JPS58205854A - 潜血反応検査用の固定化抗体 - Google Patents
潜血反応検査用の固定化抗体Info
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- JPS58205854A JPS58205854A JP8852382A JP8852382A JPS58205854A JP S58205854 A JPS58205854 A JP S58205854A JP 8852382 A JP8852382 A JP 8852382A JP 8852382 A JP8852382 A JP 8852382A JP S58205854 A JPS58205854 A JP S58205854A
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- hemoglobins
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
- G01N33/721—Haemoglobin
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、人の糞、尿のような排泄物中の潜血を選択的
に検出し、さらに潜血中の変性度の異なるヒトヘモグロ
ビンを区別して検出することにより、消化管内の出血個
所の診断に役立つ潜血反応検査用の固定化抗体に関する
。
に検出し、さらに潜血中の変性度の異なるヒトヘモグロ
ビンを区別して検出することにより、消化管内の出血個
所の診断に役立つ潜血反応検査用の固定化抗体に関する
。
糞中の潜血は消化管（胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸
等）の潰瘍、癌腫等による出血と密接な関係があるので
、潜血反応検査はこれら疾病の有力な診断指針となる。
等）の潰瘍、癌腫等による出血と密接な関係があるので
、潜血反応検査はこれら疾病の有力な診断指針となる。
しかしながら、従来の検査法は糞等に含まれるヘム蛋白
を区別することなくヘマチンを分離し、そのペルオキシ
ダーゼ活性を測定することによって行われているが、次
のような欠点がある。即ち、糞中には出血に由来するヘ
ム蛋白と食物に由来するヘム蛋白が存在するが、この検
査法では両者の識別が不可能であシ、検査前には動物性
食品の摂取を禁じているものの、動物性食品中にもチト
クローム類を含むヘム蛋白が存在するため、その影響を
さけるためにペルオキシダーゼ活性の測定感度を下げて
行われているのが現状であ夛、仮に検査の結果陰性であ
っても信頼性にとほしい。また、潜血中の消化等によシ
変性したヘモグロビンを区別することなく測定している
ため、出血個所が胃なのか、腸なのか、肛門附近なのか
判断できない。そこで、出血に由来するヘム蛋白のみを
選択的に検査する方法及び消化管内の出血個所の診断に
も応用できる方法が強く望まれている。
を区別することなくヘマチンを分離し、そのペルオキシ
ダーゼ活性を測定することによって行われているが、次
のような欠点がある。即ち、糞中には出血に由来するヘ
ム蛋白と食物に由来するヘム蛋白が存在するが、この検
査法では両者の識別が不可能であシ、検査前には動物性
食品の摂取を禁じているものの、動物性食品中にもチト
クローム類を含むヘム蛋白が存在するため、その影響を
さけるためにペルオキシダーゼ活性の測定感度を下げて
行われているのが現状であ夛、仮に検査の結果陰性であ
っても信頼性にとほしい。また、潜血中の消化等によシ
変性したヘモグロビンを区別することなく測定している
ため、出血個所が胃なのか、腸なのか、肛門附近なのか
判断できない。そこで、出血に由来するヘム蛋白のみを
選択的に検査する方法及び消化管内の出血個所の診断に
も応用できる方法が強く望まれている。
本発明者は、出血に由来するヘム蛋白（ヘモグロビン）
は糞として排泄されるまでに出血個所によシ変性度を異
にし、例えば肛門近くの直腸での出血のヘモグロビン分
子の蛋白構造は糞中でもそれ程破壊されておらず、正常
ヘモグロビンに近い球状構造（α−へリツクス含量約７
０チ）であるが、胃又は十二指腸での出血のヘモグロビ
ン分子の蛋白構造はその高次構造が著しく破壊されて繊
維状構造（α−ヘリックス含量Ｏチ）に変化しているこ
とに着目し、かつこれら変性度の異なるヘモグロビンの
それぞれに対する特異抗体の抗原抗体反応を利用するこ
