CN105424931A - 幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置及其制备方法 - Google Patents

幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置及制法，属于医疗检测设备领域。由固相有纯化的高特异性抗人IgM、IgG抗体和抗幽门螺杆菌尿素酶抗体的硝酸纤维素膜、吸附有胶体金标记幽门螺杆菌尿素酶抗原的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料粘贴制成。采用多聚赖氨酸处理液对硝酸纤维素膜进行预处理，将抗人IgM与IgG抗体先与二氧化硅纳米颗粒结合再吸附到硝酸纤维素膜上，以及配制合适的喷金缓冲液和样品垫处理液，在保证免疫胶体金释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本。检测试纸灵敏度高、特异性强、操作简便省时、实用性强。

Description

幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置及其制备方法
技术领域
本发明涉及医疗检测设备领域，特别涉及一种幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置及其制备方法，可实现幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG的灵敏、特异、快速检测。
背景技术
幽门螺杆菌(Hp)感染在慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等消化道疾病致病中起重要作用。感染幽门螺杆菌后，多数人症状较轻或无症状，不加治疗和延缓治疗的病情会严重，因此研究Hp感染在早期检测具有重要意义。根据抗体产生规律，血清IgM在幽门螺杆菌感染后2～4周出现，然后IgG在6～8周出现。IgM一般在2～6个月后完全消失。IgG通常缓慢减少。因此检测IgM抗体有助于对疾病早期诊断。传统幽门螺杆菌尿素酶抗体检测方法只能检测针对幽门螺杆菌尿素酶抗体，不能对抗体进行分类。
流行病学调查证明，我国成人幽门螺杆菌感染率在50％以上。在幽门螺杆菌感染的检测中，细菌培养、组织病理学检查、尿素酶试验、呼气试验等方法或因为给患者造成的侵入性痛苦，或需要一定的条件和技术，或因为需要特殊仪器，或因为费用昂贵等，其临床推广及多次重复追踪复查受到限制。而血清学检测因其非侵入性、快速、准确，可同时处理大量标本，检测不同类型的抗体，在临床检验、基础研究中倍受青睐。20世纪80年代兴起的胶体金免疫层析检测，操作简单快捷、结果清晰易于判断、无需复杂的实验技能和特殊设备，具有广泛应用前景。
胶体金免疫层析技术(goldimmunochromatographyassay，GICA)是一种将胶体金标记技术和蛋白质层析技术结合的以微孔滤膜为载体的固相膜免疫分析技术。胶体金免疫层析技术是一种常用的免疫层析检测方法，由于其操作简单、省时、制造成本较低、结果易判读等特点，非常适合于现场检测，广泛用于生物、医药、食品等领域。由于胶体金免疫层析技术是一步完成检测，因此检测过程的干扰因素较多，其灵敏度低是限制胶体金免疫层析应用范围的主要因素，传统的胶体金免疫层析技术的检测限高于ELISA等方法。
在胶体金免疫层析检测中，蛋白质固着于硝酸纤维素膜(NC膜)作为待测样本的捕获试剂。由于检测结果完全取决于捕获试剂在膜上达到良好的吸附效果，因此蛋白质在膜上均一、良好的吸附对胶体金检测结果非常重要。如果NC膜上结合的蛋白量不足或者蛋白结合力不够强，就会出现相当多的问题，在检测结果的检测线上非常明显。如果膜上结合的蛋白量太低，那么在结果中检测线显色较弱而且检测灵敏度降低。如果蛋白不能牢固的吸附于NC膜，那么在蛋白吸附于NC膜以前发生扩散，从而导致检测线较宽、显色较弱而不是鲜艳而清晰，使检测结果难以解释。在极端条件下，如果蛋白与NC膜的物理吸附作用太弱，流过的蛋白检测物和表面活性剂溶液可能将固着的蛋白从NC膜上洗掉，从而显示较宽或者根本不清晰的检测线，难以解释检测结果。
发明内容
本发明提供一种幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置及其制备方法，以解决现有技术存在的NC膜吸附蛋白量不足、结合力不强的问题。
本发明采取的技术方案是：
幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置，样品垫1、免疫胶体金玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5，所述硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫胶体金玻璃纤维膜2搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接，所述硝酸纤维素膜3上设置第一检测线T1、第二检测线T2和质控线C，当所述的第一检测线T1上固相有纯化的高特异性抗人IgM抗体时，所述的第二检测线T2上固相有纯化的高特异性抗人IgG抗体；当所述的第一检测线T1固相有纯化的高特异性抗人IgG抗体时，所述的第二检测线T2上则固相有纯化的高特异性抗人IgM抗体；所述的质控线C上喷点抗幽门螺杆菌尿素酶抗体。
所述的第一检测线T1距离硝酸纤维素膜3的上缘3～12mm，所述的第二检测线T2距离硝酸纤维素膜3的上缘5～15mm，所述的质控线C距离硝酸纤维素膜3的上缘10～18mm。
本发明提供一种幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置的制备方法，包括如下步骤：
(a)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
(b)采用步骤(a)中制得的胶体金标记幽门螺杆菌尿素酶B抗原，获得免疫胶体金；
(c)采用喷金缓冲液稀释步骤(b)的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金玻璃纤维膜；
(d)将硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液预处理后，喷点与二氧化硅纳米颗粒结合的抗人IgM和IgG抗体作为检测线，喷点抗幽门螺杆菌尿素酶抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
(e)将预处理的样品垫、步骤(c)制备的免疫胶体金玻璃纤维膜、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
本发明步骤(a)所述的采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金颗粒粒径为20～60nm。
