CN107462717A - 一种淡水鱼细菌性疾病病原体快速诊断试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明具体公开了一种淡水鱼细菌性疾病病原体快速诊断试剂盒，包括胶体金试纸，所述试纸包括样品层1、胶体金标记层2、检测反应层3、吸水层4和加样孔10，所述胶体金标记层上包被有抗目标菌的抗体，所述检测反应层上设置有检测线A和质控线B。本发明首次将鱼鳔作为生物膜结构应用于生物技术的检测技术中，鱼鳔具备硝酸纤维素膜和一些常规生物膜的基本结构，符合生物膜的基本要求，且鱼鳔的来源容易，成本低廉，将其应用到生物制品中也是一种优质的生物膜，大大降低了生物制品中膜部分的成本，提高经济效益。

Description

一种淡水鱼细菌性疾病病原体快速诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种淡水鱼细菌性疾病病原体快速诊断试剂盒。
背景技术
我国淡水鱼养殖业非常发达，近年来全国水产品产出达到4000余万吨，我们常说的四大家鱼青鱼、草鱼、鲢鱼和鳙鱼，因为适应性强，全国各大水系如淡水湖泊、河流、水库、池塘里均可养殖；生长快、产量高，互相之间也可以混养，鱼肉肉质鲜嫩，营养丰富，价格适中，是广大消费者主要的水产消费品。
淡水鱼的细菌学疾病的养殖户的一大挑战，传统的细菌学疾病的诊断，一般需要采集相应部位的样本，进行细菌学检验以明确病因，常规的细菌学检验通常是细胞培养或者染色镜检，这些常规的方法，通过耗时较长，较容易因为污染或者操作失误造成严重的结果偏差，从而影响结果的判断，因此，急需开发一种快速的，准确率高的检验方法。
硬骨鱼类，大多数都有鳔。鱼鳔的体积约占身体的5％左右。其形状有卵圆形、圆锥形、心脏形、马蹄形等等。鱼鳔里充填的气体主要是氧气、氮气和二氧化碳，氧气的含量最多。但是在加工的过程中，大量的鱼鳔被作为下脚料而废弃。鱼鳔中含有大量的胶原蛋白，并且基于其天然的低毒性、生物降解性、低免疫活性、保湿性和营养性而广泛地应用于食品工业、化妆品、生物医学材料等领域。研究表明，鱼鳔是一种具备膜结构以及膜功能的生物资源，如果将鱼鳔应用到生物领域，作为一种生物膜，代替现有的硝酸纤维素膜或者PVDF膜，将会大大降低相应生物产品的制造成本，提高资源利用率。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明提供一种淡水鱼细菌性疾病病原体快速诊断试剂盒，以解决上述的技术问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种淡水鱼细菌性疾病病原体快速诊断试剂盒，包括胶体金试纸，所述试纸包括样品层1、胶体金标记层2、检测反应层3、吸水层4和加样孔10，所述胶体金标记层上包被有抗目标菌的抗体，所述检测反应层上设置有检测线A和质控线B，所述检测线上包被有目标菌抗原，所述质控线包被有羊抗兔IgG，所述检测用金标抗体可以与检测用包被抗原结合反应并显色，且检测用金标抗体上只有一个与抗原特异结合的位点；所述样品层、胶体金标记层和检测反应层按照从里至外、从上至下的顺序依次结合在背衬板同一面上，胶体金标记层和检测反应层的端部重叠；所述吸水层结合在检测反应层的另一端。
附图说明
图1是本发明的结构示意图。
其中：样品层1、胶体金标记层2、检测反应层3、吸水层4、加样孔10、检测线A、质控线B。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
一种淡水鱼细菌性疾病病原体快速诊断试剂盒，包括胶体金试纸，如图1所示，所述试纸包括样品层1、胶体金标记层2、检测反应层3、吸水层4和加样孔10，所述胶体金标记层上包被有抗目标菌的抗体，所述检测反应层上设置有检测线A和质控线B，所述检测线上包被有目标菌抗原，所述质控线包被有羊抗兔IgG，所述检测用金标抗体可以与检测用包被抗原结合反应并显色，且检测用金标抗体上只有一个与抗原特异结合的位点；所述样品层、胶体金标记层和检测反应层按照从里至外、从上至下的顺序依次结合在背衬板同一面上，胶体金标记层和检测反应层的端部重叠；所述吸水层结合在检测反应层的另一端。
本发明首次将鱼鳔作为生物膜结构应用于生物技术的检测技术中，鱼鳔具备硝酸纤维素膜和一些常规生物膜的基本结构，符合生物膜的基本要求，且鱼鳔的来源容易，成本低廉，将其应用到生物制品中也是一种优质的生物膜，大大降低了生物制品中膜部分的成本，提高经济效益。
优选地，所述目标菌包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌或者革兰氏阴性阳性混合菌。
柱状黄杆菌(Flavobacterium cloumnare)主要危害鱼类的鳃，也可引起体表溃疡。主要危害草鱼、青鱼，常和传染性肠炎、出血、赤皮并发预防。
优选地，所述目标菌为柱状黄杆菌。
本发明严格控制胶体金标抗体、目标菌抗原和羊抗兔IgG的比例。具体应用时，可根据不同的检测线或参数线的显色与否以及颜色的深浅，判定样液中是否含有目标菌，以及含量的多与少，实现半定量检测。
优选地，所述检测线为1～4条，质控线为1～3条。
更优选地，所述检测线为1～3条，质控线为1～2条。
