CN110174511A - Abo溶血病快速检测试纸 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种ABO溶血病快速检测试纸,其特征是,包括背衬、依次置于背衬上的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和沿样品垫至吸水垫的方向依次设在硝酸纤维素膜上的IgG抗A抗体检测线、IgG抗B抗体检测线以及质控线。本发明可快速检测新生儿ABO溶血病,使用操作简单,检测快速且结果准确度高,可满足急诊快速检测、家庭个人、基层医院常规试验等需求。
Description
技术领域
本发明涉及血液检测技术领域,具体涉及一种ABO溶血病快速检测试纸。
背景技术
新生儿ABO溶血病(ABO blood group hemolytic disease of the newborn,ABO-HDN)是儿科最常见的急性溶血性疾病之一,是指母婴ABO血型不合,孕母体内IgG类血型抗体造成胎儿发生以溶血、高胆红素血症为主要损害的被动免疫性疾病,ABO-HDN引起的高胆红素血症,在出生后24h内出现并很快发展,引起胆红素脑病或继发性核黄疸,对新生儿造成永久性神经系统发育损伤,准确、及时的实验室检测,做到早发现、早防治可以减少后遗症的发生,对临床诊治具有重大意义。
多年来人们对此检测方法进行不断地探索,以寻找更为敏感简洁的方法,2004年孙爱农等研究发现改良氯仿放散法,提高了IgG A、B导致的ABO-HDN的检出率,其敏感性高于传统热放散试验[孙爱农,刘怡等.红细胞放散试验改良氯仿法.临床血液学,2004,5,14-15];2000年周晓华等报道的微波放散法可以作为红细胞抗体快速放散的一种方法[周晓华,徐惠新,程根林等.用微波做红细胞抗体放散试验[J].中国输血杂志,2000,13(4):249-250.],但由于检出率等原因未能在临床上推广应用[桑胜云.微波水环境法快速检测新生儿溶血病.y云南医药.2000,21(1):69-70.]。近年来,酸放散实验逐渐应用于HDN实验室诊断[罗广平,肖露露,赵阳等.不完全抗体快速反应介质在新生儿溶血病检测中的应用.广东医学,2013,24(1):40-42.],越来越受到人们的重视,但是,由于新生儿血液的特点(血型抗原表达数量少及发育不完全),血型血清学试验往往出现极弱的凝集,与患儿临床症状不相符,大部分文献报道的阳性检出率较低,仅只能达到75%[曾德理,石明芳.3种不同剂量放散液检测新生儿ABO溶血病的结果分析.广西医学,2011,33(11)1447-1448]。为提高检出率有部分学者利用流式细胞仪进行红细胞膜致敏抗体的定量检测,流式细胞仪具有高度的敏感性和准确性,特别是对红细胞膜上结合抗体数量少,卡式法检测阴性、临床又高度怀疑ABO溶血病的患儿具有更重要的临床意义[卜祥茂,梁弘刚,宋金莲等.流式法检测红细胞膜抗体含量在新生ABO溶血病的诊断价值.J China Pediatr Blood Cancer,2013,18(6):281-282.]。但是,红细胞膜致敏的IgG抗A、B血型抗体含量水平与新生儿病情、溶血程度的争议及较高的成本、专业的仪器设备等条件限制,使该技术未能在临床推广普及应用。
综上,ABO-HDN检测在急诊、家庭或基层医疗机构应用时受到很大限制,严重贻误新生儿最佳治疗时机,只有出现黄疸、核黄疸、溶血性贫血等典型临床表现时才得到临床确诊,但此时的病情已经开始恶化,严重影响治疗效果,给我国新生儿健康造成巨大威胁。因此,结合ABO-HDN疾病致敏抗体的特点,临床诊断时实验室检测结果要求(定性试验),成本效益综合考虑,发明人运用胶体金免疫层析原理,结合ABO-HDN致敏IgG抗体与对应血型抗原特异性反应的免疫基础,研发了一种ABO溶血病快速检测试纸快速检测试纸,以满足急诊检测、家庭个人、基层医院常规试验等需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种ABO溶血病快速检测试纸,用于解决目前ABO-HDN检测技术操作繁琐、耗时长等实际问题。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的:
