CN113671176A - 一种目标物免疫层析试纸 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种目标物免疫层析试纸,包括纸基以及基板,其中:所述基板支撑所述纸基;所述纸基为一连续的整体结构;所述纸基包括样品区、测试区、对照区以及废液区;所述样品区内设置有目标物第一亲和物—信号探针复合物;所述测试区设置有目标物第二亲和物;所述对照区内设置有能够结合所述目标物第一亲和物的第三亲和物。本申请还公开了一种多目标物免疫层析试纸,同时对多种目标物进行检测。通过采用纸基替代传统的NC膜,本申请的免疫层析试纸在具有良好目标物检测的基础上,具有成本低、污染小的优势。
Description
技术领域
本申请涉及免疫分析领域,更具体地,涉及一种目标物免疫层析试纸。
背景技术
免疫分析是一种应用广泛的生化分析技术。其通过对包括对蛋白质、核酸、病毒等生命物质目标物进行定性或者定量分析,来得到待分析目标的诊断结果。免疫层析是免疫分析技术中的一种,其通常利用免疫层析试纸对目标物进行检测。常规的免疫层析试纸包括硝酸纤维素膜(Nitrocellulose membrane,NC膜)在内的多层结构。NC膜在接触到包含目标物的溶液后,由于强的毛细管作用,目标物溶液将自动在NC膜上流动,进而到达NC膜上的测试区。测试区通常包括能够识别目标物的蛋白质(例如,抗体)。NC膜具有天然的亲蛋白质特性,因此,上述抗体无需额外操作即可固定于测试区内。
尽管NC膜具有上述优势,但仍然有自身的局限性。其本身成本高且易碎易燃,这提高了在进口或运输NC膜上的成本,进一步提高了免疫层析试纸的制造成本。此外,NC膜自身具有毒性,一次性使用的免疫层析试纸的丢弃不可避免造成环境问题。至少因为上述缺陷,业内努力尝试NC膜可能的替代材料。然而,NC膜上述的优势使其难以被替代。
发明内容
鉴于此,本申请提供了一种目标物免疫层析试纸,其无需NC膜且能够保持优异的免疫层析效果。
本申请的目标物免疫层析试纸包括纸基以及基板,其中:所述基板支撑所述纸基;所述纸基为一连续的整体结构;所述纸基包括样品区、测试区、对照区以及废液区;所述样品区内设置有目标物第一亲和物—信号探针复合物;所述测试区设置有目标物第二亲和物;所述对照区内设置有能够结合所述目标物第一亲和物的第三亲和物。
可选地,所述目标物第二亲和物连接纸基亲和物,所述纸基亲和物连接所述测试区的纸基,所述目标物第二亲和物通过所述纸基亲和物而被固定于所述测试区。
可选地,所述纸基亲和物包括硅胶颗粒、壳聚糖、高碘酸钠、多聚赖氨酸、邻苯三酚、单宁酸中的至少一种。
可选地,还包括玻璃纤维膜;所述玻璃纤维膜连接于所述纸基的样品区,与所述样品区共同承接目标物溶液。
可选地,所述样品区中部具有开孔;所述玻璃纤维膜设置于所述开孔内且形状与所述开孔相匹配;所述玻璃纤维膜基本与所述样品区处于同一平面。
可选地,所述废液区基本上被配置为弧形,所述弧形角度大于180度且所述弧形的开口方向远离所述样品区。
可选地,所述样品区与所述测试区之间具有第一连接区,所述第一连接区在靠近所述测试区的方向上宽度逐渐减小。
可选地,所述对照与所述测试区之间具有第二连接区,所述第二连接区在远离所述测试区的方向上宽度逐渐增大。
可选地,所述目标物第一亲和物和所述目标物第二亲和物分别包括抗体、DNA适配体、RNA适配体中的至少一种;所述信号探针包括比色信号探针和荧光信号探针中的至少一种。
本申请还公开了多目标物免疫层析试纸,包括多个如上所述的目标物免疫层析试纸,并且,多个目标物免疫层析试纸共用同一个所述样品区。
通过采用纸基替代传统的NC膜,本申请的免疫层析试纸在具有良好目标物检测的基础上,具有成本低、污染小的优势。