本发明步骤(c)所述的喷金缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5～20％，海藻糖浓度为1～5％，BSA浓度为0.5～1％。
本发明步骤(d)所述的将硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液预处理是：用多聚赖氨酸处理液浸泡硝酸纤维素膜1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
本发明步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸稀释到浓度为0.5％组成，经0.22μm滤膜过滤，其中多聚赖氨酸，SIGMA,150KD～300KD，备用。
本发明步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，经0.22μm滤膜过滤，其中多聚赖氨酸SIGMA,150KD～300KD，备用。
本发明步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，PEG20000浓度为0.2％，经0.22μm滤膜过滤，多聚赖氨酸，SIGMA,150KD～300KD，备用。
本发明步骤(d)所述的二氧化硅纳米颗粒分别结合抗人IgM、IgG抗体是：以二氧化硅作为载体，分别取1mL抗人IgM抗体和抗人IgG抗体溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍。
本发明步骤(d)所述的二氧化硅纳米颗粒制备方法：将2.48mL体积分数25的氨水和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35℃左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声几分钟，即可制得粒径120nm均一的粒子，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散.反复多次洗涤至近中性。最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用。
步骤(e)所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％，酪蛋白浓度为0.1～0.2％、表面活性剂浓度为0.5～1％。
本发明制备的幽门螺杆菌尿素酶IgM、IgG联合快速检测装置可同时检测患者体内幽门螺杆菌尿素酶IgM、IgG抗体，为临床幽门螺杆菌感染诊断具有重要意义，并对患者感染阶段进行区分，也有助于患者幽门螺杆菌感染的治疗。
本发明由固相有纯化的高特异性抗人IgM、IgG抗体(检测线T1、T2)和抗幽门螺杆菌尿素酶抗体(质控线)的硝酸纤维素膜、吸附有胶体金标记幽门螺杆菌尿素酶抗原(HPUre-Ag)的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料粘贴制成。由于疾病不同阶段，机体抗体表达存在不同，本发明可同时检测患者体内抗幽门螺杆菌尿素酶IgM和IgG抗体，具有特异、快速、灵敏的特点。采用多聚赖氨酸对硝酸纤维素膜进行预处理，将抗人IgM与IgG抗体先与二氧化硅纳米颗粒结合再吸附到硝酸纤维素膜上，以及配制合适的喷金缓冲液和样品垫处理液，在保证免疫胶体金释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本。
多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine,PLL)的结构中含有多个氨基可供偶联,活化过程简单，方便NC膜表面固定蛋白。多聚赖氨酸带有大量的正电荷，可以显著增加NC膜上活性位点的正电荷数量，而抗体在常规包被条件下是带负电荷的，这样单位面积的NC膜上可以结合更多数量的抗体，这可以显著增加抗体的包被效率。常规条件下，单位面积的NC膜上结合抗体的数量是有限的，采用多聚赖氨酸处理之后，可以让单位面积的NC膜上结合抗体数量增加，进而可以实现更高的检测灵敏度。研究发现甲醇具有良好的重润湿性，可以保证在预处理NC膜的时候不产生气泡以免气泡的存在导致NC膜处理局部不充分，同时也能够活化NC膜，让NC膜带正电荷，这个与聚赖氨酸相似，两者协同作用，效果更好。PEG20000可与NC膜的位点发生吸附作用，在蛋白包被后，可以吸收蛋白的结合水，导致蛋白更加疏水，这样蛋白与NC膜的结合更加牢固，通过疏水作用明显提高蛋白的包被效率。综上，多聚赖氨酸、甲醇和PEG20000组合配方，可以从电荷作用和疏水作用两方面来提高NC膜蛋白的包被效率。
在改善NC膜对蛋白吸附基础上，探讨蛋白对NC膜吸附效果也是提高胶体金灵敏度的另一途径。二氧化硅纳米颗粒具有较好的稳定性、易于制备、生物相容性较好及较低的免疫原性等优势，在生物医学领域研究较为广泛。但在胶体金免疫层析技术中尚未有报道应用。本研究探讨了二氧化硅纳米颗粒对NC膜包被抗体的影响，先将划膜用的抗体先与二氧化硅纳米颗粒结合，封闭，离心纯化，去掉未结合的抗体，然后复溶到一定比例，然后划膜，这样一个二氧化硅粒子可以结合多个抗体，从而增加了包被抗体效率，灵敏度也会大大提高。又由于二氧化硅纳米颗粒是无色透明的，所以不会影响显色，只是借助其更大的表面积增加抗体的包被效率，提高胶体金实验的灵敏度。
为了提高胶体金免疫层析技术的灵敏度，我们通过对硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液进行了预处理，将包被NC的抗体与二氧化硅纳米颗粒结合，达到了提高试纸灵敏度的目的。
本发明的有益效果如下：
1、本发明的检测装置结构简单，构思新颖，将抗人IgM与IgG抗体包被于硝酸纤维膜膜上，特异性强，不仅能分别检测标本中幽门螺杆菌尿素酶IgM、IgG抗体，还能检测标本中幽门螺杆菌尿素酶同时具有IgM和IgG抗体，且没有增加生产操作的复杂度。
2、免疫胶体金制备步骤中，通过配制合适的喷金缓冲液和样品垫处理液，可保证免疫胶体金释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本。
3、本发明对硝酸纤维素膜进行预处理，对包被硝酸纤维素膜的抗体进行了修饰，提高了检测试纸灵敏度、特异性。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明的结构示意图。
图中：1、样品垫；2、免疫胶体金玻璃纤维膜；3、硝酸纤维素膜；4、吸收垫；5、塑料板；T1、第一检测线；T2、第二检测线；C、质控线。
具体实施方式
