CN105137096A - 一种用于血型抗体检测的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒，包括：固定有血型抗原的固相载体、补体、酶标记的抗补体、显色液，以及采用上述试剂盒进行血型抗体鉴定和/或检测方法。本发明所述的用于血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒保存周期长，储存方便，增加了血型抗体检测的便利性，同时本发明所述的血型抗体鉴定和/或检测方法可以定量的检测血液中存在的抗体，实现了血液中弱抗体的检测，避免了现有检测方法中肉眼判断可能造成的人为误差，提高了检测的准确性和重现性，保证了输血安全，并且能够实现用十系及以上谱细胞进行不规则抗体的自动化和批量化检测。
Description
技术领域
本发明属于血型抗体检测和鉴定技术领域，具体涉及一种用于血型抗体检测的试剂盒及其在血型抗体检测中的应用。
背景技术
血型鉴定在输血治疗中非常重要，血型鉴定是基于抗原-抗体反应导致的细胞凝集反应。使用红细胞表面抗原检测血清/血浆中的血型抗体称之为反定型。在临床输血中，必须保证正、反定型法鉴定结果一致，才能确保输血的安全性。目前大多数的反定型试验都是以有活力的红细胞表面抗原作为标准抗原，然而新鲜红细胞不易保存，并且红细胞表面抗原的抗原性随保存时间延长而逐渐降低。这类试剂不仅需要低温保存，且最长保存期只有3至6个月。
现有技术中所建立的红细胞抗体检测方法有试管法、纸片法、微柱凝集检测卡法等。微柱凝集法是目前最常用的检测方法，实验时红细胞抗原与相应抗体的反应在微柱凝集介质中进行，微柱凝集具有分子筛的作用，如果红细胞抗原与相应抗体结合，形成的凝集块经离心后不能通过分子筛而留在凝集介质的上层；如果红细胞与抗体没有结合，反应后没有形成凝集块，则离心后红细胞可以通过分子筛沉淀到底部，从而达到鉴定ABO血型的目的。但是该方法干扰因素多，可能产生假阴性或假阳性检测结果，导致检测结果容易出现误差。
CN103487590B公开了一种血型抗体的间接Dot-ELISA检测方法与应用，所述方法为将硝酸纤维素膜固定于96孔板上，然后直接将红细胞膜包被硝酸纤维素膜上，与待测抗体反应，通过酶标二抗形成抗原-抗体复合物。然而该方法操作复杂，不易实现，需肉眼判断检测结果，易产生误差且无法实现定量检测。
CN1032926A同样公开了将已用酶标记的ABH单克隆抗体用斑点ELISA(酶联免疫吸附法)进行ABO血型测定，通过结合在抗体上的酶作用底物出现颜色变化来判断血型。同样的，上述方法也需通过肉眼观察颜色判断检测结果，易产生误差并无法实现定量检测。
Asandwichenzyme-linkedimmune-sorbentassayforABObloodtypingofsemenbyusinganli-P84monoclonalantibodyasamarkerofbloodgroupsubstanceinsemen(SatoIetal.，JForensicSci，2000，45(4)：795)公开了利用ELISA法测定精液中的血型物质P84，实验利用抗血型物质P84的单克隆抗体包板，捕捉精液或精斑样本中的相应抗原，实验证明即使样本在40℃下保存8个月，样本中仍有超过60％的P84血型物质生物学活性存在，仍然可以用这种办法顺利进行血型物质的鉴定。
为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种用于血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒及应用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种血型抗体鉴定和/或检测方法，解决了现有检测方法中只能定性或半定量检测血液中血型抗体的缺陷，实现了对血型抗体特别是血液中存在的弱抗体定量鉴定和/或检测，提高了输血的安全性。
本发明的另一个目的是提供一种血型抗体鉴定和/或检测方法，解决了现有检测方法中操作繁琐复杂的问题，能够实现用十系及以上谱细胞进行不规则抗体的自动化和批量化检测。
