CN103954763A

CN103954763A - 一种检测受实验者体液体外促进疾病相关蛋白磷酸化修饰能力的方法

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Publication number: CN103954763A
Application number: CN201410193762.8A
Authority: CN
Inventors: 于顺; 尹娜; 杨巍巍; 李昕
Original assignee: Xuanwu Hospital
Current assignee: Xuanwu Hospital
Priority date: 2014-05-08
Filing date: 2014-05-08
Publication date: 2014-07-30

Abstract

本发明涉及一种检测受试者体液体外促进磷酸化修饰的疾病相关蛋白形成能力的方法。更具体地说，涉及一种检测受试者体液体外促进磷酸化修饰的疾病相关蛋白如α-突触核蛋白形成能力的方法。该方法包括将纯化的重组人疾病相关蛋白与受试者体液在一定温度下进行振荡孵育，然后利用能够检测磷酸化修饰蛋白质的方法检测孵育后的体液中磷酸化修饰的疾病相关蛋白如α-突触核蛋白的含量。

Description

一种检测受实验者体液体外促进疾病相关蛋白磷酸化修饰能力的方法

技术领域：

本发明涉及一种检测受试者体液体外促进磷酸化修饰的疾病相关蛋白形成能力的方法，该方法可用于帕金森病的诊断。

背景技术：

帕金森病是一种常见的神经系统退行性疾病，临床上主要表现为静止振颤、运动迟缓、肌肉僵直和姿势不稳定等运动症状(1,2)。引起这些症状的原因是中脑黑质多巴胺神经元大量死亡和由此引起的纹状体部位的多巴胺神经递质的大幅度减少。帕金森病的主要病理特征是神经细胞内出现嗜酸性包涵体——路易体(Lewy body)和路易神经索(Lewy neurite)。构成路易体和路易神经索的主要成分是α-突触核蛋白(α-synuclein)(3)。其中，约90％的α-突触核蛋白为磷酸化修饰形式(4)。大量研究表明，磷酸化修饰可促进α-突触核蛋白的聚合，从而在帕金森病的发生和发展中起关键性作用(5-9)。因此，检测磷酸化α-突触核蛋白在体液中的变化被认为对帕金森病具有诊断意义。目前研究表明，帕金森病人血液中磷酸化α-突触核蛋白含量增高，而总α-突触核蛋白及寡聚化α-突触核蛋白则无此改变(7,10)。因此，磷酸化α-突触核蛋白可能成为一种帕金森病诊断的潜在标记物。然而，由于检测技术的限制，血液中磷酸化α-突触核蛋白检测的灵敏度及特异度较低。

现有技术中对血液中磷酸化α-突触核蛋白检测方法主要有：利用ELISA方法直接检测其含量。

现有方法的缺陷是：患者和对照的差异较小，很多数据重叠，难以用于临床。本方法的优势：数据稳定，患者和对照差异较大；主要反映血浆促进α-突触核蛋白磷酸化的能力。

为克服上述缺陷，本发明提供一种检测受试者体液体外促进磷酸化修饰的疾病相关蛋白形成的方法，该方法具有较好的稳定性和重复性，可以显著区分帕金森病人和正常健康人，是帕金森病高危人群筛选、临床诊断及病情监测的重要手段。

发明内容：

本发明提供一种帕金森病的诊断方法，其中包括检测受试者体液体外促进磷酸化修饰的疾病相关蛋白如α-突触核蛋白形成能力的方法。

本发明将纯化的重组人疾病相关蛋白与受试者体液在一定温度下进行振荡孵育，然后利用鼠抗人磷酸化-α-突触核蛋白单克隆抗体作为捕获抗体，利用生物素化的鼠抗人α-突触核蛋白单克隆抗体作为检测抗体，利用抗原-抗体反应原理检测帕金森病人和正常健康人体液体外促进疾病相关蛋白磷酸化修饰形式的形成能力并进行比较。

