CN104215777B - 一种检测血红蛋白结合磷酸化alpha-突触核蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测与血液中红细胞内血红蛋白结合的磷酸化α-突触核蛋白含量的方法，所述方法包括利用抗人血红蛋白单克隆抗体作为捕获抗体，利用抗磷酸化人α-突触核蛋白单克隆抗体作为检测抗体，利用抗原-抗体反应原理检测帕金森病人和正常健康人与血红蛋白结合的磷酸化α-突触核蛋白的含量并进行比较。

Description

一种检测血红蛋白结合磷酸化alpha-突触核蛋白的方法

技术领域：

本发明涉及一种检测与血液中红细胞内与血红蛋白结合的磷酸化α-突触核蛋白含量的方法，该方法可用于帕金森病的诊断。

背景技术：

帕金森病是一种常见的神经系统退行性疾病，临床上主要表现为静止振颤、运动迟缓、肌肉僵直和姿势不稳定等运动症状。引起这些症状的原因是中脑黑质多巴胺神经元大量死亡和由此引起的纹状体部位的多巴胺神经递质的大幅度减少。帕金森病的主要病理特征是神经细胞内出现嗜酸性包涵体——路易体(Lewybody)和路易神经索(Lewyneurite)构成路易体和路易神经索的主要成分是纤维化的α-突触核蛋白(α-synuclein)。大量研究表明，α-突触核蛋白是在帕金森病的发病中起关键作用的蛋白质。α-突触核蛋白基因点突变和多倍体变异可以引起家族性早发性帕金森病，其基因启动子多态性与帕金森病的发病风险有关。已经证明，帕金森病人脑组织中的α-突触核蛋白存在改变，表现为该蛋白的表达量异常增高，磷酸化、硝基化、泛素化和糖基化的修饰体增加。异常表达和修饰的α-突触核蛋白引起该蛋白异常聚集成寡聚体，并进而形成纤维而沉积在路易体中^[4-7]。大量证据表明，异常表达、修饰的α-突触核蛋白促进其聚集成对神经元具有毒性作用的蛋白寡聚体，是各种原因导致神经元退变和帕金森病的关键。鉴于α-突触核蛋白在帕金森病发病和病理生理过程中的关键作用，检测该蛋白在体液中的变化被认为对帕金森病具有诊断意义。目前对脑脊液的检测表明，帕金森病人脑脊液中的总的α-突触核蛋白含量降低和寡聚化α-突触核蛋白含量增高，具有较高的诊断特异性和敏感性。目前对帕金森病人血液中的α-突触核蛋白的检测主要限于血清和血浆。然而，受限于检测技术的敏感性和稳定性以及其它干扰因素的影响，血清和血浆中的α-突触核蛋白的检测结果及其在帕金森病的诊断意义尚不能定论。不同研究者报道的正常值相差数百甚至上千倍。帕金森病人血浆和血清中的总α-突触核蛋白含量有报道高于正常对照、低于正常对照和没有明显变化等不同结果。帕金森病人血浆中的磷酸化α-突触核蛋白含量高于正常对照。

研究表明，血液中的α-突触核蛋白99％存在于红细胞中。由于红细胞是无核细胞，不能表达α-突触核蛋白，其胞浆的主要成分是血红蛋白，由此推测，红细胞中的α-突触核蛋白含量较高的原因很可能与血红蛋白有关。基于上述推测，我们证明了血红蛋白可以与α-突触核蛋白结合成复合体。由于α-突触核蛋白可以以被动扩散的方式通过细胞膜，因此，血红蛋白可以将胞浆中的α-突触核蛋白富集到红细胞中，导致红细胞中α-突触核蛋白含量明显高于血液中的其它组分。因此，检测红细胞中与血红蛋白结合的磷酸化α-突触核蛋白含量将有可能反应不同生理病理情况下磷酸化修饰的该蛋白的变化情况。