参见图1所示，本发明的幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置，幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置，样品垫1、免疫胶体金玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5，所述硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫胶体金玻璃纤维膜2搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接，所述硝酸纤维素膜3上设置第一检测线T1、第二检测线T2和质控线C，当所述的第一检测线T1上固相有纯化的高特异性抗人IgM抗体时，所述的第二检测线T2上固相有纯化的高特异性抗人IgG抗体；当所述的第一检测线T1固相有纯化的高特异性抗人IgG抗体时，所述的第二检测线T2上则固相有纯化的高特异性抗人IgM抗体；所述的质控线C上喷点抗幽门螺杆菌尿素酶抗体；
所述的第一检测线T1距离硝酸纤维素膜3的边缘3～12mm；
所述的第二检测线T2距离硝酸纤维素膜3的边缘5～15mm；
所述的质控线C距离硝酸纤维素膜3的边缘10～18mm。
本发明幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置的制备方法，包括固相有纯化的高特异性抗人IgM、IgG抗体(检测线T1、T2)和抗幽门螺杆菌尿素酶抗体(质控线)的硝酸纤维素膜、吸附有胶体金标记幽门螺杆菌尿素酶抗原(HPUre-Ag)的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料因此粘贴制成，实施例如下：
实施例1：
(a)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金
在加热的100ml纯化水中快速加入氯化金，待溶液再次沸腾后，迅速加入柠檬酸三钠，氯化金：柠檬酸三钠1：0.5，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，计时继续加热10分钟即可，胶体金颗粒为20nm；
(b)免疫胶体金制备
1)分别取100毫升20nm胶体金溶液，加入pH调节剂140μl，混匀；静置5min；
2)在20nm胶体金溶液中，按照每毫升胶体金溶液14μg的比例加入幽门螺杆菌尿素酶B抗原，共1.4mg，混匀；静置5min；
3)分别按照0.4％的比例加入胶体金稳定剂0.4毫升，混匀，静置5分钟；
4)10000、12000、14000rpm离心10min，分别收集沉淀，合并三次收集的沉淀；
(c)采用优化的喷金缓冲液稀释免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体玻璃纤维膜；所述的喷金缓冲液包括：浓度为20mMTris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、牛血清白蛋白BSA浓度为1％，pH为8.5；
(d)固相硝酸纤维素膜
1)多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜
配制多聚赖氨酸处理液：多聚赖氨酸，SIGMA,150KD、浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入多聚赖氨酸处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)二氧化硅纳米颗粒修饰抗人IgM抗体和抗人IgG抗体
二氧化硅纳米颗粒制备：将2.48mL氨水(体积分数25)和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35℃左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声5分钟，即可制得粒径120nm均一的粒子，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散.反复多次洗涤至近中性，最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用。
二氧化硅纳米颗粒修饰抗人IgM抗体和抗人IgG抗体：
以二氧化硅作为载体，分别取1mL抗人IgM抗体和抗人IgG抗体溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍；
3)硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.4μl/cm，将二氧化硅纳米颗粒-抗人IgM抗体和二氧化硅纳米颗粒-抗人IgG抗体稀释至1.5mg/ml，质控线抗幽门螺杆菌尿素酶抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用，硝酸纤维膜的检测线喷点抗人IgM和IgG抗体，其中抗人IgM在前，IgG在后，IgM检测线距硝酸纤维素膜上缘距离3mm，IgG检测线距硝酸纤维素膜上缘距离5mm；质控线上喷点抗幽门螺杆菌尿素酶抗体距硝酸纤维素膜上缘10mm；
4)样品垫预处理
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，其种样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5％、酪蛋白浓度为0.1％、表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚浓度为0.5％，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
(e)组装
将预处理的样品垫、免疫胶体金玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
实施例2：
(a)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金
在加热的100ml纯化水中快速加入氯化金，待溶液再次沸腾后，迅速加入柠檬酸三钠，氯化金：柠檬酸三钠1：1，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，计时继续加热10分钟即可，胶体金颗粒为40nm；
(b)免疫胶体金制备
1)分别取100毫升40nm胶体金溶液，加入pH调节剂140μl，混匀；静置5min；
2)在40nm胶体金溶液中，按照每毫升胶体金溶液14μg的比例加入幽门螺杆菌尿素酶B抗原，共1.4mg，混匀；静置5min；
3)分别按照0.4％的比例加入胶体金稳定剂0.4毫升，混匀，静置5分钟；
4)10000、12000、14000rpm离心10min，分别收集沉淀，合并三次收集的沉淀；
(c)采用优化的喷金缓冲液稀释免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体玻璃纤维膜；所述的喷金缓冲液包括：浓度为20mMTris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、BSA浓度为1％，pH为8.5；
(d)固相硝酸纤维素膜
1)多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜
配制多聚赖氨酸处理液：多聚赖氨酸(SIGMA,200KD)、浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入多聚赖氨酸处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)二氧化硅纳米颗粒修饰抗人IgM抗体和抗人IgG抗体
二氧化硅纳米颗粒制备：将2.48mL氨水(体积分数25)和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35℃左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声5分钟，即可制得粒径均一的粒子(120nm)。分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散.反复多次洗涤至近中性。最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用。
二氧化硅纳米颗粒修饰抗人IgM抗体和抗人IgG抗体：
以二氧化硅作为载体，分别取1mL抗人IgM抗体和抗人IgG抗体溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍；
3)硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.4μl/cm，将二氧化硅纳米颗粒-抗人IgM抗体和二氧化硅纳米颗粒-抗人IgG抗体稀释至1.5mg/ml，质控线抗幽门螺杆菌尿素酶抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用，硝酸纤维膜的检测线喷点抗人IgM和IgG抗体，其中抗人IgM在前，IgG在后，IgM检测线距硝酸纤维素膜上缘距离6mm，IgG检测线距硝酸纤维素膜上缘距离10mm，抗幽门螺杆菌尿素酶抗体距硝酸纤维素膜上缘15mm；
4)样品垫预处理
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，其种样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5-1％、酪蛋白浓度为0.1-0.2％、表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚浓度为0.5-1％，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
(e)组装
将预处理的样品垫、免疫胶体金玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
实施例3：
(a)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金
在加热的100ml纯化水中快速加入氯化金，待溶液再次沸腾后，迅速加入柠檬酸三钠，氯化金：柠檬酸三钠1：2，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，计时继续加热10分钟即可，胶体金颗粒为60nm；
(b)免疫胶体金制备
1)分别取100毫升60nm胶体金溶液，加入pH调节剂140μl，混匀；静置5min；
2)在20nm胶体金溶液中，按照每毫升胶体金溶液14μg的比例加入幽门螺杆菌尿素酶B抗原，共1.4mg，混匀；静置5min；
3)分别按照0.4％的比例加入胶体金稳定剂0.4毫升，混匀，静置5分钟；
4)10000、12000、14000rpm离心10min，分别收集沉淀，合并三次收集的沉淀；
(c)采用优化的喷金缓冲液稀释免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体玻璃纤维膜；所述的喷金缓冲液包括：浓度为20mMTris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、BSA浓度为1％，pH为8.5；
(d)固相硝酸纤维素膜
1)多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜
配制多聚赖氨酸处理液：多聚赖氨酸(SIGMA,300KD)、浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入多聚赖氨酸处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)二氧化硅纳米颗粒修饰抗人IgM抗体和抗人IgG抗体
二氧化硅纳米颗粒制备：将2.48mL氨水(体积分数25)和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35℃左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声5分钟，即可制得粒径均一的粒子(120nm)。分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散.反复多次洗涤至近中性，最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用。
二氧化硅纳米颗粒修饰抗人IgM抗体和抗人IgG抗体：
以二氧化硅作为载体，分别取1mL抗人IgM抗体和抗人IgG抗体溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍；
3)硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.4μl/cm，将二氧化硅纳米颗粒-抗人IgM抗体和二氧化硅纳米颗粒-抗人IgG抗体稀释至1.5mg/ml，质控线抗幽门螺杆菌尿素酶抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用，硝酸纤维膜的检测线喷点抗人IgM和IgG抗体，其中抗人IgM在前，IgG在后，IgM检测线距硝酸纤维素膜上缘距离12mm，IgG检测线距硝酸纤维素膜上缘距离15mm；质控线上喷点抗幽门螺杆菌尿素酶抗体距硝酸纤维素膜上缘18mm；
4)样品垫预处理
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，其种样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5-1％、酪蛋白浓度为0.1-0.2％、表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚浓度为0.5-1％，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
(e)组装
将预处理的样品垫、免疫胶体金玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