附图说明
图1是根据本申请一些实施例的免疫层析试纸的示意图。
图2是根据本申请一些实施例的免疫层析试纸检测目标物的示意图。
图3是根据本申请一些实施例的纸基亲和物的作用原理以及效果示意图。
图4是根据本申请一些实施例中包括纸基亲和物和未包括纸基亲和物的纸基测试区纤维的示意图。
图5是本申请一些实施例中包括玻璃纤维膜在内的免疫层析试纸示意图。
图6是图1的免疫层析试纸从样品区到对照区的局部放大图。
图7是本申请一些实施例中多目标物免疫层析试纸的示意图。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案及效果更加清楚、明确,以下参照附图并举实施例对本申请进一步详细说明。
首先参考图1,示出了本申请一些实施例的免疫层析试纸的示意图。
如图1所示,该免疫层析试纸包括纸基1以及基板2。
其中基板2用于支撑纸基1。其构造方式可以是现有技术中任意的。例如,基板2的材质可以选择硬质塑料片。在可替代实施例中,基板2还可以是金属片或玻璃片,或者上述材料的复合物。在此不再进行穷举。可以理解,能对柔软的纸基1起到支撑作用的材质均可。而基板2与纸基1之间的结合方式,可以通过胶进行粘合。或者,基板2可以通过夹持的方式来固定纸基1。例如,基板2可以包括双层的塑料片,通过封塑的方式对纸基1进行封装。这样的配置方式可以起到固定纸基1同时避免纸基1损坏而造成试纸失效的不良后果。
纸基1为一连续的整体结构。该纸基1可以包括样品区3、测试区4、对照区5以及废液区6。其中,样品区3内设置有目标物第一亲和物—信号探针复合物(图1未示出)。测试区4设置有目标物第二亲和物。对照区5内设置有能够结合所述目标物第一亲和物的第三亲和物。
发明人发现,通过纸基1替代传统的NC膜同样能够实现免疫层析的效果。而纸基替代NC膜的优势是显而易见的。纸是日常生活中随意可得的而且造价低廉的物质。相比于NC膜,其对环境的污染也更小。因此,利用纸基替代NC膜,不仅适用于工业产业,且能够更好的保护环境。
进一步地,发明人发现,通过选择纸基,本申请的试纸无需像传统的免疫层析试纸那样,不同的功能区需要选择不同材质的材料来构成,例如传统的免疫层析试纸的NC膜用于将目标物溶液吸至测试区或对照区,但其他每个区域仍然需要不同的材质满足不同的功能。各不同材质的不同区域需要通过搭设拼接在一起。在本申请的试纸主体结构中,纸基是连续的整体结构。纸基可以同时完成样品区、测试区、对照区以及废液区的功能。这在制造的简便性上的优势是显而易见的,一体的结构仅通过简单的裁切加工即可完成,无需繁复的过程。
应当注意,上文所述的连续整体结构,是指纸基在结构上连续无接缝。该连续整体结构并不限定纸基的形状也是固定不变的。在本申请的教导下,纸基形状可以是变化的。下文将会进行详细描述。
此外,还应注意,纸基的含义是由纸制成的基体结构。需要阐明,本申请所称的纸,是指日常生活中具有一般含义的纸。也即,主要成分为植物纤维的材质。植物纤维可以是包括纤维素、半纤维素、木素在内的纤维素成分。而纸的具体制造工艺、原料来源,本申请不做限定。此外,纸的成分是复杂的,除植物纤维主要成分外,还可能包括非主导地位的其他成分,本申请不再一一列举。
本申请所述的目标物种类可以是任意的。例如,生化分析中常规的各种抗原、抗体、生命标志物、病毒、细菌等。在一些实施例中,上述目标物可以是某些疾病相关的抗原,例如,乙型肝炎表面抗原。在另外一些实施例中,上述目标物还可以是某些病毒或细菌,例如,COVID-19病毒。在其他一些实施例中,上述目标物还可以是某些生命标志物,例如,人绒毛膜促性腺激素(Humanchorionic gonadotropin,hCG)。可以理解,本申请所公开的上述免疫层析试纸,可以对任意目标物进行检测,在此不再穷举。下文将以hCG为例对本申请的试纸有效性进行详细描述,但该示例并不对本申请试纸的通用性做出限定。