本发明的再一个目的是提供一种用于血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒，解决了现有检测产品中红细胞保存周期过短，检测重现性差、不能实现检测标准化的问题。
本发明的一方面提供了一种用于血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒，包括：固定有血型抗原的固相载体、补体、酶标记的抗补体和显色液。
本发明所述的血型抗原是指人体红细胞存在的抗原物质。可以理解，现有已知的红细胞表面的抗原均可以被用于血型抗体鉴定和/或检测，其取决于需要鉴定和/或检测的血型抗体，优选的，所述的血型抗原为选自ABO血型系统、Rh血型系统、MNS血型系统、P血型系统、Kell血型系统、Kidd血型系统、Lewis血型系统、Duffy血型系统的抗原。所述的ABO血型系统抗原为A、B抗原，所述的Rh血型系统抗原为C、c、D、E、e抗原，所述的MNS血型系统抗原为M、N、S、s抗原，所述的P血型系统抗原为P1抗原，所述的Kell血型系统抗原为K、k、Kpa、Kpb、Jsa、Jsb抗原，所述的Kidd血型系统抗原为Jka、Jkb抗原，所述的Lewis血型系统抗原为Lea、Leb抗原，所述的Duffy血型系统抗原为Fya、Fyb抗原。更优选的，所述的血型抗原为ABO血型系统抗原，即A抗原或B抗原。
本发明所述的固相载体作为吸附剂和容器，本身不参与化学反应。本发明所述的固相载体材质可以为聚苯乙烯、聚氯乙烯，优选为聚苯乙烯。更优选的，本发明所述的固相载体为微量滴定板或微孔板，包括8孔板、48孔板、96孔板，最优选的，本发明所述的固相载体为96孔板，更为优选的，本发明所述的固相载体为条与条之间可拆卸的微孔板。
本发明所述的补体能够与抗原抗体复合物(例如IgG、IgM)反应，并且不与单独的抗原和抗体反应，因此可以特异性的用于血型抗体的检测中。C1q为各种补体分子中分子量最大(410kDa)的γ球蛋白，其分子结构较特殊和复杂，由A、B、C三种不同类型的肽链所组成。C1q可以用于识别抗原抗体复合物，当Ig补体结合位点暴露时，C1q能与Ig受体部位结合，并由此导致C1q的活化。因此，本发明所述的补体优选为C1q补体，更优选的，本发明所述的试剂盒中补体C1q的浓度是0.04-400μg/mL，最优选的，本发明所述的试剂盒中补体C1q浓度为0.1-100μg/mL，特别优选的，本发明所述的试剂盒中补体C1q浓度为0.1-0.4μg/mL。
本发明所述的酶标记的抗补体用于与补体结合，同时酶标记的抗补体与显色液作用，最终实现定量检测。本发明所述的酶标记的抗补体优选为酶标记的抗补体C1q，更优选的，本发明所述的酶标记的抗补体C1q可以为辣根过氧化物酶标记的抗补体C1q，最优选的，本发明所述的辣根过氧化物酶标记的抗补体C1q浓度为0.1-100μg/mL，最优选的，本发明所述的辣根过氧化物酶标记的抗补体C1q浓度为0.5-10μg/mL，特别优选的，本发明所述的试剂盒中辣根过氧化物酶标记的抗补体C1q浓度为0.625-2.5μg/mL。
优选的，本发明所述的显色液可以为现有技术中任何与酶标记的抗补体中的酶作用后显色的物质。更优选的，本发明所述的显色液为TMB显色液。
在本发明的具体实施方式中，所述的血型抗原可以采用合成方法或血液提取法获得。在本发明的具体实施方式中，固定有血型抗原的固相载体的制备方法，包括：将固相载体的表面氨基化或醛基化；用60Co辐照固相载体或用紫外线照射固相载体；将血型抗原或含血型抗原的红细胞膜蛋白提取物用碳酸盐缓冲液稀释，以50-500μL包被固相载体，放置1-36h后去除液体，加入含5-20％牛血清白蛋白BSA的磷酸盐缓冲液，在室温下封闭1-8h，甩去液体，干燥即得。优选的，所述的固相载体的表面氨基化采用多聚赖氨酸进行表面氨基化，更优选的，所述的固相载体的表面氨基化包括加入50-500μL的浓度为0.05-1g/L的多聚赖氨酸，水浴1-10h，除去液体后以蒸馏水洗涤，最优选的，所述的固相载体的表面氨基化包括加入100-200μL的浓度为0.05-0.2g/L的多聚赖氨酸，水浴2-4h，除去液体后以蒸馏水洗涤。