实施例4：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
其余同实施例2。
实施例5：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,200KD)与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
其余同实施例2。
实施例6：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,300KD)与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
其余同实施例2。
实施例7：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，PEG20000浓度为0.2％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
其余同实施例2。
实施例8：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,200KD)、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，PEG20000浓度为0.2％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
其余同实施例2。
实施例9：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,300KD)、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，PEG20000浓度为0.2％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
其余同实施例2。
下边通过实验来进一步说明本发明的效果。
实验例1：
1、多聚赖氨酸处理液对硝酸纤维素膜蛋白吸附能力的比较
1.1材料与方法
1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司，多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)购自Sigma公司
1.2硝酸纤维素膜处理方法
1.2.1配制多聚赖氨酸处理液
配制三种多聚赖氨酸处理液：多聚赖氨酸组，多聚赖氨酸浓度为0.5％组成；多聚赖氨酸处理液甲醇组，多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％；多聚赖氨酸、甲醇和PEG20000组，，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，PEG20000浓度为0.2％，三组处理液均经0.22μm滤膜过滤，备用。
1.2.2硝酸纤维素膜处理方法
将硝酸纤维素膜放入多聚赖氨酸处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
1.3实验方法
分别将未处理和已处理过的硝酸纤维素膜按照上述实施例工艺流程制备幽门螺杆菌尿素酶IgM、IgG联合检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较硝酸纤维素膜未处理和处理后吸附力和稳定性指标差异。
1.4结果
1.4.1蛋白吸附力比较
取3组处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过观察显色情况判断处理后膜对蛋白吸附能力，结果见表1。结果显示，处理后的硝酸纤维素膜在溶液浸润性方面要明显优于未处理膜，处理后膜阳性条带颜色略深，尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明蛋白吸附能力明显增强，提高了反应灵敏度。多聚赖氨酸、甲醇和PEG20000处理组吸附效果明显优于多聚赖氨酸组和多聚赖氨酸甲醇组。
表1硝酸纤维素膜吸附能力比较
1.4.2硝酸纤维素膜稳定性比较
取3组处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察显色情况来判断处理后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，结果见表2。表2结果与表1结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表2硝酸纤维素膜加速稳定性比较(37℃放置10天)
实验例2：
2、二氧化硅纳米颗粒修饰抗人IgM抗体和抗人IgG抗体
2.1材料与方法
1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司，正硅酸乙酯购自汕头陇西化工厂
2.2.1二氧化硅纳米颗粒制备
将2.48mL氨水(体积分数25)和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35℃左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声5分钟，即可制得粒径均一的粒子(120nm)。分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散.反复多次洗涤至近中性。最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用。
2.2.2二氧化硅纳米颗粒修饰抗人IgM抗体和抗人IgG抗体
以二氧化硅作为载体，取1mL抗人IgM抗体和抗人IgG抗体溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍。
2.3实验方法
分别将二氧化硅纳米颗粒修饰的抗人IgM抗体和抗人IgG抗体与未修饰的抗人IgM抗体和抗人IgG抗体按照上述实施例工艺流程制备幽门螺杆菌尿素酶IgM、IgG联合检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较二氧化硅纳米颗粒处理和未处理对蛋白吸附力和稳定性指标差异。
2.4结果
2.4.1蛋白吸附力比较
取二氧化硅纳米颗粒处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过观察显色情况判断处理后膜对蛋白吸附能力，结果见表3。结果显示，二氧化硅纳米颗粒修饰组膜阳性条带颜色略深，尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明蛋白吸附能力明显增强，提高了反应灵敏度。
表3二氧化硅纳米颗粒修饰对蛋白吸附能力比较
2.4.2稳定性比较