进一步,可以根据上述目标物的不同选择相应的目标物第一亲和物以及目标物第二亲和物。目标物第一亲和物和目标物第二亲和物可以分别包括抗体、DNA适配体、RNA适配体中的至少一种。在一些实施例中,目标物第一、二亲和物可以分别是目标物的第一抗体和第二抗体。在另外一些实施例中,目标物第一、二亲和物可以分别是目标物的第一适配体和第二适配体。在其他一些实施例中,目标物第一、二亲和物还可以分别是目标物的抗体和适配体。上述抗体和适配体的选择方式可以是多样的,可以选择现有技术中已知抗体和/或适配体,还可以通过免疫方法(例如,ELISA)来进行适配体或者抗体的筛选。
上述的信号探针同样可以是多样的。信号探针的作用是在目标物存在的情况下产生信号被用户所得知,从而起到检测目标物的作用。在本申请上述教导下,信号探针的种类可以自由选择。例如,信号探针可以包括比色信号探针和荧光信号探针中的至少一种。在一个示例中,比色信号探针可以是胶体金颗粒。胶体金颗粒可以用于比色信号的产生,以便在肉眼观察时能够直接感知颜色变化判断目标物检测是否存在阳性信号。此外,胶体金颗粒同样能够被用于比色信号的定性分析。类似地,荧光基团的种类可以是任意的,例如,可以是Cy3、Cy5、量子点、TRT、ROX、JOE、FAM、HEX、VIC和Texas Red中的至少一种。上述荧光基团可以在特定波长激发光下产生荧光信号而被仪器检测,用于目标物定量分析。不再对比色信号探针和荧光信号探针进行穷举。
进一步地,目标物第一亲和物—信号探针复合物可以由上述目标物第一亲和物和信号探针通过结合来生成。上述结合的方式,可以是目标物第一亲和物自身官能团与信号探针官能团的共价键结合,还可以是通过修饰的方式对二者进行官能团修饰从而利于目标物第一亲和物的信号探针结合。上述修饰的方式可以是现有技术任意的,不再赘述。
可以理解,第三亲和物是能够和上述目标物第一亲和物具有亲和力的任何物质。例如,第三亲和物可以是能够与上述目标物第一亲和物特异性结合的抗体。这样,当目标物第一亲和物—信号探针复合物流经第三亲和物所在区域时,复合物能够与第三亲和物特异性结合进而产生上述的比色信号或者荧光信号,从而验证免疫层析的毛细管现象是否发生,避免假阴性信号产生。
下面参考图2,示出了本申请一些实施例的免疫层析试纸检测目标物的示意图。图2以hCG作为目标物,阐释目标物检测过程中本申请免疫层析试纸的检测原理。应当注意,如上文所述,目标物还可以是其他任意生命分子。
如图2所示,免疫层析试纸包括基板21和纸基22。其中,纸基22可以包括样品区221、测试区222、对照区223以及废液区224。
其中,样品区221内设置有目标物第一亲和物231—信号探针232(胶体金)复合物。测试区222内设置有目标物第二亲和物24。对照区223内设置有能够结合所述目标物第一亲和物231的第三亲和物25。进一步,当在样品区221加入待测目标物26(hCG),目标物26与目标物第一亲和物231特异性结合,进而形成了目标物26—第一亲和物231—信号探针232复合物。由于毛细管作用,该复合物将通过测试区222以及对照区223。在通过测试区222时,复合物被目标物第二亲和物24捕获,产生信号。可以理解,单次免疫层析检测中,第一亲和物231—信号探针232复合物的量相比于目标物26是过量的,过量的复合物继续前进经过对照区223而被第三亲和物25捕获,再次产生信号。如图2所示,阳性图例中,测试区222和对照区223同时产生信号;阴性图例中,仅对照区223产生信号。此外,尽管图2未示出,可以理解若测试区222和对照区223均无信号产生,则证明侧流层析结果不可靠,这也正是对照区223的对照作用的参考标准。
