CS228136B2 - Isolation of haemoglobin or product of its decay from excrements - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu izolace ' hemoglobinu nebo produktů jeho rozkladu z fekálií za účelem jeho popřípadě jejich následujícího stanovení.

Pro stanovení latentní krevní složky ve výkalech je známo několik metod. Jedna z těchto metod je založena na detekci heminu, uvolněného z hemoglobinu ve výkalech. Při této metodě se vzorek výkalu umístí na regenerační papírek, obsahující guajakovou pryskyřici. Po přikápnutí roztoku peroxidu vodíku na reagenční papírek reaguje fekální hemin jako enzym peroxydáza, přičemž dochází k oxidaci guajakové pryskyřice na modrou sloučeninu. Intenzita vzniklého modrého zabarvení je potom úměrná koncentraci hemoglobinu ve vzorku výkalu.

Zařízení, kterého je možno pro výše popsaný způsob stanovení použít (tzv. souprava pro fekatest '), je popsáno v patentovém spise US 4 092 120.

Toto zařízení je tvořeno základní deskou, do jejíž horní části je vyhlouben otvor menšího průměru. Do spodní části základní desky je zase vyhlouben otvor většího průběru. Oba tyto otvory jsou souosé. Deskou je tedy vyhlouben tunel, který se za polovinou tloušťky desky náhle rozšiřuje a prochází celou tloušťkou základní desky. Pro názornost pojmenujme horní užší část otvoru úz2 kým tunelem, spodní širší část otvoru širším tunelem a rozhraní těchto tunelů uprostřed tloušťky základní desky vnitřním mezikružím. Při provádění stanovení fekálního hemoglobinu se zespoda základní desky vloží kotouč reagenčního papíru, například filtračního papíru, který má stejný průměr jako je průměr širšího tunelu, do širšího tunelu tak, až dosedne na vnitřní mezikruží. Zde se tento kotouč reagenčního papíru fixuje spodním kruhovým víčkem, které má také stejný průměr jako je průměr širšího tunelu. Toto spodní kruhové víčko se do širšího tunelu namačkne. Shora se do užšího tunelu vloží vzorek zkoumaného výkalu a užší tunel se uzavře horním víčkem stejného průměru jako má užší tunel. Vzorek výkalu je takto stlačen v testovacím prostoru, vymezeném stěnami užšího tunelu, horním víčkem a povrchem reagenčního papíru, který přiléhá k užšímu tunelu a který nedosedá na vnitřní mezikruží. Kapalný podíl výkalu se takto nasákne do reagenčního papíru, · ve kterém se po oddělení pevného podílu výkalu může provést výše uvedené stanovení pomocí oxidace guajakové pryskyřice.

Společným nedostatkem dosud používaných metod pro stanovení ' latentního ' fekálního hemoglobinu je to, že nelze tímto stanovením odlišit lidský hemoglobin a hemo228136 globin zvířecího původu, který se do lidské stolice může dostat z krve, pocházející z masité stravy. Stejně tak peroxydázy, pocházející ze stravy rostlinného původu, jako například z tuřínu nebo křenu, jsou schopny za přítomnosti peroxidu vodíku oxidovat guajakovou pryskyřici na modře zbarvenou sloučeninu, čímž se do stanovení lidského hemoglobinu vnáší pozitivní chyba.

Cílem vynálezu je tedy eliminovat výše uvedené nedostaky dosud známých metod stanovení lidského fekálního hemoglobinu.

Výše uvedené nedostatky nemá způsob izolace hemoglobinu nebo produktů jeho rozkladu z fekálií za účelem jeho popřípadě jejich následného stanovení podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se lidský hemoglobin izoluje ze vzorku imunologickou reakcí za použití protilátky specifické pro lidský hemoglobin, například ve formě G-imunoglobulinové frakce lidského krevního séra, a fixované na pevné fázi, například na polystyrenu.

Hemoglobin nebo jeho rozkladové produkty přítomné ve vzorku fekálií se výhodně před imunologickou reakcí absorbují v absorbentu, například ve filtračním papíru, ze kterého se potom eluují.

Jak je obecně známo, reaguje antigen s odpovídající protilátkou za vzniku imunologického komplexu. Jedna z těchto složek může být vázána na pevnou fázi, s výhodou na nějaký polymer, přičemž druhá z obou složek, jejíž obsah ' má být stanoven, je v roztoku, který se uvede do styku s první z obou složek, vázanou na pevnou fázi, čímž dojde k interakci obou složek a k vytvoření imunologického. . komplexu . antigen-protilátka.