とによって、糞中の変性度の異なるヘモグロビンを区別
して、さらに食物由来のヘム蛋白による影響を排除して
排泄物中の潜血を検査することに成功した。
は糞として排泄されるまでに出血個所によシ変性度を異
にし、例えば肛門近くの直腸での出血のヘモグロビン分
子の蛋白構造は糞中でもそれ程破壊されておらず、正常
ヘモグロビンに近い球状構造（α−へリツクス含量約７
０チ）であるが、胃又は十二指腸での出血のヘモグロビ
ン分子の蛋白構造はその高次構造が著しく破壊されて繊
維状構造（α−ヘリックス含量Ｏチ）に変化しているこ
とに着目し、かつこれら変性度の異なるヘモグロビンの
それぞれに対する特異抗体の抗原抗体反応を利用するこ
とによって、糞中の変性度の異なるヘモグロビンを区別
して、さらに食物由来のヘム蛋白による影響を排除して
排泄物中の潜血を検査することに成功した。
本発明は、上記の知見に基づき表された排泄物中の潜血
反応の検査に用いるための、変性度の異なるヒトヘモグ
ロビンのそれぞれに対する特異抗体を固定化した固定化
抗体である。
反応の検査に用いるための、変性度の異なるヒトヘモグ
ロビンのそれぞれに対する特異抗体を固定化した固定化
抗体である。
未変性ヒトヘモグロビン（ｎＨｂ ）は例えば次のよう
にして製造される。４４クエン酸ナトリウムＷ 電ｏ容
を含む人採血液を３０００ｒｐｍＸＳ分遠心し、その沈
澱の血球分画を生理食塩水て洗浄後、約１０倍容の水を
加えて溶血する。これを１０００１００００ｒｐ分遠心
してその上澄を（！：）、未変性ヒトヘモグロビンを得
る。その濃度は４１４ｎｍでの吸収を測定することによ
シわかる。
にして製造される。４４クエン酸ナトリウムＷ 電ｏ容
を含む人採血液を３０００ｒｐｍＸＳ分遠心し、その沈
澱の血球分画を生理食塩水て洗浄後、約１０倍容の水を
加えて溶血する。これを１０００１００００ｒｐ分遠心
してその上澄を（！：）、未変性ヒトヘモグロビンを得
る。その濃度は４１４ｎｍでの吸収を測定することによ
シわかる。
変性ヒトヘモグロビンは例えば次のようにして製造され
る。カルがキシペプチダーゼＢｉ性ヒトヘモグロビン（
ｃｐＨｂ ）は、０．２Ｍ炭酸水素ナトリウムｇ１．５
７＋Ｉｌ中に２０■の未変性ヒトヘモグロビンを含む液
と０．１Ｍ食塩水０．５＋ａ／中に豚の膵臓から得たカ
ルがキシペプチダーゼＢ１５０μ淘を含む液とを混合し
、３７℃で２時間保温して変性後、凍結乾燥して得る。
る。カルがキシペプチダーゼＢｉ性ヒトヘモグロビン（
ｃｐＨｂ ）は、０．２Ｍ炭酸水素ナトリウムｇ１．５
７＋Ｉｌ中に２０■の未変性ヒトヘモグロビンを含む液
と０．１Ｍ食塩水０．５＋ａ／中に豚の膵臓から得たカ
ルがキシペプチダーゼＢ１５０μ淘を含む液とを混合し
、３７℃で２時間保温して変性後、凍結乾燥して得る。
また、アルカリ変性ヒトヘモグロビン（ａｄＨｂ ）は
、水ｌｄ中に未変性ヒトヘモグロビン３０■を含む液を
３Ｎ水酸化ナトリウム液で−１３とし、３７℃で２時間
保温変性後、ＰＢＳ （ＩＪン酸緩衝液の生理食塩）液
９１を加えて−を７，５にもどして得る。
、水ｌｄ中に未変性ヒトヘモグロビン３０■を含む液を
３Ｎ水酸化ナトリウム液で−１３とし、３７℃で２時間
保温変性後、ＰＢＳ （ＩＪン酸緩衝液の生理食塩）液
９１を加えて−を７，５にもどして得る。
また、酸変性ヒトヘモグロビン（ａＨｂ） ｈ 、水１
ｍｌに未変性ヒトへモグｐビン３０■を含む液を３Ｎ塩
酸液でｐＨ１とし、３７℃で２時間保温変性後、ＰＢＳ
液９ｄを加えて−を６．０にもどして得る。
ｍｌに未変性ヒトへモグｐビン３０■を含む液を３Ｎ塩
酸液でｐＨ１とし、３７℃で２時間保温変性後、ＰＢＳ
液９ｄを加えて−を６．０にもどして得る。
本発明において、変性度の異彦るヒトヘモグロビンには
未変性及び上記の変性ヒトヘモグロビンの外、種々の変
性条件（例えばトリノシン、キモトリノシによる消化等
）により製造されたものを包含し、これら変性ヒトヘモ
グロビンと出血個所により異なる検体中の変性ヒトヘモ
グロビンとの相関は適宜実験によシ求められる。
未変性及び上記の変性ヒトヘモグロビンの外、種々の変
性条件（例えばトリノシン、キモトリノシによる消化等
）により製造されたものを包含し、これら変性ヒトヘモ
グロビンと出血個所により異なる検体中の変性ヒトヘモ
グロビンとの相関は適宜実験によシ求められる。
上記未変性又は変性ヒトヘモグロビンに対する特異抗体
は例えば次のようにして製造される。