优选的，所述的60Co辐照固相载体最佳剂量为8kGy。优选的，所述的碳酸盐缓冲液pH为8-10，更优选的，所述的碳酸盐缓冲液pH为9.6，所述的碳酸盐缓冲液pH为8-10，血型抗原或含血型抗原的红细胞膜蛋白提取物用碳酸盐缓冲液稀释至浓度为0.01-20mg/mL，优选的，血型抗原或含血型抗原的红细胞膜蛋白提取物用碳酸盐缓冲液稀释至浓度为0.05-5mg/mL，更优选的，含血型抗原或含血型抗原的红细胞膜蛋白提取物用碳酸盐缓冲液稀释至浓度为0.1-0.4mg/mL。优选的，磷酸盐缓冲液含BSA10-15％，更优选的含有BSA10％。优选的，所述的封闭时间为2-4h，更优选的，所述的封闭时间为2h。
本发明所述的含血型抗原的红细胞膜蛋白提取物的制备方法包括：取含有相应血型抗原的外周血，离心后去上清，取压积红细胞，加入细胞裂解液，放置后离心去上清，向沉淀物加入水并振荡混匀，再次离心去上清，重复向沉淀物加入水并振荡混匀，离心去上清步骤2-8次，所得到的沉淀物即为含血型抗原的红细胞膜蛋白提取物。在本发明的实施方式中，所述的外周血优选为静脉血。所述的细胞裂解液为2-10％十二烷基磺酸钠溶液(g/mL)或Tris-HCl溶液，其中所述的十二烷基磺酸钠溶液浓度优选为5-10％，更优选为5％。所述的外周血与细胞裂解液加入量按体积比优选为1∶5-1∶100，更优选为1∶10-1∶30，最优选为1∶10。所述的离心的速度优选的为2000-8000rpm，更优选的为3000-4000rmp，离心时间优选为2-10min，更优选为5min。所述的向沉淀物加入水并振荡混匀，离心去上清步骤优选的重复2-6次，更优选的重复4-6次，最优选的重复5次。
在本发明的具体实施方式中，所述的用于血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒中还包括阴性对照品、阳性对照品、洗涤液、反应终止液或样品稀释液中的一种或两种以上的组合。优选的，所述的试剂盒中还含有洗涤液、反应终止液中的一种或两种以上的组合。更优选的，所述的阳性对照品为含有相应血型抗体的血清或血浆；所述的阴性对照品为不含有相应血型抗体的血清或血浆。更优选的，所述的洗涤液为含0.01-1％Tween20的磷酸盐或碳酸盐缓冲液，最优选的，所述的洗涤液为含0.05％Tween20的磷酸盐或碳酸盐缓冲液。
本发明的另一个方面提供了一种血型抗体的鉴定和/或检测方法，包括：
将待测血清或待测血浆加入固定有血型抗原的固相载体中；加入补体，孵育10-300min，用洗涤液洗涤；加入酶标记的抗补体，孵育10-300min，用洗涤液洗涤；加入显色液，加入终止液，测定吸光度。
本发明所述的固定有血型抗原的固相载体的制备方法，包括：将固相载体的表面氨基化或醛基化；用60Co辐照固相载体或用紫外线照射固相载体；将血型抗原或含血型抗原的红细胞膜蛋白提取物用碳酸盐缓冲液稀释，以50-500μL包被固相载体，放置1-36h后去除液体，加入含5-20％牛血清白蛋白BSA的磷酸盐缓冲液，在室温下封闭1-8h，甩去液体，干燥即得。优选的，所述的固相载体的表面氨基化采用多聚赖氨酸进行表面氨基化，更优选，所述的固相载体的表面氨基化包括加入50-500μL的浓度为0.05-1g/L的多聚赖氨酸，水浴1-10h，除去液体后以蒸馏水洗涤，最优选的，所述的固相载体的表面氨基化包括加入100-200μL的浓度为0.05-0.2g/L的多聚赖氨酸，水浴2-4h，除去液体后以蒸馏水洗涤。优选的，所述的60Co辐照固相载体最佳剂量为8kGy。优选的，所述的碳酸盐缓冲液pH为8-10，更优选的，所述的碳酸盐缓冲液pH为9.6，所述的碳酸盐缓冲液pH为8-10，所述的血型抗原或含血型抗原的红细胞膜蛋白提取物用碳酸盐缓冲液稀释至浓度为0.01-20mg/mL，优选的，血型抗原或含血型抗原的红细胞膜蛋白提取物用碳酸盐缓冲液稀释至浓度为0.05-5mg/mL，更优选的，血型抗原或含血型抗原的红细胞膜蛋白提取物用碳酸盐缓冲液稀释至浓度为0.1-0.4mg/mL。优选的，磷酸盐缓冲液含BSA10-15％，更优选的含有BSA10％。优选的，所述的封闭时间为2-4h，更优选的，所述的封闭时间为2h。
