SU1496643A3 - Способ определени человеческого гемоглобина в фекали х - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к медицине, точнее, к биохимическим методам обнаружени  скрытой крови в фекали х. Целью способа  вл етс  повышение специфичности и чувствительности способа.Гемоглобин человека выдел ют из пробы с помощью иммунохимической реакции, т.е. реакции между антителом и антигеном, при использовании закрепленного в твердой фазе специфического антитела гемоглабина человека. Затем определ ют с помощью ферментативной реакции наличие гемоглобина, соединившегос  с антителом

Description

Изобретение относитс  к медицине, точнее к биохимическим методам обнаружени  скрытой крови при диагностике различных клинически трудно диагностируемых кишечных заболеваний, таких как новообразовани  толстой и пр - . мой кишки,аденомы, звы и дивертикулы.

Цель изобретени  - повьшение специфичности и чувствительности определени .

Способ основываетс  на двухфазном анализе скрытой крови, соедин ющий высокочувствительный анализ с использованием гва ковой смолы с высокоспе- цифическнм и чувствительным иммуно- химическим анализом, с помощью которого определ етс  только человеческий гемоглобин. Эта комбинаци  аналнзов устра1  ет ложные положительные результаты анализа,.а также необходимость в контроле за пищевым режимом.

Необходимое дл  предлагаемого способа оборудование включает пакет дл  анализа кала, в который помещают пробу, и второй пакет, имеющий бумаж- ньй фильтр. Абсорбент (бумажный фильтр) прикрепл етс  к оболочке пакета так, что находитс  между пропитанной гва ковой смолой, бумагой пакета и пластмассовой крьшкой.

Когда гемоглобин экстрагируют из абсорбента, получают раствор, со- держащий гемоглобин (Нв) и другие растворимые молекулы из кала, этот раствор перенос т пипеткой в кювету из набора полистироловых кюветок на

СР

О5 СГ5 00

о

3149

creHKVi и на дно которой нанесено определенное количество антитела человеческого гемоглобина. Здесь гемоглобин пробы (антиген) св зывает- с  с антигемоглобином твердой фазы (IgG), После инкубационного периода, равного, времени протекани  иммунологической реакции, кюветку промывают водой дл  удалени  всех несв - занных веществ.

Тверда  фаза может представл ть собой полимер, отличный от полистирола , и иметь иную форму, отличную от кюветы или сосуда,например шари- |ка, кольца, диска.

I После того как кюветка промыта, в нее помещают определенное количество IgG антитела человеческого гемоглобина , при этом IgG имеет какой- либо фермент в качестве индикатора. Св зывание помеченного ферментом IgG с антителом в твердой фазе зависит от количества свободных антител в твердой фазе, оставшихс  пос- ле обработки пробы. Так, с помощью фермента можно проверить, была ли реакци  между антителом (анти-НЬ человека) с антигеном (человеческим НЬ) путем добавлени  субстрата, спе- цифичного дл  данного фермента, при этом фермент вьщел ет из субстрата окрашенное видимое или фотометрически регистрируемое соединение. Количество фермента можно определить ли- бо измер   количество, соединившеес  с твердой фазой, либо количество, оставшеес  в растворе свободным.

. Анализ FECA-EIA позвол ет обнаружить только интактный гемоглобин че- ловека, а анализ на основе гва ковой смолы также обнаруживает продукты распада гемоглобина. Кроме того, устран ютс  ошибки, вызванные присутствием гемоглобинов животных, при- сущие известнь1м способам.

Пример. С лабораторной стороны крышки корпуса пакета берут абсорбент , содержащий пробу, и помещают в кюветку анализатора FP-9. Полистиро- лова  кюветка FP-9 предварительно сенсибилизирована с помощью иммуно глобулиновой фракции антигемоглобина 200 мкл буферного раствора, содержащего фосфат (0,1 М полибутадиенстиро ла, ,4), добавл ют в кюветку. Инкубаци , например, 2 ч при С. Кюветку промывают 400 мкл дистиллированной воды В кюветку добавл ют

200 мкл иммуноглобулиновой фракции антигемоглобина человека (полибута- диенстирол в качестве растворител ) с подход щим ферментом, например щелочной фосфатазой (добавка конъю- гата). Инкубаци , например, в течение 2 ч при . Промывка аналогична . Добавл етс  субстрат, специфичный дл  фермента, который используетс  в конъюгате (паранитрофенилфос- фат). После 30 мин инкубации при +37 добавл етс  200 мкл 0,1 М NaOH дл  остановки реакции. Результат оцениваетс  фотометрически.

Рекомендуемым пределом прекращени  реакции  вл етс  среднее значение абсорбции (минус контрольное значение ), нормальных некровоточащих проб +3 стандартных отклонений или при отсутствии таких данных - 9200 единиц.

Наименьшие количества, обнаруженные посредством этого анализа, составл ют 0,05-0,1 мкг цианметгемогло- бина (мл 1-5 мкл гемолизированной крови на 1 г фекалий), 140-700 мкг гемоглобина (г фекалий) и от 2,0 до 5,0 мкл цельной крови (г фекалий , (280-700 мкг .гемоглобина (г фекалий)

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ определени  человеческого гемоглобина в фекали х путем иммуно- химического анализа, отличающийс  тем, что, с целью повьше- ни  специфичности и чувствительности способа,1 г образца адсорбируют через бумагу, пропитанную гва ковой смолой на фильтровальную бумагу, фильтровальную бумагу помещают в измерительную  чейку кюветы, предварительно обработанную в течение 15 ч при иммуноглобулиновой фракцией человеческого антигемоглобина, добавл ют 200 мкл раствора фосфатного буфера рН 7,4, содержащего 0,1 М поли- бутадиенстирола,инкубируют 2 ч при 37°С, промывают  чейку 400 мкл дистиллированной воды, внос т 200 мкл . раствора иммуноглобулиновой фракции человеческого антигемоглобина, соединенного с щелЬчной фосфатазой и растворенного в растворе фосфатного буфера, инкубируют 2 ч при 37 С, повторно промывают, добавл ют 200 мк паранитрофенилфосфата и после инку 14966436

   бировани  в течение 30 мин при при 405 им определ ют общий уровень реакцию прекращают с помощью 200 мкл содержани  человеческого гемогло- , М раствора NaOH и по поглощению бина в образце.