本发明提供一种检测红细胞内与血红蛋白结合的磷酸化α-突触核蛋白的方法，该方法具有较好的稳定性和重复性，可以检测病人和正常健康人的与血红蛋白结合的磷酸化α-突触核蛋白含量，是筛选帕金森病高危人群和临床诊断帕金森病的重要手段。

发明内容：

本发明提供一种检测红细胞内与血红蛋白结合的磷酸化α-突触核蛋白含量的方法，利用该方法所获得的结果，有助于对帕金森病进行诊断和判定治疗效果。

本发明所述方法，利用抗人血红蛋白单克隆抗体作为捕获抗体，利用抗磷酸化人α-突触核蛋白单克隆抗体作为检测抗体，利用抗原-抗体反应原理检测帕金森病人和正常健康人与血红蛋白结合的磷酸化人α-突触核蛋白的含量并进行比较。

为此，本发明提供一种检测与红细胞内与血红蛋白结合的磷酸化人α-突触核蛋白含量的方法，所述方法，包括以下步骤：

(1)分离红细胞中的胞浆蛋白；

(2)用抗人血红蛋白单克隆抗体捕获胞浆蛋白中的血红蛋白；

(3)用生物素化的抗磷酸化人α-突触核蛋白的单克隆抗体(如抗pSer129)检测与血红蛋白结合的磷酸化α-突触核蛋白；

(4)加入亲和素标记的碱性磷酸酶和显色剂，进行显色；

(5)用分光光度法对显色的样品进行吸光度测定，用标准曲线计算样品中与血红蛋白结合的磷酸化α-突触核蛋白的含量。

以下对本发明所用名称术语进行解释：

(1)抗人血红蛋白单克隆抗体：特异性识别人血红蛋白的单克隆抗体。

(2)血红蛋白结合磷酸化α-突触核蛋白：与血红蛋白发生相互作用的磷酸化人α-突触核蛋白。

(3)血红蛋白-磷酸化α-突触核蛋白复合体：在红细胞胞浆中，血红蛋白与磷酸化人α-突触核蛋白发生相互作用形成的复合物，称为血红蛋白-磷酸化α-突触核蛋白复合体。

(4)抗人磷酸化α-突触核蛋白单克隆抗体：为任何特异识别人磷酸化α-突触核蛋白的单克隆抗体。

(5)链霉亲和素标记碱性磷酸酶：在ELISA测定中，链霉亲和素标记碱性磷酸酶复合物中的链霉亲和素可以与生物素化的抗磷酸化人α-突触核蛋白的单克隆抗体结合，而复合物中的碱性磷酸酶可以催化色原底物对硝基苯磷酸盐(pNPP)生成黄色的对硝基酚(pNP)，其在入＝405nm处有最大光吸收。

(6)显色剂：为对硝基苯磷酸盐二钠盐，或4硝基苯磷酸盐，英文名称p-nitrophenylphosphatedisodium或4-nitrophenylphosphatedisodium，缩写为pNPP。用于ELISA的化学显色底物，可在碱性磷酸酶的催化下形成对硝基酚(pNP)，后者是黄色水溶产物，该产物在405nm处有最大光吸收。

(7)ELISA酶标板：在酶联免疫吸附试验(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA)中，作为载体的固相聚苯乙烯(Polystyrene)表面对抗原、抗体或抗原抗体复合物的吸附起重要作用。抗原、抗体和其它生物分子通过多种机制吸附至载体表面，这包括通过疏水键、流水/离子键的被动吸附，通过引入其它活性基团如氨基和碳基的共价结合，以及通过表面改性后的亲水键结合。

(8)PBS：磷酸缓冲液(phosphatebufferedsaline)，浓度为0.01mol/L。NaHCO3缓冲液：碳酸氢钠缓冲液，浓度为200mmol/L，pH9.6。

