联法固定是通过基团之间的化学共价键连接的，结合上的抗体更稳定，且在交联剂EDC、NHS的作用下，大大提高了反应的速率；物理吸附固定法主要依靠分子间的静电吸附作用来结合分子，与共价键结合相比，结合量相对较少，在洗涤过程和测试过程中更易脱落、不稳定，因此结合的抗原较少，孵育后的电流值下降较少。
表二：抗体加入量的优化
注：ΔI指的是加入双氧水前后电流峰值的变化值。
根据电流的变化值ΔI可以看出，对于电极上的碳纳米管的量，抗体的加入量为4.5μL时，ΔI仍处于上升趋势；加入量为22.5μL时，ΔI已表现出下降的趋势；而当加入量为13.5μL时，相对另外两个加入量来说孵育前后还原峰的电流值变化最大，加入量相对比较适宜。
图5为在不同pH的缓冲液中免疫传感器在加入双氧水后的还原峰电流峰值的对比。
还原峰是在HRP催化过氧化氢以后产生了电子，发生了还原反应使电流量增加、流速加快而表现出来的，因此可用来反应电极表面发生反应的程度。根据还原峰峰值的电流变化，可以看出pH为7.8时，电流峰值最高，但是考虑到pH过高对酶及抗体会产生影响，故选取pH7.4作为适宜pH；
图6为向测试液中加入不同浓度双氧水前后还原峰电流峰值的对比。
从图中可以看出，H2O2浓度为0.7mmol/L时，还原峰的电流峰值最高。且这一浓度不是很高，对酶的活性没有影响，且还原峰峰值处对应的电压值的位置相对于其他浓度而言是相对稳定的区域。
表三：不同孵育温度下免疫传感器在孵育前后的电流变化。
由各电极的电流变化可以看出，随着孵育温度的升高，孵育前后电流的变化呈现出先上升后下降再升再将的趋势，在30℃处，△I出现了下降，随后又上升、下降。电流变化△I最大时对应的孵育温度为37℃，在40℃时△I下降，由于温度过高导致部分蛋白发生变性，抗原抗体结合位点消失。所以抗原抗体孵育温度的适宜值为37℃。
综上所述，化学键共价交联法固定生物分子要比物理吸附法更稳定；且在后期的优化中，13.5μL浓度为1.1μg/mL的抗体加入量配合pH7.4的测试缓冲液、0.7mmol/L的过氧化氢加入量及37℃的抗原抗体孵育温度有较好的实施效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备碳纳米管电极：所用的羧基化碳纳米管与氨基化碳纳米管在调整pH为2.5-4.5后，放入水中超声处理1-3小时，形成碳纳米管浓度为0.5mg/ml的稳定溶液；将电极基体先浸没于氨基化碳纳米管溶液20-60分钟，然后放入去离子水中1-2次，每次为1-5分钟，然后，浸没于羧基化碳纳米管溶液20-60分钟后，放入去离子水中1-2次，每次为1-5分钟，反复循环此过程，直至获得层叠的碳纳米管电极；
(2)再构筑碳纳米管表面纳米形貌：将步骤(1)获得的碳纳米管电极置于浓度为0.01-10mg/ml的金纳米颗粒溶胶中，并在-0.7至+0.7V的电压下以电沉积方式将金纳米颗粒固定在碳纳米管电极表面进行复合；
(3)制备免疫生物探针：用化学键共价交联法将步骤（2）获得的碳纳米管电极在浓度为500mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、浓度为250mg/mL的N-羟基硫代琥珀酰亚胺、浓度为0.01-0.1mmol/L且pH值为7.0-7.4的磷酸盐缓冲液的混合物中活化1到2小时，磷酸盐缓冲液洗涤2～3次；随后将活化后的碳纳米管电极置于含有1.0-1.8μg/mL的辣根过氧化物酶标记的副溶血性弧菌抗体或单增李斯特菌抗体的磷酸盐缓冲液中反应3小时，磷酸盐缓冲液洗涤2～3次；然后将电极放在含有0.2％-2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中封闭1小时，洗涤2～3次，晾干后置4℃冰箱中保存备用；
(4)结合免疫生物探针与待测物：将免疫生物探针与副溶血性弧菌或单增李斯特菌溶液在室温下孵育，缓冲液洗涤2～3次，并在待测液中加入具有氧化还原特性的硫堇后进行测定。
2.如权利要求1所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中是将已有铜电极的基板在氨基化碳纳米管溶液和羧基化碳纳米管溶液中反复交替浸泡数次，获得层层自组装碳纳米管电极。
3.如权利要求1所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中：
采用三电极体系以循环伏安法作为免疫电极表征和定性判定的方法，以免疫反应前、后还原峰电流下降的比例来判断被测样品中是否含有副溶血性弧菌或单增李斯特菌抗原；或者
采用电阻型生物探针，在不同浓度下，测量不同期电阻值的变换，获得定量数据。
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