本发明所述的待测血清或血浆的加入量为10-100μL，优选为40-80μL，更优选为50μL。
本发明所述的补体加入量为10-100μL，优选为40-80μL，更优选为50μL。优选的，本发明所述的补体为C1q，更优选的，补体C1q的浓度为0.04-400μg/mL，最优选的，本发明所述的试剂盒中补体C1q浓度为0.1-100μg/mL，特别优选的，本发明所述的试剂盒中补体C1q浓度为0.1-0.4μg/mL。
本发明所述的酶标记的抗补体加入量为10-100μL，优选为40-80μL，更优选为50μL。优选的，本发明所述的酶标记的抗补体为抗补体C1q，更优选的，所述的酶标记的抗补体C1q的浓度为0.1-100μg/mL，最优选的，本发明所述的辣根过氧化物酶标记的抗补体C1q浓度为0.5-10μg/mL，特别优选的，本发明所述的试剂盒中辣根过氧化物酶标记的抗补体C1q浓度为0.625-2.5μg/mL。
本发明所述的显色液的加入量优选为50-200μL，更优选为100μL。优选的，本发明所述的血型抗体的鉴定和/或检测方法中，在加入显色液后，还加入终止液。本发明所述的终止液的加入量优选为50-200μL，更优选为50μL。
本发明所述的测定吸光度优选为在酶标仪中测定吸光度，更优选的，本发明所述的吸光度测定450nm吸光度值。
在本发明的具体实施方式中提供了一种血型抗体的鉴定和/或检测方法，包括
(1)微孔板的表面氨基化：在微孔板内加入0.1g/L多聚赖氨酸，加入量100μL/孔，于37℃水浴4h，弃孔内液后以蒸馏水洗涤3次，5min/次，置37℃烘干并贮存备用；
(2)用60Co辐照聚苯乙烯微孔板，辐照剂量为8kGy；
(3)血型抗原提取：取具有相应血型抗原的外周血，3000rpm离心5分钟去上清，取压积红细胞；在压积红细胞中加入5％十二烷基磺酸钠，外周血与细胞裂解液加入量按体积比1∶10，室温下放置3分钟后3000rpm离心去上清；向沉淀物加入纯水并振荡混匀，再次3000rpm离心去上清，反复5次，得到的沉淀物即含血型抗原的红细胞膜蛋白提取物，测定沉淀物的蛋白浓度，分装，冰冻保存备用；
(4)抗原包被：将含血型抗原的红细胞膜蛋白提取物用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至浓度为0.01-20mg/mL，以100μL/孔的量包被微孔板，4℃下放置16h后甩去包被液，加入含10％BSA的磷酸盐缓冲液，在室温下封闭2h，甩去液体，抽干，密封置于4℃冷藏备用；
(5)测定：取50μL待测血清或血浆，加入抗原包被的微孔板的检测孔中，再加入50μL补体C1q，所述补体C1q的浓度为0.04-400μg/mL，37℃孵育30min，用洗涤液洗板5次，在吸水纸上拍干；加入50μL辣根过氧化物酶标记的抗补体C1q，所述辣根过氧化物酶标记的抗补体C1q浓度为0.1-100μg/mL，孵育30min，用洗涤液洗板5次，在吸水纸上拍干；加入100μL显色液，37℃避光显色10min，滴入50μL终止液中止反应，用酶标仪测定其450nm吸光度值。
本发明的还一方面提供了一种所述的用于血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒在血型抗体鉴定和/或检测中的应用。优选的，所述的血型选自ABO血型系统、Rh血型系统、MNS血型系统、P血型系统、Kell血型系统、Kidd血型系统、Lewis血型系统、Duffy血型系统。
本发明所述的用于血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒保存周期长，储存方便，增加了血型抗体检测的便利性，同时本发明所述的血型抗体鉴定和/或检测方法可以定量的检测血液中存在的抗体，实现了血液中弱抗体的检测，避免了现有检测方法中肉眼判断可能造成的人为误差，提高了检测的准确性和重现性，保证了输血安全，并且能够实现用十系及以上谱细胞进行不规则抗体的自动化和批量化检测。
具体实施方式
实施例1制备ABO型抗原包被的微孔板
(1)在微孔板内加入0.1g/LL-多聚赖氨酸，加入量100μL/孔，于37℃水浴4h，弃孔内液后以蒸馏水洗涤3次，5min/次，置37℃烘干并贮存备用；