优选地，所述胶体金标记层上包被有抗目标菌抗体，是以目标菌外膜蛋白作为抗原免疫动物后制备获得的。
优选地，所述样品层为吸水性良好的材料制成；所述背衬板为塑料制成。
优选地，所述胶体金标记层和检测反应层的材料为鱼鳔制备的生物膜。
优选地，所述胶体金标记层为青鱼、草鱼或鲢鱼制备的生物膜，所述检测反应层为草鱼、鲢鱼或鳙鱼制备的生物膜。
本发明的胶体金试纸中的胶体金标记层和检测反应层均使用鱼鳔为原料制备的生物膜，鱼鳔膜具有良好的透气性和透水性,价廉易得,机械强度高且韧性好,可以为酶的固定化提供优良的生物基质。
当两条检测线A1和A2均显红色时，则样品为阴性(即不含目标菌)；当检测线A1显色，检测线A2不显色时，则样品中含有目标菌，但其浓度不高；当两条检测线均不显色时，则样品中目标菌的浓度很高，以此进行半定量检测。
当检测线A颜色深于参考线B3时，则样品为阴性(不含目标菌或极微量)；当检测线A颜色深于B3浅于参考线B2时，则样品含有目标菌，浓度比较低；当检测线A颜色深于B2浅于B1时，则样品中含有目标菌，浓度比较高；当检测线A不显色时，则样品中含有目标菌，浓度非常高，以此进行半定量检测。
结果判断标准：
质控线的作用是：无论样品溶液中是否含有目标菌，胶体金标记层包被的金标抗体上移到达质控线时都可以与质控线上的IgG结合，聚集形成肉眼可见的红色颗粒，质控线始终显色，如果质控线不显色，表示本次测试无效。
作为优选地实施例，以下将详细介绍鱼鳔应用于生物膜的方法，包括以下步骤：
S1.将收集到的鱼鳔保湿，具体为定期喷淋37℃去离子水，后续操作过程保持鱼鳔保持湿润的状态；
S2.轻轻地将半球状鱼鳔沿着经线切开、摊平，即将鱼鳔平面化；
S3.将上述步骤的鱼鳔置于烧杯中，加入适量去离子水，将烧杯置于振荡器上，46℃，100～120rpm，振荡1～2h，振荡结束后，将蛋壳膜置于流动缓慢的水中漂洗，清除膜表面杂质；
S4.将上述步骤的鱼鳔置于平面上，使用镊子将鱼鳔分层外膜和内膜；
S5.将外膜置于50mMTris-HCl(pH7.5)，10mM CaCl2溶液中，置于磁力搅拌器上，孵育40～55℃，30min，每100ml上述溶液加入20mg/ml的蛋白酶K 100ul，继续孵育10～20min；
S6.将内膜置于50mMTris-HCl(pH7.0)，10mM CaCl2溶液中，置于磁力搅拌器上，孵育40～55℃，10min，每100ml上述溶液加入20mg/ml的蛋白酶K 10ul，继续孵育5～10min；
S7.步骤S5和S6反应结束后，快速取出，置于流动的自来水中冲洗3～5min，之后使用75％酒精清洗3～5次，每次5min；
S8.上述步骤的膜使用去离子水清洗3～5次，每次3min，结束后4℃，保湿保存备用。
本发明的应用鱼鳔作为膜结构的胶体金试纸，金标抗体上只有一个与抗原特异结合的位点，具有特异性强；灵敏度高，阳性率基本达到100％，检测速度快、通量大、操作简单方便、颜色稳定、检测温度适宜范围宽、试纸保质期长和成本低廉等优点，并能够实现半定量检测。该快速检测试纸条在4～50℃都可使用，5～10min以后便可观察结果，适合于食品药品、环保、检验检疫等部门对样品中的革兰氏菌的进行快速检测。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种淡水鱼细菌性疾病病原体快速诊断试剂盒，其特征在于，包括胶体金试纸，所述试纸包括样品层1、胶体金标记层2、检测反应层3、吸水层4和加样孔10，所述胶体金标记层上包被有抗目标菌的抗体，所述检测反应层上设置有检测线A和质控线B，所述检测线上包被有目标菌抗原，所述质控线包被有羊抗兔IgG，所述检测用金标抗体可以与检测用包被抗原结合反应并显色，且检测用金标抗体上只有一个与抗原特异结合的位点；所述样品层、胶体金标记层和检测反应层按照从里至外、从上至下的顺序依次结合在背衬板同一面上，胶体金标记层和检测反应层的端部重叠；所述吸水层结合在检测反应层的另一端。
2.根据权利要求1所述的淡水鱼细菌性疾病病原体快速诊断试剂盒，其特征在于，所述目标菌包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌或者革兰氏阴性阳性混合菌。
3.根据权利要求2所述的淡水鱼细菌性疾病病原体快速诊断试剂盒，其特征在于，所述目标菌为柱状黄杆菌。
4.根据权利要求3所述的淡水鱼细菌性疾病病原体快速诊断试剂盒，其特征在于，所述检测线为1～4条，质控线为1～3条。
5.根据权利要求4所述的淡水鱼细菌性疾病病原体快速诊断试剂盒，其特征在于，所述胶体金标记层上包被有抗目标菌抗体，是以目标菌外膜蛋白作为抗原免疫动物后制备获得的。
6.根据权利要求5所述的淡水鱼细菌性疾病病原体快速诊断试剂盒，其特征在于，所述样品层为吸水性良好的材料制成；所述背衬板为塑料制成。
7.根据权利要求6所述的淡水鱼细菌性疾病病原体快速诊断试剂盒，其特征在于，所述胶体金标记层和检测反应层的材料为鱼鳔制备的生物膜。
8.根据权利要求7所述的淡水鱼细菌性疾病病原体快速诊断试剂盒，其特征在于，所述胶体金标记层为青鱼、草鱼或鲢鱼制备的生物膜，所述检测反应层为草鱼、鲢鱼或鳙鱼制备的生物膜。
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