は例えば次のようにして製造される。
上記の方法により得た未変性又は変性ヒトヘモグロビン
２■を含むＩＩＩｔ′＃Ｌと完全７０インド・アジュバ
ント１１′ｔ−含む液を、日本白色家兎（２，５〜３．
０ｋｌ？）の背中の皮内約１０ケ所及び後足の筋肉約１
０ケ所に分けて注射する。１週間間隔で同薬量をさらに
３目注射し、最終注射２週間後に耳の静脈より採血する
。採血液から血清を分離し、この血清を３３価飽和硫安
で塩析し、２時間室温に静置してＩｇＧ分画を沈澱とし
て採取する。この沈澱を３０００ｒｐｍＸＢ分遠心後、
生理食塩水に溶解し、０．１Ｍ硼酸緩衝液（ｐＨ７，８
）で透析し、精製抗体を得る。抗体の精製には硫安分画
を繰シ返すか又はＤＥＡＥ−セファデックスに通すこと
によシ、さらに交叉性の向上及び高力価のものが得られ
る。得られた抗体はラフタロニーテスト又は免疫電気泳
動によりそれぞれのヒトヘモグロビンに対する特異性を
確認することができる。
２■を含むＩＩＩｔ′＃Ｌと完全７０インド・アジュバ
ント１１′ｔ−含む液を、日本白色家兎（２，５〜３．
０ｋｌ？）の背中の皮内約１０ケ所及び後足の筋肉約１
０ケ所に分けて注射する。１週間間隔で同薬量をさらに
３目注射し、最終注射２週間後に耳の静脈より採血する
。採血液から血清を分離し、この血清を３３価飽和硫安
で塩析し、２時間室温に静置してＩｇＧ分画を沈澱とし
て採取する。この沈澱を３０００ｒｐｍＸＢ分遠心後、
生理食塩水に溶解し、０．１Ｍ硼酸緩衝液（ｐＨ７，８
）で透析し、精製抗体を得る。抗体の精製には硫安分画
を繰シ返すか又はＤＥＡＥ−セファデックスに通すこと
によシ、さらに交叉性の向上及び高力価のものが得られ
る。得られた抗体はラフタロニーテスト又は免疫電気泳
動によりそれぞれのヒトヘモグロビンに対する特異性を
確認することができる。
上記のようにして得られた特異抗体を常法により固定化
する。例えば、ポリビニルアルコール（１）のような支
持体を臭化シアンで処理し活性化ポリビニルアルコール
（ＩＱを得、これに上記抗体（至）を加えて抗体分子中
のアｔノ基と結合させ固定化抗体帖を調製する。
する。例えば、ポリビニルアルコール（１）のような支
持体を臭化シアンで処理し活性化ポリビニルアルコール
（ＩＱを得、これに上記抗体（至）を加えて抗体分子中
のアｔノ基と結合させ固定化抗体帖を調製する。
支持体としては、ポリビニルアルコール（例えこの変性
度の異なるヒトヘモグロビンのそれ知の方法で潜血反応
検査に用いられる。検査に際しては、少量の糞を水に懸
濁させ、この検体液中に前記変性度の異なるヒトヘモグ
ロビンのそれぞれに対する特異抗体を固定化した１組の
固定化抗体を浸漬し、３７℃でゆるやかに振とうして一
定時間保った後、取り出し生理食塩水で洗浄して試料を
得る。それぞれの固定化抗体は検体中の対応する未変性
又は変性ヒトヘモグロビンのみと抗原抗体反応によって
複合物を形成しておシ、他のヘム蛋白は結合しない。こ
のようにして検体中から分離し固定化抗体に結合した未
費性又Ｆｉ変性ヒトヘモグロビンのそれぞれはペルオキ
シダーゼ法又は放射免疫測定法によシ測定することによ
り、各種変性ヒトヘモグロビンを区別して定量すること
ができ、それによル消化管中出血個所を推測することが
できる。
度の異なるヒトヘモグロビンのそれ知の方法で潜血反応
検査に用いられる。検査に際しては、少量の糞を水に懸
濁させ、この検体液中に前記変性度の異なるヒトヘモグ
ロビンのそれぞれに対する特異抗体を固定化した１組の
固定化抗体を浸漬し、３７℃でゆるやかに振とうして一
定時間保った後、取り出し生理食塩水で洗浄して試料を
得る。それぞれの固定化抗体は検体中の対応する未変性
又は変性ヒトヘモグロビンのみと抗原抗体反応によって
複合物を形成しておシ、他のヘム蛋白は結合しない。こ
のようにして検体中から分離し固定化抗体に結合した未
費性又Ｆｉ変性ヒトヘモグロビンのそれぞれはペルオキ
シダーゼ法又は放射免疫測定法によシ測定することによ
り、各種変性ヒトヘモグロビンを区別して定量すること
ができ、それによル消化管中出血個所を推測することが
できる。
ペルオキシダーゼ法は、０．５ｍＭオルトトリジ＋１／
ン、１０ Ｍ 惑抄アミド及び８０ ｍＭ過酸化水素を
含む３Ｔｎｌの発色溶液中に、固定化抗体に検体中の変
性ヒトヘモグロビンを結合させた前記試料を入れ２〜４
分攪拌し、発色が安定した後、溶液の６２０ ｎｍの吸