本发明检测受试者体液体外促进磷酸化修饰的疾病相关蛋白如检测α-突触核蛋白形成能力的方法包括以下步骤和内容：

1)分离血浆；

2)加入重组人α-突触核蛋白，得到磷酸化α-突触核蛋白；

3)抗人磷酸化-α-突触核蛋白单克隆抗体和磷酸化α-突触核蛋白以及抗人α-突触核蛋白单克隆抗体孵育，随后加入碱性磷酸酶和显色剂，进行显色；

4)用分光光度法对显色的样品进行吸光度测定，根据标准曲线计算样品中磷酸化α-突触核蛋白的含量。

以下对本发明所用名称术语进行解释：

重组人α-突触核蛋白：将携带人α-突触核蛋白基因的质粒转染至大肠杆菌，培养、提取并纯化获得的帕金森病相关蛋白。

磷酸化α-突触核蛋白：129位丝氨酸发生磷酸化修饰的α-突触核蛋白。

抗人磷酸化-α-突触核蛋白单克隆抗体：抗原为含129位磷酸化修饰的丝氨酸在内的人α-突触核蛋白短肽，其氨基酸序列为GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA，与灵长类动物发生反应。本发明使用的抗人磷酸化-α-突触核蛋白单克隆抗体名称为：4E6抗体，为已知抗体，是Santa cruz公司所售的p-α-synuclein(Ser129)抗体(货号：sc-135638)。

抗人α-突触核蛋白单克隆抗体：3D5抗体，识别α-突触核蛋白第115-121个氨基酸，抗原为人重组α-突触核蛋白，与灵长类动物发生反应。(该抗体已经公开，在S.Yu,et al.Neuroscience,145(2007)539-555中已经发表，可通过购买得到)。也可以按照以下方法制备：

步骤1，蛋白抗原的制备：本实验室制备并纯化人全长α-突触核蛋白作为抗原。

步骤2，免疫小鼠；使用福氏完全佐剂(第一次免疫)与福氏不完全佐剂(随后的免疫)乳化人α-突触核蛋白，每隔2周对BALB/c雌性小鼠进行免疫(50mg抗原/只小鼠)。抽取动物血清，利用ELISA与Western blot方法检测其效价与特异性。

步骤3，用3D5杂交瘤细胞(可购买得到)产生特性性抗体。3D5杂交瘤细胞可以产生特异性抗人α-突触核蛋白抗体。

步骤4；抗体制备：3D5细胞大量扩增，并由腹膜内注射入BALB/c裸鼠体内，产生腹水，后利用protein A亲和层析纯化，得到3D5抗体。

碱性磷酸酶：在ELISA测定中，碱性磷酸酶的色原底物是对硝基苯磷酸盐(p-nitropheny-phosate，pNPP)。pNPP在碱性磷酸酶的作用下生成对硝基酚(pNP)，其在入＝405nm处有最大吸收。

亲和素标记的碱性磷酸酶：将碱性磷酸酶进行亲和素标记，亲和素可与生物素结合，起级联放大作用。

显色剂：硝基苯磷酸单钠盐,可简称为pNPP单钠。与pNPP一样，用于ELISA的化学显色底物。碱性磷酸酶和pNPP反应后，形成黄色水溶反应产物，该产物在405nm处有光吸光。

ELISA酶标板：在酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)中，作为载体的固相聚苯乙烯(Polystyrene)表面对抗原、抗体或抗原抗体复合物的吸附起重要作用。抗原、抗体和其它生物分子通过多种机制吸附至载体表面，这包括通过疏水键、流水/离子键的被动吸附,通过引入其它活性基团如氨基和碳基的共价结合，以及通过表面改性后的亲水键结合。

PBS：磷酸缓冲液(phosphate buffer solution)，浓度为0.01mol/L。

NaHCO₃缓冲液：碳酸氢钠缓冲液，浓度为200mmol/L，PH9.6。

封闭液：明胶含量为2.5％的PBST溶液，作用为封闭非特异结合，降低ELISA背景。

PBST：在0.01mol/L PBS中含有0.05％Tween20即为磷酸盐吐温缓冲液， PBST。

标准曲线的制作方法如下：每次试验时将磷酸化α-突触核蛋白肽段进行系列稀释，终浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0μmol/L，与样品同时进行检测，读取相对应405nm处吸光值，做出其与浓度之间的关系曲线。

生物素化的抗人α-突触核蛋白单克隆抗体3D5，其制备方法如下：

步骤1，用无水DMSO配制10mg/ml生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液。

步骤2，用硼酸盐缓冲液(0.1mol/L,pH8.8)配制浓度至少为1～3mg/ml的抗体3D5溶液，若抗体储存时加入了叠氮钠，则标记前须先在硼酸盐缓冲液中充分透析以除去叠氮钠。