(2)用60Co辐照聚苯乙烯微孔板，辐照剂量为8kGy；
(3)取新鲜A型静脉血2mL，3000rpm离心5分钟去上清，取压积红细胞；在压积红细胞中加入20mL5％十二烷基磺酸钠，室温下放置3分钟后3000rpm离心去上清；向沉淀物加入20mL纯水并振荡混匀，再次3000rpm离心去上清，反复5次，得到的沉淀物即含A抗原的红细胞膜蛋白提取物；
(4)将含血型抗原的红细胞膜蛋白提取物用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释为浓度0.4mg/mL，以100μL/孔的量包被微孔板，4℃下放置16h后甩去包被液，加入含10％BSA的磷酸盐缓冲液，在室温下封闭2h，甩去液体，抽干，密封置于4℃冷藏。
实施例2制备ABO型抗原包被的微孔板
(1)在微孔板内加入0.5g/LL-多聚赖氨酸，加入量200μL/孔，于37℃水浴4h，弃孔内液后以蒸馏水洗涤3次，5min/次，置37℃烘干并贮存备用；
(2)用60Co辐照聚苯乙烯微孔板，辐照剂量为8kGy；
(3)取新鲜B型静脉血2mL，3000rpm离心5分钟去上清，取压积红细胞；在压积红细胞中加入20mL5％十二烷基磺酸钠，室温下放置3分钟后3000rpm离心去上清；向沉淀物加入20mL纯水并振荡混匀，再次3000rpm离心去上清，反复5次，得到的沉淀物即含B抗原的红细胞膜蛋白提取物；
(4)将含血型抗原的红细胞膜蛋白提取物用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释为浓度0.1mg/mL，以100μL/孔的量包被微孔板，4℃下放置16h后甩去包被液，加入含10％BSA的磷酸盐缓冲液，在室温下封闭2h，甩去液体，抽干，密封置于4℃冷藏。
实施例3制备ABO型抗原包被的微孔板
(1)在微孔板内加入0.1g/LL-多聚赖氨酸，加入量100μL/孔，于37℃水浴4h，弃孔内液后以蒸馏水洗涤3次，5min/次，置37℃烘干并贮存备用；
(2)用60Co辐照聚苯乙烯微孔板，辐照剂量为8kGy；
(3)取新鲜A型静脉血2mL，3000rpm离心5分钟去上清，取压积红细胞；在压积红细胞中加入20mL5％十二烷基磺酸钠，室温下放置3分钟后3000rpm离心去上清；向沉淀物加入20mL纯水并振荡混匀，再次3000rpm离心去上清，反复5次，得到的沉淀物即含A抗原的红细胞膜蛋白提取物；
(4)将含血型抗原的红细胞膜蛋白提取物用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释为浓度20mg/mL，以100μL/孔的量包被微孔板，4℃下放置16h后甩去包被液，加入含10％BSA的磷酸盐缓冲液，在室温下封闭2h，甩去液体，抽干，密封置于4℃冷藏。
实施例4制备ABO型抗原包被的微孔板
(1)在微孔板内加入0.5g/LL-多聚赖氨酸，加入量200μL/孔，于37℃水浴4h，弃孔内液后以蒸馏水洗涤3次，5min/次，置37℃烘干并贮存备用；
(2)用60Co辐照聚苯乙烯微孔板，辐照剂量为8kGy；
(3)取新鲜B型静脉血2mL，3000rpm离心5分钟去上清，取压积红细胞；在压积红细胞中加入20mL5％十二烷基磺酸钠，室温下放置3分钟后3000rpm离心去上清；向沉淀物加入20mL纯水并振荡混匀，再次3000rpm离心去上清，反复5次，得到的沉淀物即含B抗原的红细胞膜蛋白提取物；
(4)将含血型抗原的红细胞膜蛋白提取物用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释为浓度0.01mg/mL，以100μL/孔的量包被微孔板，4℃下放置16h后甩去包被液，加入含10％BSA的磷酸盐缓冲液，在室温下封闭2h，甩去液体，抽干，密封置于4℃冷藏。
实施例5用于ABO型血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒
用于ABO型血型鉴定和/或检测的试剂盒组成：
实施例1制备得到的ABO型抗原包被的微孔板；
补体C1q浓度为0.4μg/mL；