一种ABO溶血病快速检测试纸,其特征是,包括背衬、依次置于背衬上的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和沿样品垫至吸水垫的方向依次设在硝酸纤维素膜上的IgG抗A抗体检测线、IgG抗B抗体检测线以及质控线;
所述IgG抗A抗体检测线是由人血型A抗原包被的胶体金颗粒喷涂于硝酸纤维素膜上形成;
所述IgG抗B抗体检测线是由人血型B抗原包被的胶体金颗粒喷涂于硝酸纤维素膜上形成;
所述质控线由葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A,SPA)包被的胶体金颗粒喷涂形成。
本发明的进一步设置为:所述血型A、血型B抗原的制备方法为:
①取试剂标准红细胞或新鲜A型或B型静脉血1mL为原料;
②把原料与盐水按体积比1:1混匀,将混合物在1760g离心力下,90秒钟离心洗涤3次,末次弃上清后制备为压积红细胞;
③在压积红细胞中加入10mL,质量分数5%的十二烷基磺酸钠(SDS),室温下放置3分钟后,用RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)处理10分钟,混匀后1760g离心5分钟弃上清;加入纯水至原体积混匀1760g离心力5分钟弃上清,重复用纯水洗涤,直到上清无色透明;弃上清,利用有机溶剂处理,收集下层微白色沉淀物,即为血型抗原物质,即血型A型或B型抗原,于2~8℃储存备用。
本发明的进一步设置为:所述血型A抗原包被的胶体金颗粒、血型B抗原包被的胶体金颗粒和葡萄球菌A蛋白包被的胶体金颗粒的制备方法:
S1:以血型A抗原或血型B抗原或SPA为原料;
S2:在电磁棒匀速搅拌下,在S1步骤原料溶液中缓慢加入0.1mol/L的K2CO3溶液,调整溶液PH值至9.0,按1:2的体积比,加入粒度大小为10nm粒径的胶体金溶液,加入完毕后继续搅拌10分钟;然后,加入10ml稳定剂以防止膜蛋白与胶体金聚合发生沉淀;溶液混匀1760g离心3分钟后弃上清液,用ABO血型反定型复溶液复溶,复溶后的试剂即为血型A抗原包被的胶体金颗粒或血型B抗原包被的胶体金颗粒或SPA包被的胶体金颗粒,储存于2~8℃。
本发明的进一步设置为:所述血型A抗原包被的胶体金颗粒或血型B抗原包被的胶体金颗粒的喷涂方法为:将血型A或B抗原包被的胶体金颗粒使用0.10mol/L的PH值为9.2的PBS调节其浓度为0.5mg/mL,加入体积分数为1.0%Tween-20,使用划膜仪将其喷于硝酸纤维素膜表面作为IgG抗A抗体检测线或IgG抗B抗体检测线,划膜量为0.5~1.0μl/cm;
所述葡萄球菌A蛋白包被的胶体金颗粒喷涂方法为:应用0.15mol/L的PH值为6.2的PBS调节其浓度为0.1mg/mL,使用划膜仪将其喷于硝酸纤维素膜表面作为质控线,划膜量为0.1~0.5μl/cm;
每条线之间间隔为15mm,所述划膜结束后立即放入37℃烘箱中干燥过夜,室温保存备用。
综上所述,本发明的有益效果为:
其一、本发明利用胶体金免疫层析的原理,结合ABO-HDN致病IgG抗A、抗B血型抗体的特点,以条状纤维层析材料为固相载体,通过毛细管作用原理,以胶体金为示踪物来显示检测结果,达到了快速检测ABO-HDN的目的,具有操作简单、快捷、结果清楚、易于判断、且不需要任何仪器设备等优点,可满足ABO-HDN的急诊快速检测、家庭和基层医疗机构常规试验检测等需求。
其二、将血型抗原包被于胶体金颗粒喷涂与固相载体硝酸纤维素膜作固相后,4℃干燥保存6个月仍保持抗原的免疫活性不变,解决了新鲜红细胞不易保存,难以批量获得、有效期短、保存条件苛刻、质量不稳定、红细胞血型抗原的抗原性随保存时间延长而逐渐降低等问题。
附图说明
图1为本发明的结构简图。
图中:1、背衬;2、样品垫;3、胶体金结合垫;4、硝酸纤维素膜;5、吸水垫;6、IgG抗A抗体检测线;7、IgG抗B抗体检测线;8、质控线。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