光度を測定する。あるいはまた、前記試料を上記の発色
試薬をしみ込ませた試験紙上に置き、試験紙の発色を肉
眼的に又は測光的に測定する。測定結果は標準曲線又は
標準着色光からそれぞれの未変性又は変性ヒトヘモグロ
ビン量を求めることができる。
含む３Ｔｎｌの発色溶液中に、固定化抗体に検体中の変
性ヒトヘモグロビンを結合させた前記試料を入れ２〜４
分攪拌し、発色が安定した後、溶液の６２０ ｎｍの吸
光度を測定する。あるいはまた、前記試料を上記の発色
試薬をしみ込ませた試験紙上に置き、試験紙の発色を肉
眼的に又は測光的に測定する。測定結果は標準曲線又は
標準着色光からそれぞれの未変性又は変性ヒトヘモグロ
ビン量を求めることができる。
また、放射免疫測定法は、糞１？の懸濁液にあらかじめ
１２５■で標識した対応する未変性又は変性ヒトヘモグ
ロビン（ヘモグロビン１０μｍを１ｍＣ１で標識）１μ
？を加え、この懸濁液に本発明の１組の固定化抗体を浸
漬し、前述したと同様に処理して固定化抗体に検体中の
未変性又は変性ヒトヘモグロビン及び標識した未変性又
は変性ヒトヘモグロビンを競争的に結合させ試料を得る
。この糞から分離した未変性又は変性ヒトヘモグロビン
の Ｉの放射能をγ−カウンターで測定し、標準曲線か
らそれぞれの未変性又７− は変性ヒトヘモグルビ装置を求めることができる。
１２５■で標識した対応する未変性又は変性ヒトヘモグ
ロビン（ヘモグロビン１０μｍを１ｍＣ１で標識）１μ
？を加え、この懸濁液に本発明の１組の固定化抗体を浸
漬し、前述したと同様に処理して固定化抗体に検体中の
未変性又は変性ヒトヘモグロビン及び標識した未変性又
は変性ヒトヘモグロビンを競争的に結合させ試料を得る
。この糞から分離した未変性又は変性ヒトヘモグロビン
の Ｉの放射能をγ−カウンターで測定し、標準曲線か
らそれぞれの未変性又７− は変性ヒトヘモグルビ装置を求めることができる。
を含む水溶液８０１１中に浸し、激しく振とうしなから
３Ｎ水酸化ナトリウム液を滴下し−を１１に調節後、ポ
ＩＪ Ｖニルアルコールを取出し、冷水１！で遊離臭化
シアンを洗い流して活性ポリビニ／ｌ／ ７ ／Ｉ／
：ｙ−ルヲ得た。この活性ポリビニルアルコールを未変
性又は変性ヒトヘモグロビンに対する特異抗体１２０Ｗ
＃／を０．ＩＭホウ酸緩衝液（ｐ）１７．８）に溶解し
た液に浸漬し、室温で１２時間反応させて抗体を固定化
した。固定化抗体を取出し、上記緩衝液で洗浄し、未反
応の活性基を安定化させるために１Ｍエタノールアミン
５０ｄ中で室温で１２時時間上うした。得られた固定化
抗体はＰＨ３液で洗浄し、４℃で保存する。
３Ｎ水酸化ナトリウム液を滴下し−を１１に調節後、ポ
ＩＪ Ｖニルアルコールを取出し、冷水１！で遊離臭化
シアンを洗い流して活性ポリビニ／ｌ／ ７ ／Ｉ／
：ｙ−ルヲ得た。この活性ポリビニルアルコールを未変
性又は変性ヒトヘモグロビンに対する特異抗体１２０Ｗ
＃／を０．ＩＭホウ酸緩衝液（ｐ）１７．８）に溶解し
た液に浸漬し、室温で１２時間反応させて抗体を固定化
した。固定化抗体を取出し、上記緩衝液で洗浄し、未反
応の活性基を安定化させるために１Ｍエタノールアミン
５０ｄ中で室温で１２時時間上うした。得られた固定化
抗体はＰＨ３液で洗浄し、４℃で保存する。
特許出願人 美 浜 久 春
’ −−２９１−
８−
Claims (1)
- 変性度の異なるヒトヘモグロビンのそれぞれに対する特
異抗体を固定化した潜血反応検査用の固定化抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8852382A JPS58205854A (ja) | 1982-05-25 | 1982-05-25 | 潜血反応検査用の固定化抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8852382A JPS58205854A (ja) | 1982-05-25 | 1982-05-25 | 潜血反応検査用の固定化抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58205854A true JPS58205854A (ja) | 1983-11-30 |
| JPH0315701B2 JPH0315701B2 (ja) | 1991-03-01 |
Family
ID=13945189