酶标记的抗补体C1q浓度为0.625μg/mL；
TMB显色液；
终止液；
洗涤液：0.05％Tween20的磷酸盐缓冲液。
实施例6用于ABO型血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒
用于ABO型血型鉴定和/或检测的试剂盒组成：
实施例2制备得到的ABO型抗原包被的微孔板；
补体C1q浓度为0.1μg/mL；
酶标记的抗补体C1q浓度为2.5μg/mL；
TMB显色液；
终止液；
洗涤液：0.05％Tween20的磷酸盐缓冲液。
实施例7用于ABO型血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒
用于ABO型血型鉴定和/或检测的试剂盒组成：
实施例1制备得到的ABO型抗原包被的微孔板；
补体C1q浓度为400μg/mL；
酶标记的抗补体C1q浓度为0.1μg/mL；
TMB显色液；
终止液；
洗涤液：0.05％Tween20的磷酸盐缓冲液。
实施例8用于ABO型血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒
用于ABO型血型鉴定和/或检测的试剂盒组成：
实施例2制备得到的ABO型抗原包被的微孔板；
补体C1q浓度为0.04μg/mL；
酶标记的抗补体C1q浓度为100μg/mL；
TMB显色液；
终止液；
洗涤液：0.05％Tween20的磷酸盐缓冲液。
实施例9ABO型血型抗体鉴定和/或检测
取50μL待测血浆，加入实施例1制备得到的抗原包被的微孔板的检测孔中，再加入50μL补体C1q，C1q浓度为400μg/mL，37℃孵育30min，用洗涤液洗板5次，在吸水纸上拍干；加入50μL辣根过氧化物酶标记的抗补体C1q，辣根过氧化物酶标记的抗补体C1q稀释浓度为0.1μg/mL，孵育30min，用洗涤液洗板5次，在吸水纸上拍干；加入100μLTMB显色液，37℃避光显色10min，滴入50μL终止液中止反应，用酶标仪测定其450nm吸光度值。
实施例10ABO型血型抗体鉴定和/或检测
取50μL待测血浆，加入实施例1制备得到的抗原包被的微孔板的检测孔中，再加入50μL补体C1q，C1q稀释浓度为浓度为0.04μg/mL，37℃孵育30min，用洗涤液洗板5次，在吸水纸上拍干；加入50μL辣根过氧化物酶标记的抗补体C1q，辣根过氧化物酶标记的抗补体浓度为100μg/mL，孵育30min，用洗涤液洗板5次，在吸水纸上拍干；加入100μLTMB显色液，37℃避光显色10min，滴入50μL终止液中止反应，用酶标仪测定其450nm吸光度值。
实施例11ABO型血型抗体鉴定和/或检测
取50μL待测血浆，加入实施例1制备得到的抗原包被的微孔板的检测孔中，再加入50μL补体C1q，C1q浓度为0.4μg/mL，37℃孵育30min，用洗涤液洗板5次，在吸水纸上拍干；加入50μL辣根过氧化物酶标记的抗补体C1q，辣根过氧化物酶标记的抗补体C1q稀释浓度为0.625μg/mL，孵育30min，用洗涤液洗板5次，在吸水纸上拍干；加入100μLTMB显色液，37℃避光显色10min，滴入50μL终止液中止反应，用酶标仪测定其450nm吸光度值。
实施例12ABO型血型抗体鉴定和/或检测
取50μL待测血浆，加入实施例1制备得到的抗原包被的微孔板的检测孔中，再加入50μL补体C1q，C1q稀释浓度为浓度为0.1μg/mL，37℃孵育30min，用洗涤液洗板5次，在吸水纸上拍干；加入50μL辣根过氧化物酶标记的抗补体C1q，辣根过氧化物酶标记的抗补体浓度为2.5μg/mL，孵育30min，用洗涤液洗板5次，在吸水纸上拍干；加入100μLTMB显色液，37℃避光显色10min，滴入50μL终止液中止反应，用酶标仪测定其450nm吸光度值。
实施例13A型血型抗原定量检测试验
(1)采用实施例1的方法得到A型血型抗原提取物，并制备A抗原包被的微孔板，将得到的提取物采用蛋白定量方法测定，其中膜蛋白定量为1.6mg/mL。
(2)按照实施例5的方法测定吸光度值，其中血型抗原以红细胞膜蛋白浓度作为血型抗原浓度表示：