Kvantitativní stanovení antigenu nebo protilátky .může být potom provedeno ' tak, že se k reakční směsí přidá určité množství enzymem' — . značené . — aditivní složky, přičemž uvedená . aditivní . složka má stejné imunologické vlastnosti jako složka, .. která má být stanovena, tzn·,. že má stejné imunologické vlastnosti. jako antigen nebo protilátka, které mají být stanoveny. V případě, že je třeba . stanovit obsah určitého antigenu, potom se přidá enzymem — značená — aditivní složka, která má stejné imunologické vlastnosti jako stanovovaný antigen, zatímco v případě, že je třeba stanovit obsah určité protilátky, potom se přidá enzymem — . značená —- aditivní složka, která má stejně imunologické vlastnosti jako stanovovaná protilátka. Kvantita vázané enzymem — značené — aditivní složky potom samozřejmě závisí na množství stanovované složky. Množství vázané enzymem — značené — aditivní složky se jednoduše zjistí tím, že se stanoví buď enzymatická účinnost pevné fáze, nebo enzymatická účinnost reakčního roztoku, přičemž tato enzymatická účinnost je potom úměrná obsahu stanovované složky.. Takovýto enzymatický imunologický test je popsán například v USA-patentech č. 3 654 090 a 4 016 043.

Tohoto imunologického způsobu stanovení, při kterém je jedna ze složek (antigen nebo protilátka) vázána na pevnou fázi, však dosud nebylo použito pro stanovení fekálního hemoglobinu.

Hlavním . znakem způsobu stanovení fekálního hemoglobinu podle vynálezu je, že sé lidský hemoglobin izoluje ze vzorku výkalu pomocí imunologické reakce, tzn. reakce mezi antigenem a protilátkou, za · použití speŽcifické protilátky pro lidský hemoglobin, která je vázána na pevnou fázi, přičemž se lidský hemoglobin váže . k pevné fázi vazbou s uvedenou specifickou protilátkou za . vzniku imunologického komplexu lidský hemoglobin — specifická. protilátka pro lidský hemoglobin. Tento imunologický způsob stanovení založený na detekci antigenu je dostatečně citlivý pro stanovení i velmi malých množství hemoglobinu nebo jeho rozkladových produktů.

Způsob stanovení fekálního hemoglobinu podle vynálezu bude v následující části popisu detailněji popsán s odkazy na připojené výkresy, na kterých — obr. 1 zobrazuje zařízení pro . fekatest, ve kterém se provádí absorpce krevní složky, obsažené ve výkalu, v absorbentu;

— obr. . 2 zobrazuje absorbent v elučním stupni společně se soustavou použitých eluč- ních kyvet, kde dvě z použitých kyvet jsou pro názornost zobrazeny v částečném řezu; a — obr. 3 zobrazuje soustavu kyvet, použitou pro imunologickou reakci, přičemž zde jsou molekuly protilátky, . vázané na stěny kyvet, zobrazeny pro názornost ve zvětšeném . měřítku . a dvě . z .použitých kyvet jsou zobrazeny v částečném řezu.

Zařízení, které může být použito pro stanovení způsobem podle vynálezu, je zobrazeno na obrázku 1. Toto zařízení je obdobné se zařízením pro fekatest, které již bylo popsáno výše. Do tohoto zařízení lze vzorek výkalu umístit snadno a hygienicky. Uvedená souprava, .pro fekatest má na „laboratorní straně “ 2 jako absorbent například filtrační papír (a to buď jeden, nebo několik malých filtračních papírů, anebo jeden veliký filtrační papír).

Na . laboratorní straně soupravy pro fekatest, určené pro hygienický transport a analýzu fekálních vzorků, je tedy uspořádán absorpční materiál . 3 (například ve formě filtračního papíru), ve kterém se absorbují krevní . hemoglobin nebo/a produkty jeho rozkladu, . které . jsou případně obsaženy ve výkalech.

Uvedený absorbent je v soupravě pro fekatest . fixován mezi papírem, který je impregnován guajakovou pryskyřicí, a víčkem z. plastické . hmoty, a to na laboratorní straně této soupravy. Samozřejmě je možné použít i jiného typu uchycení uvedeného absorbentu. Absorbent . 3 . je v soupravě uchycen tak, že je . možné ho potom snadno vyj228136 β

mout a přemístit do jiného vhodného reakčního prostředí, jakým může být například soubor kyvet 4 (obr. 2], určených pro eluci hemoglobinu nebo jeho produktů rozkladu.