取二氧化硅纳米颗粒处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察显色情况来判断二氧化硅修饰后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，结果见表4。表4结果与表3结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表4加速稳定性比较(37℃放置10天)
以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置，其特征在于：样品垫(1)、免疫胶体金玻璃纤维膜(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸收垫(4)分别粘贴在塑料板(5)，所述硝酸纤维素膜(3)的两端分别与吸收垫(4)、免疫胶体金玻璃纤维膜(2)搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜(2)的另一端与样品垫(1)搭接，所述硝酸纤维素膜(3)上设置第一检测线(T1)、第二检测线(T2)和质控线(C)；当所述的第一检测线(T1)上固相有纯化的高特异性抗人IgM抗体时，所述的第二检测线(T2)上固相有纯化的高特异性抗人IgG抗体；或当所述的第一检测线(T1)固相有纯化的高特异性抗人IgG抗体时，所述的第二检测线(T2)上则固相有纯化的高特异性抗人IgM抗体；所述的质控线(C)上喷点抗幽门螺杆菌尿素酶抗体。
2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置，其特征在于：所述的第一检测线(T1)距离硝酸纤维素膜(3)的上缘3～12mm，所述的第二检测线(T2)距离硝酸纤维素膜(3)的上缘5～15mm，所述的质控线(C)距离硝酸纤维素膜(3)的上缘10～18mm。
3.一种幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(a)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
(b)采用步骤(a)中制得的胶体金标记幽门螺杆菌尿素酶B抗原，获得免疫胶体金；
(c)采用喷金缓冲液稀释步骤(b)的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金玻璃纤维膜；
(d)将硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液预处理后，喷点与二氧化硅纳米颗粒结合的抗人IgM和IgG抗体作为检测线，喷点抗幽门螺杆菌尿素酶抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
(e)将预处理的样品垫、步骤(c)制备的免疫胶体金玻璃纤维膜、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
4.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(a)所述的采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金颗粒粒径为20～60nm。
5.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(c)所述的喷金缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5～20％，海藻糖浓度为1～5％，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％。
6.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的将硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液预处理是：用多聚赖氨酸处理液浸泡硝酸纤维素膜1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
7.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的二氧化硅纳米颗粒分别结合抗人IgM、IgG抗体是：以二氧化硅作为载体，分别取1mL抗人IgM抗体和抗人IgG抗体溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍。
8.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(e)所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％，酪蛋白浓度为0.1～0.2％、表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚浓度为0.5～1％。
9.根据权利要求3或6所述的幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸稀释到浓度为0.5％组成，该多聚赖氨酸，SIGMA,150KD～300KD，经0.22μm滤膜过滤，备用。
10.根据权利要求3或6所述的幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸，SIGMA,150KD～300KD，浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
11.根据权利要求3或6所述的幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸，SIGMA,150KD～300KD，浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，PEG20000浓度为0.2％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
12.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌尿素酶抗体IgM、IgG联合快速检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的二氧化硅纳米颗粒制备方法：将2.48mL体积分数25的氨水和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35℃和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声5分钟，即可制得粒径120nm均一的粒子，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散，反复洗涤至近中性，最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用。
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