步骤3，按25～100μg/mg的比率将生物素酯加入抗体3D5中，混合均匀并在室温下孵育4h。

步骤4，每250μg生物素酯内加入20μl1mol/L的氯化铵，室温孵育10min。

步骤5，将抗体3D5溶液用PBS或其他所需的缓冲液透析，以除去未结合的生物素。

步骤6，按纯化抗体3D5的储存方法保存标记抗体3D5。

优选的本发明的检测α-突触核蛋白形成能力的方法，步骤如下：

步骤1，

取静脉血，必要时可以加入EDTA、肝素或枸橼酸抗凝，分离血浆层备用；

步骤2，

血浆中加入重组人α-突触核蛋白，得到磷酸化α-突触核蛋白；

步骤3，

ELISA酶标板中加入抗人磷酸化-α-突触核蛋白单克隆抗体和磷酸化α-突触核蛋白，以及抗人-α-突触核蛋白单克隆抗体进行孵育，加入亲和素标记的碱性磷酸酶，对硝基酚磷酸显色液；

步骤4，

在405nm处测定酶标板各孔的吸光度值，根据标准曲线计算磷酸化-α-突触核蛋白的含量。

特别优选的本发明的检测α-突触核蛋白形成能力的方法，步骤如下：

步骤1，

血浆的分离：

抽取5-10ml抗凝血(EDTA、肝素或枸橼酸抗凝)。将抗凝血上下颠倒轻轻混匀，贴壁加入至50ml离心管中，记录全血的体积，1:1加入PBS，充分混匀。

将稀释后的全血缓慢加至淋巴细胞分离液上，400×g，离心20min。此时管内液体由上至下的顺序依次为血浆层、白膜层(外周血单个核细胞)、分离液层以及红细胞层。

吸取表面的血浆层、分装，-80℃保存备用。

步骤2，

磷酸化α-突触核蛋白的体外制备：将血浆用PBS适当稀释，加入一定浓度的重组人α-突触核蛋白，在恒温振荡器中37℃振荡孵育一定时间，于4℃保存备用。

步骤3，

包被：用NaHCO₃缓冲液稀释抗人磷酸化-α-突触核蛋白单克隆抗体至终浓度为0.1～1μg/mL。向酶标板各孔加入100μL该抗体稀释液，4℃孵育过夜。用PBST(其为含有吐温的PBS)冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。

封闭：向酶标板各孔加入100μL封闭液(其为含有明胶和吐温的PBS)，在37℃孵育1～2小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。

向各孔加入100μL已制备好的磷酸化α-突触核蛋白样品稀释液，在37℃孵育1～2小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。

用封闭液稀释生物素化的抗人α-突触核蛋白单克隆抗体3D5抗体至终浓度为0.1～1μg/mL。向酶标板的各孔加入100μL该抗体稀释液，在37℃孵育1～2小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。

用封闭液稀释亲和素标记的碱性磷酸酶(由Sigma公司出售)，向酶标板的各孔加入100μL该酶的稀释液，在37℃孵育0.5～2小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。

向酶标板的各孔加入100μL pNPP(对硝基酚磷酸显色液，由Sigma公司出售)，37℃显色10～50分钟。

步骤4，

测定405nm处酶标板各孔的吸光度值。

根据磷酸化α-突触核蛋白标准品浓度与405nm处吸光值之间的关系曲线计算受试者血液中磷酸化α-突触核蛋白的形成量。

本发明经过研究发现，上述方法与现有技术相比具有如下优点：

诊断准确性提高；

诊断灵敏度及特异度提高。

以下通过比较证明本发明的优点：

Foulds PG等人2011年的一篇文献报导血浆中自身磷酸化α-突触核蛋白含量可作为帕金森病诊断标记物，该方法ROC曲线下面积为0.68；Foulds PG等人2013年另一篇关于血浆中自身磷酸化α-突触核蛋白含量的纵向研究报导，该方法ROC曲线下面积为0.717。而本发明ROC曲线下面积可达0.901，诊断准确性明显高于前者。

根据以上文献报导中的ROC曲线可得出其大致灵敏度及特异度，分别为0.6及0.75。而本方法灵敏度及特异度分别为0.795及0.886，可见本方法灵敏度及特异度均有提高。