Hemoglobin nebo produkty jeho rozkladu ze vzorku fekálií, absorbované ve filtračním papíru nebo v jiném porézním absorpčním materiálu 3, mohou být potom z tohoto absorpčního materiálu eluovány. V eluátu 5 je dále možné stanovit obsah hemoglobinu již uvedenou enzymatickou imunologickou metodou nebo jinou vhodnou imunologickou metodou. Také je rovněž možné použít při tomto imunologickém stanovení přímo tento absorbent s absorbovaným hemoglobinem.

Po případné eluci hemoglobinu z uvedeného absorbentu se získá roztok, který obsahuje hemoglobin (obvykle označovaný jako Hb] a další rozpustné molekuly, které byly původně obsaženy ve vzorku fekálií. Jestliže se potom přenese pipetou do kyvetv, tvořící součást soupravy polystyrénových kyvet 7 (obr. 3) a mající na své stěně a na svém dně fixováno určité množství specifické protilátky 6 pro lidský hemoglobin (anti-Hb), potom proběhne reakce typu protilátka-antigen mezi protilátkou, tj. specifickou protilátkou pro lidský hemoglobin, a antigenem, tj. lidským hemoglobinem, obsažený ve zkoumaném vzorku.

Tímto způsobem dojde к vázání lidského hemoglobinu (Hb), obsaženého ve vzorku, na pevnou fázi, na které je fixovaná G-imunoglobulinová frakce (IgB) lidského krevního séra (v této frakci je na IgG vázána specifická protilátka pro lidský hemoglobin).

Po určité inkubační době, která je nezbytná pro proběhnutí imunologické reakce, se kyveta 7, představující pevnou fázi, pečlivě promyje za účelem odstranění veškerých nevázaných látek, je samozřejmé, že je možné použít i jiné pevné fáze; rovněž tvar pevné fáze nemusí mít tvar kyvety, jako tomu je v uvedeném a zobrazeném konkrétním provedení, ale může mít například tvar koule, kroužku, kotouče nebo podobně.

V následujícím stupni stanovení je třeba vyhodnotit průběh imunologické reakce, tzn. stanovit, zda došlo к vázání určitého množství lidského hemoglobinu ze vzorku na specifickou protilátku pro lidský hemoglobin. Toto vyhodnocení je možné například provést jedním z dále uvedených způsobů:

1) Když bylo dosaženo navázání lidského hemoglobinu ze vzorku na specifickou protilátku pro lidský hemoglobin, fixovanou na povrch kyvety 7, a po promytí této kyvety se do kyvety přidá určité množství frakce imunoglobulinu G (IgG) schopného specifické vazby s protilátkou pro lidský hemoglobin a konjugovaného s nějakým enzymem, kterého je použito ve funkci značící složky (enzymem značený imunoglobulin). Vázání tohoto enzymem značeného imunoglobulinu G na specifickou protilátku pro lidský hemoglobulin, fixovanou v pevné fázi, závisí potom na tom, jaké množství volné specifické protilátky pro lidský hemoglobin ještě v pevné fázi zůstalo po styku této pevné fáze se vzorkem, ve kterém se stanovuje obsah lidského hemoglobinu. Tímto způsobem je možné prostřednictvím značení enzymem potom vyhodnotit kvantitativní průběh reakce mezi protilátkou (specifická protilátka pro lidský hemoglobin) a antigenem (lidský hemoglobin) jednoduše tím, že se přidá substrát, který je specifický pro použitý enzym, načež tento enzym rozštěpí uvedený substrát za vzniku barevná sloučeniny, jejíž množství, závislé na množství enzymu a úměrné vzniklému zbarvení, může být vyhodnoceno vizuálně nebo fotometricky. Tato tzv. sendvičová technika spojená s enzymatickou imunologickou metodikou byla již popsána, například ve výše uvedeném patentu US 4 016 043. Přitom může být stanoveno buď množství enzymu v pevné fázi, nebo množství enzymu v reakčním roztoku, který takto obsahuje zbylý nevázaný (na pevnou fázi) enzymem značený imunoglobulin G).

2) Další možnou variantou vyhodnocení průběhu imunologické reakce je metoda, při které se ke vzorku stanovovaného lidského hemoglobinu před jeho kontaktem se specifickou protilátkou pro lidský hemoglobin, fixovanou na pevnou fázi, přidá známé množství enzymem značeného lidského hemoglobinu, přičemž jak lidský hemoglobin ze vzorku, tak i enzymem značený lidský hemoglobin si vzájemně konkurují při vázání se specifickou protilátkou pro lidský hemoglobin, f^ovanou na pevnou fázi. Průběh imunologické reakce typu antigen-protilátka může být potom zviditelněn přidáním substrátu, který je specifický pro použitý enzym a který je enzymem rozštěpen za vzniku barevné sloučeniny. Tato tzv. konkurenční enzymatická imunologická metoda byla již popsána například ve výše zmíněném patentu US 3 654 090.