需要说明,图2仅用于清楚地阐明本申请的试纸作用机理,尤其是纸基各部分的作用。各生物分子的尺寸相较于试纸的尺寸是十分微观的,相应地,其数量也是巨大的,图2不做尺寸以及数量的限定。
此外,尽管本申请对纸基划分出了各个区域,但如上文所述,各个区域之间包括连续的整体结构,在物理上并非是完全独立存在的。
上述免疫层析试纸能够在低成本、低污染的前提下对目标物进行快速的检测。例如,为了达到定量的目的,传统基于NC膜的免疫层析试纸通常需要10-20分钟左右的分析时间。而基于本申请的纸基免疫层析试纸,分析时间可以被缩短至3-5分钟左右。这主要得益于纸基的强吸水性能。由于纸基的较大纤维间隙,溶液在纸基的流速明显大于NC膜,这极大程度缩短了免疫层析的时间。
发明人在研究中发现,在目标物浓度十分低的情况下,单纯的纸基难以对目标物进行检测。发明人在进一步研究中发现,上述问题原因是纸基对于蛋白质的结合能力是有限的。诸如抗体在内的蛋白质,作为测试区和对照区的亲和物时,难以被固定。这种情况下,当目标物溶液通过毛细管作用流经测试区和对照区,上述蛋白质类亲和物将随着溶液一起流动,导致信号探针的损失,进而削弱了目标物检测灵敏度。另一个原因是,纸的孔隙通常是较大的,导致毛细管作用下溶液流速较快,目标物因此在测试区无法与亲和物充分反应,导致无法被充分捕获。而现有技术中,无法通过表面修饰技术同时解决上述问题。
至少基于上述发明人发现的原因,在一些实施方式中,发明人对上述免疫层析试纸进行了改进。
具体而言,本申请的一些实施例中的试纸还包括纸基亲和物。所述目标物第二亲和物连接所述纸基亲和物,所述纸基亲和物连接所述测试区的纸基,所述目标物第二亲和物通过所述纸基亲和物而被固定于所述测试区。
这样的设置方式,能够提高目标物第二亲和物(例如,抗体)在测试区的纸基上的结合牢固程度,进而提高目标物的检测灵敏度。
进一步,发明人发现,上述纸基亲和物可以包括硅胶颗粒、壳聚糖、高碘酸钠、多聚赖氨酸、邻苯三酚、单宁酸中的至少一种。
选择上述纸基亲和物,一方面这些亲和物能够很容易地与纸基的孔隙,填充纸基的孔隙,从而形成空间位阻而达到锚定的效果,另一方面,上述物质也容易与目标物第二亲和物进行修饰、结合。基于上述填充效果以及结合效果,上述纸基亲和物一方面减小了测试区纸基孔隙从而减缓了溶液在测试区的流速、提高了目标物与目标物第二亲和物的结合效率,另一方面同时确保了目标物第二亲和物不会随着溶液而脱离测试区。
下面以硅胶颗粒作为示例,具体描述纸基亲和物的作用原理以及实际效果。
首先参考图3,示出了纸基亲和物的作用原理以及效果示意图。首先,如图3的A区域所示,纸基亲和物31以硅胶颗粒为例进行说明。其连接了目标物第二亲和物32(以hCG第二抗体为例),目标物第二亲和物32进一步捕获hCG—目标物第一亲和物—信号探针形成夹心结构。上述纸基亲和物31。此外,纸基亲和物31和目标物第二亲和物32之间可以通过连接物33进行连接。连接物33可以是本领域中任意的,例如聚乙二醇(PEG)。
如上文所述,该修饰将对低浓度目标物检测起到明显的增强作用。例如,如图3的B区域所示,分别试验了目标物(hCG)在三组不同浓度下10ng/mL、25ng/mL、100ng/mL的以胶体金作为信号探针的比色检测结果。可以看出在高浓度情况下,采用纸基亲和物31(修饰组)以及未采用纸基亲和物31(未修饰组)结果差别并不明显。但在低浓度下,例如10ng/mL,未修饰组已无肉眼可见的比色信号,但采用纸基亲和物31时仍能够产生易于观察的比色信号。