由于本发明效果的优越性，本发明人根据上述方法制备了一种检测试剂盒，所述试剂盒包括以下试剂：

重组人α-突触核蛋白

抗人磷酸化-α-突触核蛋白单克隆抗体

生物素化抗人α-突触核蛋白单克隆抗体

根据需要，所述试剂盒还可包括以下辅助试剂：

碱性磷酸酶，或亲和素标记的碱性磷酸酶

对硝基酚磷酸显色液

ELISA酶标板

PBS

NaHCO₃缓冲液

封闭液

PBST

其中，

PBS的浓度为0.01mol/L，配制方法为

NaHCO₃缓冲液的浓度为200mmol/L，pH9.6，配制方法为

NaHCO₃ 0.84g

20％叠氮钠(NaN₃) 50μl

DDW 50ml

封闭液的浓度为2.5％，配制方法为

明胶 2.5g

PBST 100ml

PBST为含0.05％Tween20的0.01mol/L PBS，配制方法为

上述试剂盒的使用是以血浆中磷酸化-α-突触核蛋白作为标准蛋白，以磷酸化-α-突触核蛋白与吸光度值的关系曲线作为标准曲线，通过测定样本中的磷酸化-α-突触核蛋白的浓度以及形成率达到诊断帕金森病的目的。

本发明的试剂盒，各试剂分别包装，优选使用包装管，每个包装管中装入试剂的量以够一个样本使用量为基本量，可以扩大到10个，100个，1000个样本的使用量。

本发明的试剂盒的使用是根据上述检测血浆中磷酸化-α-突触核蛋白的方法进行的，使用时将试剂盒中的试剂根据需要配制成相应的浓度，按照所述方法测定即可。

为研究本发明，还进行了以下重复性试验，精密度试验，检测方法的筛选等试验

相同样本重复实验3次，结果显示相对标准差RSD为0.60％。

将实施例3中制备的试剂盒分别取三批进行精密度实验。以实施例3中所抽取的试剂盒测定三份高、中、低值样本0.5μmol/L、0.125μmol/L和0.03125μmol/L各8次。计算测定浓度的变异系数。实施例3中的三批试剂盒的结果表明变异系数小于8.0％。

采用棋盘滴定试验确定抗体包被浓度以及生物素化抗体浓度。根据初步确定的浓度缩小间距，再做进一步棋盘滴定，确定最佳试验条件。最终确定包被浓度为0.1～1μg/mL，生物素化抗体浓度为0.1～1μg/mL。

附图说明：

图1为红细胞分离过程中，不同成分分层示意图。

图2为92例对照与PD患者血浆中磷酸化α-Syn形成量的ELISA检测结果。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明。

实施例1，

具体步骤如下：

(1)血浆的分离：

·抽取5-10ml抗凝血(EDTA、肝素或枸橼酸抗凝)。将抗凝血上下颠倒轻轻混匀，贴壁加入至50ml离心管中，记录全血的体积，1:1加入PBS，充分混匀。

·将稀释后的全血缓慢加至淋巴细胞分离液上，400×g，离心20min。此时管内液体由上至下的顺序依次为血浆层、白膜层(外周血单个核细胞)、分离液层以及红细胞层。

·吸取表面的血浆层、分装，-80℃保存备用。

(2)磷酸化α-突触核蛋白的体外制备：将血浆用PBS适当稀释，加入一定浓度的重组人α-突触核蛋白，在恒温振荡器中37℃振荡孵育一定时间，于4℃保存备用。

(3)包被：用NaHCO₃缓冲液稀释抗人磷酸化-α-突触核蛋白单克隆抗体至终浓度为0.1～1μg/mL。向酶标板各孔加入100μL该抗体稀释液，4℃孵育过夜。用PBST(其为含有吐温的PBS)冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。

(4)封闭：向酶标板各孔加入100μL封闭液(其为含有明胶和吐温的PBS)，在37℃孵育1～2小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。

(5)向各孔加入100μL已制备好的磷酸化α-突触核蛋白样品稀释液，在37 ℃孵育1～2小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。

(6)用封闭液稀释生物素化的抗人α-突触核蛋白单克隆抗体3D5抗体至终浓度为0.1～1μg/mL。向酶标板的各孔加入100μL该抗体稀释液，在37℃孵育1～2小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。

(7)用封闭液稀释亲和素标记的碱性磷酸酶(由Sigma公司出售)，向酶标板的各孔加入100μL该酶的稀释液，在37℃孵育0.5～2小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。