3) Při další alternativní metodě je možné použít přímo jíž výše zmíněnou guajakovou pryskyřici. Když lidský hemoglobin reagoval se specifickou protilátkou pro lidský hemoglobin, fixovanou na pevné fázi, a kyveta byla promyta vodou, přidá se do kyvety známé množství guajakové pryskyřice. Jestliže vzorek obsahoval lidský hemoglobin a tento hemoglobin se vázal prostřednictvím protilátky pro lidský hemoglobin na stěnu kyvety, potom proběhne pseudoperoxydázová reakce, při které se guajaková pryskyřice oxiduje v přítomnosti peroxidu vodíku na modrou sloučeninu, přičemž intenzita vzniklého zbarvení může být změřena fotometricky. Intenzita tohoto zbarvení je úměrná množství lidského hemoglobinu ve vzorku fekálií. Při této metodě se tedy nevyužívá enzymatického štěpení substrátu jako při výše popsaných dvou enzymatických imunologických metodách.

Nicméně v důsledku použití specifické protilátky pro lidský hemoglobin se i touto metodou stanoví pouze lidský hemoglobin.

V následující části popisu bude uveden příklad konkrétního provedení způsobu podle vynálezu.

Příklad provedení

Při tomto konkrétním stanovení se postupuje následujícím způsobem. Absorbent obsahující vzorek se vyjme z laboratorní části výše popsané soupravy pro fekatest a umístí se do polystyrénové kyvety, která byla předem sensibilizována G-imunoglobulinovou frakcí lidského krevního séra, ve které je na IgG vázána protilátka pro lidský hemoglobin, načež se do této kyvety přidá 200 μ\ roztoku chloridu sodného pufrovaného fosfátem (pH 7,4) a uvedený systém se potom inkubuje po dobu dvou hodin při teplotě 37 °C. Kyveta se promyje 400 μΐ destilované vody a do kyvety se přidá 200 μΐ frakce imonoglobulinu G schopného vazby s protilátkou pro lidský hemoglobin a značeného alkalickou fosfatázou. Tento systém se inkubuje. po dobu dvou hodin při teplotě 37 °C, načež se kyveta promyje 400 μΐ destilované vody a

Claims (2)

1. PŘEDMĚT

   1. Způsob izolace hemoglobinu nebo produktu jeho rozkladu z fekálií za účelem jeho popř. jejich následného stanovení, vyznačený tím, že se lidský hemoglobin izoluje ze vzorku imunologickou reakcí za použití protilátky specifické pro lidský hemoglobin, například ve formě G-imunoglobulinové frakce lidského krevního séra, a fixované na pevnou fázi, například na polystyren. do kyvety se přidá specifický substrát pro použitý enzym, což je v daném případě paranitrofenylfosfát. Po 30-minutové inkubaci při teplotě 37 °C, kdy proběhne enzymatická reakce, se přidá 200 μΐ 0,1 M roztoku NaOH, což se provede za účelem zastavení enzymatické reakce. Výsledek se vyhodnotí buď fotometricky, nebo vizuálně.

   Imunologická reakce může být provedena mnoha způsoby. Postup uvedený v předcházejícím příkladě je pouze jednou z mnoha použitelných enzymatických imunologických metod. Inkubační doby, objemy reakční směsi, značkovací enzymy a pevné fáze se mohou různě obměňovat. Absorbent soupravy pro fekatest může obsahovat specifickou protilátku pro lidský hemoglobin vázanou chemickou vazbou, přičemž se v tomto stádiu dosáhne specifického vázání antigenu, tedy lidského hemoglobinu nebo jeho rozkladových produktů.

   V takovém případě se absorbent použije jako pevná fáze. Po promytí se přidá enzymem značený konkurující antigen a po dalším promytí a inkubaci se přidá uvedený substrát a výsledek se vyhodnotí buď vizuálně, nebo pomocí denzitometru.

   vynalezu
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se hemoglobin nebo jeho rozkladové produkty přítomné ve vzorku fekálií absorbují před imunologickou reakcí v absorbentu, například ve filtračním papíru, ze kterého se potom eluují.