试验1：红细胞膜蛋白浓度：0.4mg/mL、C1q浓度0.4μg/mL、抗C1q浓度0.625μg/mL，450nm吸光度值为：0.416。
试验2：红细胞膜蛋白浓度：0.2mg/mL、C1q浓度0.1μg/mL、抗C1q浓度0.625μg/mL，450nm吸光度值为：0.205。
试验3：红细胞膜蛋白浓度：0.1mg/mL、C1q浓度0.2μg/mL、抗C1q浓度0.625μg/mL，450nm吸光度值为：0.235。
由此可见，采用本发明方法可以将血型抗原提取后(红细胞膜蛋白)包被到微孔板上，并可以实现血型抗体的定量检测。
本说明书上文中结合具体实施例对本发明进行了阐释，但应理解，这些描述和阐释只是为了更好地理解本发明，而不构成对本发明的任何限定。本领域技术人员在阅读了本申请说明书之后可对本发明的具体实施方式进行必要的改动而不脱离本发明的精神和范围。本发明的保护范围由所附的权利要求书限定，并且涵盖了权利要求的等同变换。
Claims (10)
1.一种用于血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒，其特征在于，包括：固定有血型抗原的固相载体、补体、酶标记的抗补体、显色液。
2.权利要求1所述的一种用于血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中补体为C1q，所述的补体C1q的浓度为0.04-400μg/mL。
3.权利要求1所述的一种用于血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒，其特征在于，所述的酶标记抗补体为辣根过氧化物酶标记的抗补体C1q，且所述的辣根过氧化物酶标记的抗补体C1q浓度为0.1-100μg/mL。
4.权利要求1-3任意一项所述的一种用于血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒，其特征在于，所述的固定有血型抗原的固相载体的制备方法包括：将固相载体的表面氨基化或醛基化；用60Co辐照固相载体或用紫外线照射固相载体；将血型抗原或含血型抗原的红细胞膜蛋白提取物用碳酸盐缓冲液稀释，以50-500μL包被固相载体，放置1-36h后去除液体，加入含5-20％牛血清白蛋白BSA的磷酸盐缓冲液，在室温下封闭1-8h，甩去液体，干燥即得。
5.权利要求5所述的一种用于血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒，其特征在于，所述的含血型抗原的红细胞膜蛋白提取物的制备方法包括：取含有血型抗原的外周血，离心后去上清，取压积红细胞，加入细胞裂解液，放置后离心去上清，向沉淀物加入水并振荡混匀，再次离心去上清，重复向沉淀物加入水并振荡混匀，离心去上清步骤2-8次，所得到的沉淀物即为含血型抗原的红细胞膜蛋白提取物。
6.权利要求1-3任意一项所述的一种用于血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括阴性对照品、阳性对照品、洗涤液、反应终止液或样品稀释液中的一种或两种以上的组合。
7.一种血型抗体的鉴定和/或检测方法，其特征在于，包括：
将待测血清或待测血浆加入固定有血型抗原的固相载体中；加入补体C1q，孵育10-300min，用洗涤液洗涤；加入酶标记的抗补体C1q，孵育10-300min，用洗涤液洗涤；加入显色液，滴入终止液，测定吸光度。
8.权利要求7所述的一种血型抗体的鉴定和/或检测方法，其特征在于，所述的待测血清或待测血浆的加入量为10-100μL。
9.权利要求7-8任意一项所述的一种血型抗体的鉴定和/或检测方法，其特征在于，所述的补体C1q加入量为10-100μL，所述的补体C1q的浓度为0.04-400μg/mL。
10.权利要求7-8任意一项所述的一种血型抗体的鉴定和/或检测方法，其特征在于，所述的酶标记的抗补体C1q加入量为10-100μL，所述的酶标记的抗补体C1q浓度为0.1-100μg/mL。
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