具体实施例仅仅是对本发明的解释,其并不是对本发明的限制,本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改,但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
实施例:一种ABO溶血病快速检测试纸,参照图1,包括背衬1、依次置于背衬1上的样品垫2、胶体金结合垫3、硝酸纤维素膜4、吸水垫5和沿样品垫2至吸水垫5的方向依次设在硝酸纤维素膜4上的IgG抗A抗体检测线6、IgG抗B抗体检测线7以及质控线8;
IgG抗A抗体检测线6是由人血型A抗原包被的胶体金颗粒喷涂于硝酸纤维素膜4上形成;
IgG抗B抗体检测线7是由人血型B抗原包被的胶体金颗粒喷涂于硝酸纤维素膜4上形成;
质控线8由葡萄球菌A蛋白包被的胶体金颗粒喷涂形成。
血型A、血型B抗原的制备:
①取试剂标准红细胞或新鲜A型或B型静脉血1mL为原料;
②把原料与盐水按体积比1:1混匀,将混合物在1760g离心力下,90秒钟离心洗涤3次,末次弃上清后制备为压积红细胞;
③在压积红细胞中加入10mL,质量分数5.0%的十二烷基磺酸钠(SDS),室温下放置3分钟后,用RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)处理10分钟,混匀后1760g离心5分钟弃上清;加入纯水至原体积混匀1760g离心力5分钟弃上清,重复用纯水洗涤,直到上清无色透明;弃上清,利用有机溶剂处理,收集下层微白色沉淀物,即为血型抗原物质,即血型A型或B型抗原,于2~8℃储存备用。
血型A抗原包被的胶体金颗粒、血型B抗原包被的胶体金颗粒和葡萄球菌蛋白(SPA)包被的胶体金颗粒的制备:
S1:以血型A抗原或血型B抗原或葡萄球菌A蛋白(SPA)为原料;
S2:在电磁棒匀速搅拌下,在S1步骤原料溶液中缓慢加入0.1mol/L的K2CO3溶液,调整溶液PH值至9.0,按1:2的体积比,加入粒度大小为10nm粒径的胶体金溶液,加入完毕后继续搅拌10分钟;然后,加入10ml稳定剂以防止膜蛋白与胶体金聚合发生沉淀;溶液混匀1760g离心3分钟后弃上清液,用ABO血型反定型复溶液复溶,复溶后的试剂即为血型A抗原包被的胶体金颗粒或血型B抗原包被的胶体金颗粒或SPA包被的胶体金颗粒,储存于2~8℃。
血型A抗原包被的胶体金颗粒或血型B抗原包被的胶体金颗粒的喷涂:将血型A或B抗原包被的胶体金颗粒使用0.10mol/L的PH值为9.2的PBS调节其浓度为0.5mg/mL,加入体积分数为1.0%Tween-20,使用划膜仪将其喷于硝酸纤维素膜表面作为IgG抗A抗体检测线或IgG抗B抗体检测线,划膜量为0.5~1.0μl/cm。
葡萄球菌蛋白(SPA)包被的胶体金颗粒喷涂:将葡萄球菌A蛋白包被的胶体金溶液应用0.15mol/L的PH值为6.2的PBS调节其浓度至0.1mg/mL,使用划膜仪将其喷于硝酸纤维素膜表面作为质控线;
每条线之间间隔为15mm,所述划膜结束后立即放入37℃烘箱中干燥过夜,室温保存备用。
验证试纸三性:
敏感性(%)=真阳性/(真阳性+假阴性)×100%
特异性(%)=真阴性/(真阴性+假阳性)×100%
符合率(%)=(真阳性+真阴性)/所有被检样品数×100%
特异性、敏感性、符合率的测定:以本发明所述试纸与现行使用较广泛的微柱凝胶抗人球蛋白卡式法做对比试验。
IgG抗A、IgG抗B抗体均取自昆明市儿童医院临床常规新生儿ABO-HDN血清学检测标本。
检测时:
①将待测新生儿EDTA-K2抗凝的静脉血标本,在1760g离心力下离心5分钟,分离血浆,使用一次性塑料吸管吸取0.5~1ml血浆滴于本发明所述试纸的样品垫上;
②静置15-20min,观察检测线和质控线;
③检测线显红色,质控线显红色,即为阳性;检测线不显色,质控线显红色,为阴性;质控线不显色,无论检测线是否显色均判断为无效。
对比试验检测结果如表1所示:
表1
有效期的检验:
将新制备的ABO-HDN试纸分为两组,一组置于4℃干燥保存1、3、6个月,另一组置于37℃保存7天(相当于在2~8℃保存1年),选取ABO-HDN确诊的新生儿静脉血标本50例重复测定试纸的特异性、敏感性和符合率。测定结果如表2所示:
表2
综上所述,本发明所述的ABO溶血病快速检测试纸与现行使用较广泛的微柱凝胶抗人球蛋白卡式法做对比试验,特异性、符合率均为100%;敏感性与微柱凝胶抗人球蛋白卡式法检测结果一致,且检测时间较微柱凝胶抗人球蛋白卡式法大幅度缩短。在4℃干燥保存6个月、37℃保存7天(相当于在2~8℃保存1年)后特异性和符合率均为100%,敏感性与新制检测试纸也基本一致,检测试纸的抗原活性得到了较长时间的保存。可满足急诊检测、家庭个人、基层医院常规试验检测等需求。
Claims (4)
1.一种ABO溶血病快速检测试纸,其特征是,包括背衬、依次置于背衬上的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和沿样品垫至吸水垫的方向依次设在硝酸纤维素膜上的IgG抗A抗体检测线、IgG抗B抗体检测线以及质控线;
所述IgG抗A抗体检测线是由人血型A抗原包被的胶体金颗粒喷涂于硝酸纤维素膜上形成;
所述IgG抗B抗体检测线是由人血型B抗原包被的胶体金颗粒喷涂于硝酸纤维素膜上形成;
所述质控线由葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A,SPA)包被的胶体金颗粒喷涂于硝酸纤维素膜上形成。
2.根据权利要求1所述的ABO溶血病快速检测试纸,其特征在于:所述血型A、血型B抗原的制备方法为:
①取试剂标准红细胞或新鲜A型或B型静脉血1mL为原料;
②把原料与盐水按体积比1:1混匀,将混合物在1760g离心力下,90秒钟离心洗涤3次,末次弃上清后制备为压积红细胞;
③在压积红细胞中加入10mL,质量分数5%的十二烷基磺酸钠(SDS),室温下放置3分钟后,用RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)处理10分钟,混匀后1760g离心5分钟弃上清;加入纯水至原体积混匀1760g离心力5分钟弃上清,重复用纯水洗涤,直到上清无色透明;弃上清,利用有机溶剂处理,收集下层微白色沉淀物,即为血型抗原物质,即血型A型或B型抗原,于2~8℃储存备用。
3.根据权利要求2所述的ABO溶血病快速检测试纸,其特征在于:所述血型A抗原包被的胶体金颗粒、血型B抗原包被的胶体金颗粒和葡萄球菌A蛋白包被的胶体金颗粒的制备方法:
S1:以血型A抗原或血型B抗原或葡萄球菌A蛋白为原料;
S2:在电磁棒匀速搅拌下,在S1步骤原料溶液中缓慢加入0.1mol/L的K2CO3溶液,调整溶液PH值至9.0,按1:2的体积比,加入粒度大小为10nm粒径的胶体金溶液,加入完毕后继续搅拌10分钟;然后,加入10ml稳定剂以防止膜蛋白与胶体金聚合发生沉淀;溶液混匀1760g离心3分钟后弃上清液,用ABO血型反定型复溶液复溶,复溶后的试剂即为血型A抗原包被的胶体金颗粒或血型B抗原包被的胶体金颗粒或葡萄球菌A蛋白包被的胶体金颗粒,储存于2~8℃。
4.根据权利要求3所述的ABO溶血病快速检测试纸,其特征在于:所述血型A抗原包被的胶体金颗粒或血型B抗原包被的胶体金颗粒的喷涂方法为:将血型A或B抗原包被的胶体金颗粒使用0.10mol/L的PH值为9.2的PBS调节其浓度为0.5mg/mL,加入体积分数为1%Tween-20,使用划膜仪将其喷于硝酸纤维素膜表面作为IgG抗A抗体检测线或IgG抗B抗体检测线,划膜量为0.5~1.0μl/cm;
所述葡萄球菌A蛋白包被的胶体金颗粒喷涂方法为:应用0.15mol/L的PH值为6.2的PBS调节其浓度为0.1mg/mL,使用划膜仪将其喷于硝酸纤维素膜表面作为质控线,划膜量为0.1~0.5μl/cm;
每条线之间间隔为15mm,所述划膜结束后立即放入37℃烘箱中干燥过夜,8~25℃室温保存备用。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190827 |
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