(9)封闭液：明胶含量为2.5％的PBST溶液，作用为封闭非特异结合，降低ELISA背景。

(10)PBST：在0.01mol/LPBS中含有0.05％Tween-20即为磷酸盐吐温缓冲液，PBST。

(11)标准曲线的制作方法如下：每次试验时将血红蛋白-磷酸化α-突触核蛋白复合体进行系列稀释，与样品同时进行检测，读取相对应405nm处吸光值，做出其与浓度之间的关系曲线。

优选的本发明的检测红细胞内与血红蛋白结合的磷酸化α-突触核蛋白含量的方法，步骤如下：

步骤1，

取静脉血，必要时可以加入EDTA、肝素或枸橼酸抗凝，分离红细胞，经过离心即得红细胞胞浆蛋白；

步骤2，

抗人血红蛋白单克隆抗体包被ELISA酶标板，并加入封闭液进行封闭，随后加入上步得到的红细胞胞浆蛋白，或血红蛋白-磷酸化α-突触核蛋白复合物标准蛋白。

步骤3，

向上步ELISA酶标板中加入生物素化的抗磷酸化人α-突触核蛋白单克隆抗体，亲和素标记的碱性磷酸酶，对硝基苯磷酸显色液；

步骤4，

在405nm处测定酶标板各孔的吸光度值，根据标准曲线计算红细胞内与血红蛋白结合的磷酸化α-突触核蛋白含量。

特别优选的本发明的检测红细胞内与血红蛋白结合的磷酸化α-突触核蛋白含量的方法，步骤如下：

步骤1，

取5-10ml抗凝血，混匀，贴壁加入至离心管中，记录全血的体积，1：1加入PBS，充分混匀。

将稀释后的全血缓慢加至淋巴细胞分离液上，离心，分离红细胞层。将红细胞转移到新的离心管中，加PBS，离心，-80℃保存。

冻存红细胞在室温融化后放入离心机，离心，上层即为红细胞胞浆蛋白。

步骤2，

包被：用NaHCO₃缓冲液稀释抗人血红蛋白抗体至终浓度为0.1-4μg/mL。向酶标板各孔加入该抗体稀释液，孵育过夜。冲洗。

封闭：向酶标板各孔加入封闭液，孵育1～2小时。冲洗。加入红细胞胞浆样品，或血红蛋白-磷酸化α-突触核蛋白复合物标准蛋白，孵育1～2小时。冲洗。

步骤3，

用封闭液稀释生物素化的抗磷酸化人α-突触核蛋白单克隆抗体至终浓度为0.1～2μg/mL。向酶标板的各孔加入该抗体稀释液，孵育1～2小时。冲洗。

用封闭液稀释亲和素标记的碱性磷酸酶，向酶标板的各孔加入该酶稀释液，孵育0.5～2小时。冲洗。

向酶标板的各孔加入对硝基苯磷酸显色液，显色10～50分钟。

步骤4，

在紫外分光光度计405nm处测定酶标板各孔的吸光度值。

根据体外制备的血红蛋白-磷酸化α-突触核蛋白复合体标准品的浓度与405nm处吸光值之间的关系曲线，计算样品中与血红蛋白结合的磷酸化α-突触核蛋白复合体的含量。

本发明所述的方法，其中，抗人血红蛋白单克隆抗体可以是任何一种特异性识别人血红蛋白的单克隆抗体，在市场上可以买到。

本发明所述的方法，其中，抗磷酸化人α-突触核蛋白单克隆抗体为任何一种识别磷酸化人α-突触核蛋白的单克隆抗体，在市场上可以买到。优选的为识别pSer129的磷酸化人α-突触核蛋白的单克隆抗体。