进一步,本申请还对上述信号进行了定量分析。在一个非限定实施例中,本申请通过仪器进行比色信号的检测,得到测试区的图像,进而将有色图片转化为灰色,再分解成单独的RGB颜色来计算标准化的灰色强度,然后结合各个数据点的绿色和蓝色强度来得到测试区的信号强度数值。结果如图3的C区域所示,结果同样验证了,经过上述修饰的试纸,具有更高的灵敏度。
上述纸基亲和物31对于纸基孔径的适当阻塞效果得到了进一步验证。参考图4,示出了本申请一些实施例中包括纸基亲和物和未包括纸基亲和物的纸基测试区纤维的示意图。其中,A、D区域是不包括纸基亲和物的纸基测试区纤维的扫描电子显微镜(SEM)照片,B、E区域是包括了纸基亲和物的纸基测试区纤维的照片,C、F区域是包括了纸基亲和物的纸基测试区纤维在不同分度值下的X摄像能谱分析(EDS)照片。图4可以明显看出,经过了上述纸基亲和物的修饰,纸基的纤维形貌发生了明显变化。具体而言,纸基纤维的间隙变得更小。因此,溶液在测试区的滞留时间将得到延长。
在本申请的一些实施例中,除纸基外,本申请的试纸还包括玻璃纤维膜。玻璃纤维膜连接于所述纸基的样品区,与所述样品区共同承接目标物溶液。
上述玻璃纤维膜可以进一步提高本申请的试纸的灵敏度。发明人发现,本申请的纸基与信号探针(例如胶体金)具有天然的高亲和力。高的亲和力可能导致目标物第一亲和物—信号探针复合物从样品区到测试区移动的延迟。尤其是在上述目标物第一亲和物—信号探针复合物长时间置于样品区的情况下。因此,上述方案中,设置玻璃纤维膜可以降低信号探针与样品区的亲和力,使得目标物溶液能够带动目标物第一亲和物—信号探针复合物移动。
上述玻璃纤维膜的设置方式可以是任意的。在一个实施例中,其可以如图5所示,示出了包括玻璃纤维膜在内的免疫层析试纸示意图。
其中,样品区51中部具有开孔52。玻璃纤维膜53设置于开孔52内且形状与开孔52相匹配。并且,玻璃纤维膜53可以基本与样品区51处于同一平面。
这样的设置方式,保证了信号探针不会被样品区的纸牢固结合而导致免疫测试失效。应当注意,开孔52的形状可以是如图5所示的圆形,还可以是其他任意的形状,不再赘述。
为了进一步提高样品区上的物质向测试区的转移效率。本申请的一些实施例中对废液区的结构进行了改进。可以继续参考图5所示,废液区54基本上被配置为弧形(或者,扇形),所述弧形角度大于180度且弧形的开口方向远离所述样品区51。
发明人发现,这样的形状设计,将利于毛细管作用发挥更为出色,通过流体前区的持续增流,最大程度的提高流速并避免流速自然衰减,使样品很好地沿着纸基传输,从而增强信号强度。
基本上为弧形的含义是易于理解的,本申请并不限定弧形的具体弧度,该弧形的形状是可以调整的。此外,大于平角的弧形角度将利于增流效果。具体的弧形角度可以在本申请教导下进行选择。
本申请一些实施例中对测试区的结构进行了改进。如图6所示,示出了图1的免疫层析试纸从样品区到对照区的局部放大图。
综合参考图1、图6,测试区4是设置于样品区和对照区之间的。
在一些实施例中,样品区3与测试区4之间具有第一连接区61,所述第一连接区61在靠近测试区4的方向上宽度逐渐减小。
这样的方式,能够确保溶液在从样品区3流向测试区4时,流速由于纸基宽度的减小而变缓,从而能够提高目标物与测试区4上目标物第二亲和物的结合时间,进而提高检测灵敏度。宽度减小的方式可以是任意的,例如,可以将第一连接区61配置为梯形。此外,上述第一连接区61还可以被配置为弧形。
在一些实施例中,测试区3与对照区5之间具有第二连接区62,所述第二连接区62在远离测试区3的方向上宽度逐渐增大。