(8)向酶标板的各孔加入100μLpNPP(对硝基酚磷酸显色液，由Sigma公司出售)，37℃显色10～50分钟。

(9)测定405nm处酶标板各孔的吸光度值。

(10)根据磷酸化α-突触核蛋白标准品浓度与405nm处吸光值之间的关系曲线计算受试者血液中磷酸化α-突触核蛋白的形成量。

实施例2，

血浆促进α-突触核蛋白磷酸化修饰的能力的检测

采用相对定量ELISA法，对44例临床诊断的帕金森病人和44例健康对照血浆促进α-突触核蛋白磷酸化修饰的能力进行了检测。结果显示帕金森病人血浆中磷酸化α-突触核蛋白形成量为68.2μmol/L；而正常健康对照血浆中磷酸化α-突触核蛋白形成量为41.6μmol/L。帕森病人血浆中磷酸化α-突触核蛋白形成量明显高于正常健康对照(p＜0.01)。

实施例3，

试剂盒成分举例

重组人α-突触核蛋白，10mg

抗人磷酸化-α-突触核蛋白单克隆抗体10μg

生物素化的抗人α-突触核蛋白单克隆抗体10μg

碱性磷酸酶，或亲和素标记的碱性磷酸酶5μl

对硝基酚磷酸显色液10ml

ELISA酶标板

PBS10ml

NaHCO₃缓冲液10ml

封闭液20ml

PBST500ml

以下为参考文件：

Reference List

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Claims

1.一种用于检测磷酸化修饰的α-突触核蛋白含量的试剂盒，试剂盒中包括以下试剂：重组人α-突触核蛋白，抗人磷酸化-α-突触核蛋白单克隆抗体，抗人α-突触核蛋白单克隆抗体或生物素化的抗人α-突触核蛋白单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，根据需要，所述试剂盒还可包括以下辅助试剂：

碱性磷酸酶，或亲和素标记的碱性磷酸酶

对硝基酚磷酸显色液

ELISA酶标板

PBS

NaHCO₃缓冲液

封闭液

PBST。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中

PBS的浓度为0.01mol/L，

NaHCO₃缓冲液的浓度为200mmol/L，pH9.6,

封闭液的浓度为2.5％，

PBST为含0.05％Tween-20的0.01M PBS。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其中各试剂分别包装，每个包装装入试剂的量以够一个样本使用量为基本量，可以扩大到10个，100个，1000个样本的使用量。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中抗人磷酸化α-突触核蛋白单克隆抗体为4E6抗体。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，所述抗人α-突触核蛋白单克隆抗体为3D5抗体。

7.生物素化的抗人α-突触核蛋白单克隆抗体3D5，其制备方法如下：

步骤2，用0.1mol/L,pH8.8硼酸盐缓冲液配制浓度为1～3mg/ml的抗体3D5溶液，若抗体储存时加入了叠氮钠，则标记前须先在硼酸盐缓冲液中充分透析以除去叠氮钠。

步骤6，按纯化抗体3D5的储存方法保存标记抗体3D5。

8.一种用权利要求1的试剂盒检测磷酸化α-突触核蛋白含量的方法，包括以下步骤：

(1)分离血浆；

(2)加入重组人α-突触核蛋白，得到磷酸化α-突触核蛋白；

(3)抗人磷酸化-α-突触核蛋白单克隆抗体和磷酸化α-突触核蛋白以及抗人α-突触核蛋白单克隆抗体孵育，随后加入碱性磷酸酶和显色剂，进行显色；

(4)用分光光度法对显色的样品进行吸光度测定，根据标准曲线计算样品中磷酸化α-突触核蛋白的含量。

9.根据权利要求8所述的方法，步骤如下：

步骤1，

步骤2，

步骤3，

步骤4，

10.根据权利要求9所述的方法，步骤如下：

步骤1，

血浆的分离：

吸取表面的血浆层、分装，-80℃保存备用。

步骤2，

步骤3，

用封闭液稀释亲和素标记的碱性磷酸酶，向酶标板的各孔加入100μL该酶的稀释液，在37℃孵育0.5～2小时。用PBST冲洗酶标板各孔，根据需要确定冲洗次数和时间。

向酶标板的各孔加入100μL pNPP(对硝基酚磷酸显色液)，37℃显色10～50分钟。

步骤4，

测定405nm处酶标板各孔的吸光度值。