本发明所述的方法中，其中，pSer129磷酸化人α-突触核蛋白的制备方法如下：将630μmol/L的人基因重组α-突触核蛋白与酪蛋白激酶II(caseinkinaseII)(NewEnglandBiolabs,Ipswitch,MA,USA)在1ml缓冲液(20mMTris-HCl，pH7.5,50mMKCl,10mMMgCl2,and1mMATP)在30℃条件下反应24小时。反应通过煮沸终止。反应产物于4℃、113,000×g离心20分钟去除沉淀，上清通过阴离子交换层析纯化，并利用Westernblot分析法和质谱鉴定。得到的磷酸化α-突触核蛋白进一步用硫酸铵沉淀法浓缩。

本发明所述的方法，其中，其中生物素化的抗磷酸化人α-突触核蛋白单克隆抗体制备方法如下：

1)用无水DMSO配制10mg/mL生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液。

2)用硼酸盐缓冲液(0.1mol/L,pH8.8)配制浓度至少为1～3mg/mL的抗体溶液，若抗体储存时加入了叠氮钠，则标记前需先在硼酸盐缓冲液中充分透析以除去叠氮钠。

3)按25～100μg的比率将生物素酯加入抗体中，混合均匀并在室温下孵育4h。在完成结合反应之前，DMSO的终浓度不能低于5％，否则生物素酯会出现沉淀。高浓度的生物素酯会导致多个生物素分子结合在抗体上，因此可能会使所有抗体都被标记。较低的比率则会是使生物素化保持在最低限度(25μg生物素酯抗体的最初摩尔比为10：1)。

4)每250μg生物素酯内加入20μL的1mol/L的氯化铵，室温孵育10min。

5)将抗体溶液用PBS或其他所需的缓冲液透析，以除去未结合的生物素或者用蛋白A或蛋白G层析柱纯化标记抗体。

6)纯化抗体冷冻抽干，4-8℃保存。本发明经过研究发现，上述方法与现有检测体液样本中的磷酸化α-突触核蛋白技术相比具有如下优点：1)血液样本易于获得，适用于大规模筛查；2)红细胞内血红蛋白样本量大，提取与保存样本较便捷；3)不受溶血影响。在现有方法中，无论针对脑脊液磷酸化α-突触核蛋白的检测，还是针对血浆或血浆磷酸化α-突触核蛋白的检测，均存在溶血对样本的污染的问题。因为，红细胞中的α-突触核蛋白含量占全血的99％，因此，即使是少量溶血也能够影响测试结果；4)血红蛋白结合磷酸化α-突触核蛋白含量较高，测试结果稳定。

以下为目前针对脑脊液和血液中磷酸化α-突触核蛋白诊断方法的主要文献及其结果：

1.WangY,ShiM,ChungKA,ZabetianCP,LeverenzJB,BergD,SrulijesK,TrojanowskiJQ,LeeVM,SiderowfAD,HurtigH,LitvanI,SchiessMC,PeskindER,MasudaM,HasegawaM,LinX,PanC,GalaskoD,GoldsteinDS,JensenPH,YangH,CainKC,ZhangJ.Phosphorylatedα-synucleininParkinson'sdisease.SciTranslMed.2012Feb15；4(121):121ra20.

2.FouldsPG,DiggleP,MitchellJD,ParkerA,HasegawaM,Masuda-SuzukakeM,MannDM,AllsopD.Alongitudinalstudyonα-synucleininbloodplasmaasabiomarkerforParkinson'sdisease.SciRep.2013；3:2540.

由于本发明效果的优越性，本发明人根据上述方法制备了一种检测试剂盒，所述试剂盒包括以下试剂：

抗人血红蛋白单克隆抗体

抗磷酸化人α-突触核蛋白单克隆抗体

根据需要，所述试剂盒还可包括以下辅助试剂：

碱性磷酸酶，或亲和素标记的碱性磷酸酶

对硝基苯磷酸显色液

ELISA酶标板

PBS

NaHCO3缓冲液

封闭液

PBST

其中，

PBS的浓度为0.01mol/L，配制方法为

NaHCO3缓冲液的浓度为200mmol/L，pH9.6，配制方法为

NaHCO30.84g

20％叠氮钠(NaN3)50μl

DDW50ml

封闭液的浓度为2.5％，配制方法为

明胶2.5g

PBST100ml

PBST为含0.05％Tween-20的0.01mol/LPBS，配制方法为

上述试剂盒的使用是以血红蛋白-磷酸化α-突触核蛋白复合体作为标准蛋白，以该复合体浓度与吸光度值的关系曲线作为标准曲线，通过测定样本中的血红蛋白结合磷酸化α-突触核蛋白复合体的浓度达到诊断帕金森病的目的。