这样的方式,能够确保溶液在从测试区3流出时,由于具有较小的出口而不至于流速过快,从而能够进一步提高目标物与测试区3上目标物第二亲和物的结合时间,进而提高检测灵敏度。宽度增大的方式同样可以是任意的,不再赘述。
本申请的试纸,可以进行多目标物的同时检测。如图7所示,示出了本申请一些实施例中多目标物免疫层析试纸的示意图。该多目标物免疫层析试纸包括多个如上文任意实施例所述的目标物免疫层析试纸,并且,多个目标物免疫层析试纸共用同一个所述样品区。
这样的配置方式,可以实现多个目标物的同时高通量检测。
在一个实施例中,上述多目标物免疫层析试纸可以包括多个目标物免疫层析试纸71、72、73,上述多个试纸共用同一个样品区74。这样,当需要对同一待测物中的多个潜在目标物进行检测时,仅需将待测物溶液滴加至样品区74,溶液即可在多个试纸分别进行免疫层析反应。不同的试纸可以是对不同的目标物具有识别特性的,相应地,上述策略即可用于多种目标物的同时检测。上述多个目标物免疫层析试纸的数量可以自由选择。
本申请成功开发了一种全新的可以替代传统的基于NC膜的免疫分析检测平台。该检测平台可以在定性和半定量免疫分析。本申请为免疫层析技术提供了更加简便、经济,环保的检测平台,且能实现更多物质的同时检测。
Claims (10)
1.一种目标物免疫层析试纸,其特征在于,所述免疫层析试纸包括纸基以及基板,其中:
所述基板支撑所述纸基;
所述纸基为一连续的整体结构;所述纸基包括样品区、测试区、对照区以及废液区;所述样品区内设置有目标物第一亲和物—信号探针复合物;所述测试区设置有目标物第二亲和物;所述对照区内设置有能够结合所述目标物第一亲和物的第三亲和物。
2.根据权利要求1所述的目标物免疫层析试纸,其特征在于:
还包括纸基亲和物;所述目标物第二亲和物连接所述纸基亲和物,所述纸基亲和物连接所述测试区的纸基,所述目标物第二亲和物通过所述纸基亲和物而被固定于所述测试区。
3.根据权利要求2所述的目标物免疫层析试纸,其特征在于:
所述纸基亲和物包括硅胶颗粒、壳聚糖、高碘酸钠、多聚赖氨酸、邻苯三酚、单宁酸中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的目标物免疫层析试纸,其特征在于:
还包括玻璃纤维膜;所述玻璃纤维膜连接于所述纸基的样品区,与所述样品区共同承接目标物溶液。
5.根据权利要求4所述的目标物免疫层析试纸,其特征在于:
所述样品区中部具有开孔;所述玻璃纤维膜设置于所述开孔内且形状与所述开孔相匹配;所述玻璃纤维膜基本与所述样品区处于同一平面。
6.根据权利要求1所述的目标物免疫层析试纸,其特征在于:
所述废液区基本上被配置为弧形,所述弧形角度大于180度且所述弧形的开口方向远离所述样品区。
7.根据权利要求1所述的目标物免疫层析试纸,其特征在于:
所述样品区与所述测试区之间具有第一连接区,所述第一连接区在靠近所述测试区的方向上宽度逐渐减小。
8.根据权利要求1或7所述的目标物免疫层析试纸,其特征在于:
所述对照区与所述测试区之间具有第二连接区,所述第二连接区在远离所述测试区的方向上宽度逐渐增大。
9.根据权利要求1所述的目标物免疫层析试纸,其特征在于:
所述目标物第一亲和物和所述目标物第二亲和物分别包括抗体、DNA适配体、RNA适配体中的至少一种;所述信号探针包括比色信号探针和荧光信号探针中的至少一种。
10.一种多目标物免疫层析试纸,其特征在于,包括多个如权利要求1-9任一项所述的目标物免疫层析试纸,并且,多个目标物免疫层析试纸共用同一个所述样品区。
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