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8852382A Granted JPS58205854A (ja) | 1982-05-25 | 1982-05-25 | 潜血反応検査用の固定化抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58205854A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60173471A (ja) * | 1984-02-20 | 1985-09-06 | Konishiroku Photo Ind Co Ltd | 抗原の検出方法 |
| JPS61172064A (ja) * | 1984-10-29 | 1986-08-02 | モレキユラー・ダイアグノステイツクス・インコーポレーテツド | 変性されたタンパク質分析物、とくにＨｂ Ａ↓１ｃの免疫アツセイ、およびそれに対する抗体 |
| JPS63501172A (ja) * | 1985-08-21 | 1988-04-28 | ベーリンガー マンヘイム コーポレイション | 特異的結合アッセイにおける成分の分離，混合および検出のための方法および装置 |
| JPH0240558A (ja) * | 1988-07-29 | 1990-02-09 | Kyoto Ikagaku Kenkyusho:Kk | 糞便中の潜血検出方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54145210A (en) * | 1978-05-01 | 1979-11-13 | Univ Rockefeller | Hemogulobin aic radioimmunoassay |
| JPS56106154A (en) * | 1980-01-17 | 1981-08-24 | Suovaniemi Finnpipette | Detection method of hemoglobin in night soil |
-
1982
- 1982-05-25 JP JP8852382A patent/JPS58205854A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54145210A (en) * | 1978-05-01 | 1979-11-13 | Univ Rockefeller | Hemogulobin aic radioimmunoassay |
| JPS56106154A (en) * | 1980-01-17 | 1981-08-24 | Suovaniemi Finnpipette | Detection method of hemoglobin in night soil |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60173471A (ja) * | 1984-02-20 | 1985-09-06 | Konishiroku Photo Ind Co Ltd | 抗原の検出方法 |
| JPS61172064A (ja) * | 1984-10-29 | 1986-08-02 | モレキユラー・ダイアグノステイツクス・インコーポレーテツド | 変性されたタンパク質分析物、とくにＨｂ Ａ↓１ｃの免疫アツセイ、およびそれに対する抗体 |
| JPH0751087A (ja) * | 1984-10-29 | 1995-02-28 | Molecular Diagnostics Inc | 変性タンパク質に対するモノクローナル抗体 |
| JPS63501172A (ja) * | 1985-08-21 | 1988-04-28 | ベーリンガー マンヘイム コーポレイション | 特異的結合アッセイにおける成分の分離，混合および検出のための方法および装置 |
| JPH0240558A (ja) * | 1988-07-29 | 1990-02-09 | Kyoto Ikagaku Kenkyusho:Kk | 糞便中の潜血検出方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0315701B2 (ja) | 1991-03-01 |
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