本发明的试剂盒，各试剂分别包装，优选使用包装管，每个包装管中装入试剂的量以够一个样本使用量为基本量，可以扩大到10个，100个，1000个样本的使用量。

本发明的试剂盒的使用是根据上述检测红细胞内血红蛋白结合磷酸化人α-突触核蛋白含量的方法进行的，使用时将试剂盒中的试剂根据需要配制成相应的浓度，按照所述方法测定即可。

为研究本发明，还进行了以下重复性试验，精密度试验，检测方法的筛选等试验。

将实施例3中制备的试剂盒分别取三批进行精密度实验。以实施例3中所抽取的试剂盒测定三份高、中、低值样本0.5mmol/L、0.125mmol/L和0.03125mmol/L各8次。计算测定浓度的变异系数。实施例3中的三批试剂盒的结果表明变异系数小于8.0％。

相同样本重复实验3次，结果显示相对标准差RSD为0.60％。

采用棋盘滴定试验确定抗体包被浓度、样本稀释倍数以及生物素化抗体浓度。根据初步确定的浓度缩小间距，再做进一步棋盘滴定，确定最佳试验条件。最终确定人血红蛋白抗体包被浓度为2μg/mL，样本稀释倍数为1：4，生物素化抗体浓度为1μg/mL为最佳实验条件。

附图说明：

图1红细胞胞浆蛋白分离过程示意图

图2ELISA方法检测帕金森病人(PD)红细胞中与血红蛋白结合的磷酸化α-突触核蛋白的含量明显高于健康对照(Con)。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明。

实施例1，

红细胞胞浆蛋白的制备(图1)

步骤1，

取5-10ml抗凝血(EDTA、肝素或枸橼酸抗凝)。将抗凝血上下颠倒轻轻混匀，贴壁加入至50ml离心管中，记录全血的体积，1:1加入PBS，充分混匀。

步骤2，

将稀释后的全血缓慢加至淋巴细胞分离液上，400×g，离心20min。此时管内液体由上至下的顺序依次为血浆层、白膜层(外周血单个核细胞)、分离液层以及红细胞层。

步骤3，

吸去血浆层、白膜层和分离液层，将底层的红细胞转移到新的50ml离心管中，加PBS至40ml，2000rpm，离心10min，如此反复3次。分装，-80℃保存备用。

步骤4，

冻存红细胞在室温融化后放入4℃离心机，13000rpm，离心10min，抽提红细胞胞浆蛋白备用。

实施例2，

血红蛋白结合磷酸化α-突触核蛋白的ELISA检测过程

步骤1，

包被：用NaHCO₃缓冲液稀释抗人血红蛋白抗体至终浓度为约0.1—2μg/mL。向酶标板各孔加入100μL该抗体稀释液，4℃孵育过夜。用PBST(其为含有Tween-20的PBS)冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。

步骤2，

封闭：向酶标板各孔加入100μL封闭液(其为含有明胶和Tween-20的PBS)，在37℃孵育1～2小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。

步骤3，

加样：向各孔加入100μL已制备好的红细胞胞浆样品，浓度为8～10μg/mL，在37℃孵育1～2小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。

步骤4，

加检测抗体：用封闭液稀释生物素化的抗磷酸化人α-突触核蛋白单克隆抗体抗体至终浓度为0.1～2.0μg/mL。向酶标板的各孔加入100μL该抗体稀释液，在37℃孵育1～2小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。步骤4，

加标记酶和显色液：用封闭液稀释亲和素标记的碱性磷酸酶(由Sigma公司出售)，向酶标板的各孔加入100μL该酶的稀释液，在37℃孵育0.5～2小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。

向酶标板的各孔加入100μLpNPP(对硝基苯磷酸显色液，由Sigma公司出售)，37℃显色10～50分钟。

步骤5，

测定吸光度值：用酶标仪测定405nm处酶标板各孔的吸光度值。

根据体外制备的血红蛋白-磷酸化α-突触核蛋白复合体标准品中磷酸化α-突触核蛋白的浓度与405nm处吸光值之间的关系曲线，计算样品中与血红蛋白结合的磷酸化α-突触核蛋白复合体的量。

实施例3，

ELISA法真实样品的检测(图2)

采用相对定量ELISA法，对15例临床诊断的帕金森病人和15例健康对照人群血液红细胞胞浆中与血红蛋白结合的磷酸化α-突触核蛋白的量进行检测。结果显示帕金森病人红细胞中与血红蛋白结合的磷酸化α-突触核蛋白的量明显高于健康对照(p＜0.01)。

实施例4，

试剂盒成分举例(1块ELISA酶标版，可用于24个人样本检测)

抗人血红蛋白单克隆抗体20μg

生物素化的抗磷酸化人α-突触核蛋白单克隆抗体10μg

碱性磷酸酶，或亲和素标记的碱性磷酸酶5μL

对硝基酚磷酸显色液10mL

ELISA酶标板

PBS0.01mol/L，10mL

NaHCO3缓冲液200mmol/L，10mL

封闭液10mL

PBST300mL

Claims (8)

1.一种用于检测与血红蛋白结合的磷酸化α-突触核蛋白含量的试剂盒，试剂盒中包括以下试剂：抗人血红蛋白单克隆抗体，生物素化抗磷酸化人α-突触核蛋白单克隆抗体，血红蛋白-磷酸化α-突触核蛋白复合体标准蛋白。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，根据需要，所述试剂盒还可包括以下辅助试剂：碱性磷酸酶，对硝基苯磷酸二钠显色液，ELISA酶标板，磷酸缓冲液，NaHCO3缓冲液，封闭液，PBST。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中

磷酸缓冲液的浓度和pH值为0.01mol/L，pH7.4，

NaHCO3缓冲液的浓度和pH值为200mmol/L,pH9.6，

PBST的浓度为含0.05％Tween-20的0.01mol/LPBS，

封闭液的成分为含2.5％明胶的PBST。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其中各试剂分别包装，每个包装装入试剂的量以够一个样本使用量为基本量，扩大到10个，100个，1000个样本的使用量。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中抗人血红蛋白单克隆抗体是任何一种特异性识别人血红蛋白的单克隆抗体。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中抗磷酸化人α-突触核蛋白单克隆抗体为任何一种识别磷酸化人α-突触核蛋白的单克隆抗体。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其中抗磷酸化人α-突触核蛋白单克隆抗体为：识别pSer129的磷酸化人α-突触核蛋白的单克隆抗体。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其中血红蛋白-磷酸化α-突触核蛋白复合体标准蛋白的制备方法如下：

1)用500μL的0.01mol/LPBS溶解磷酸化人α-突触核蛋白和血红蛋白，使终浓度分别为2mol/L与1mol/L，于37℃、230rpm、振荡孵育24h；

2)孵育样品在10000×g离心5min，吸取上清，以PBS为流动相，HiPrep26/60SephacrylS-200HighResolution层析柱凝胶过滤，分离血红蛋白-磷酸化α-突触核蛋白复合体；

3)用SWATH定量蛋白组方法，确定平均每个血红蛋白分子结合的磷酸化α-突触核蛋白分子数，从而计算出磷酸化α-突触核蛋白占复合体的重量百分比或摩尔百分比。