SU1411672A1 - Способ определени антител к миокарду - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к медицине , касаетс  диагностики аутоиммунного поражени  миокарда. Цель изобретени  - упрощение способа. Дл  этого из сердечной ткани эмбриона человека готов т- гомогенат, который фрик- ционируют методом дифференциального центрифугировани  при 45000- 50000 об/мин. После обессоливани  су- пернатанта провод т гель-фильтрацию на колонке сефадекса С-75 дл  выделени  высокоочищенной белковой фракции миокарда, которую помещают в пробир ,ки и инкубируют 1,5 ч, затем п тикратно отмывают фосфатным буфером ;(рН 7,2) и 0,05%-ным р-ром Твин-20. В пробирки после отмывки добавл ют 1%-ный р-р бычьего сывороточного альбумина (БСА). Контрольную группу проI бирок заполн ют только р-ром БСА. Затем вновь провод т инкубацию и отмывку в аналогичных услови х. Последующую инкубацию провод т с сыворотками больного при трех разведени х сыворотки - 1:10,1:100, 1 :1000. В отмытые пробирки опыта и контрол  добавл ют сыворотку крови кролика с антителами к иммуноглобулинам человека в разведении 1:1000. Вновь провод т инкубацию и отмывку и внос т сыворотку свиньи с антителами к иммуноглобулинам кролика , меченную пероксидазой в разведении 1:1000. После инкубации и отмывки в пробирки внос т субстратную систему ABTS и HgOj,, вновь инкубируют 25 мин, добавл ют р-р азида натри  дл  блокировани  цветной реакции, оценивают степень окраски спектрофотометричес- ки при / 650 нм. По интенсивности развивающейс  цветной реакции твердофазным иммунньш методом определ ют противокардиальные антитела. (Л о ч ю

Description

Изобретение относитс  к медицине, а именно к диагностике аутоиЯмунно- |го поражени  миокарда, : Целью изобретени   вл етс  упроще- |ние способа.

i Способ осуществл ют следующим образом .

I Из сердец 25 эмбрионов человека ;j возрасте 20-24 недедь готов т гомо- , который фракционируют методом дифференциального центрифугировани  1ри 45000-50000 об/мин. Необходима  5елкова  фракци  при данной частоте :вращени  остаетс  в супернатанте, а 1ри большей осаждаетс  на дне пробирки вместе с другими белковыми фракци ми . После обессоливани  суперна- ганта провод т гель-фильтрацию на колонке сефадекса G-75 дл  выделени  шсокоочищенной белковой фракции миокарда с молекул рной массой 25000- J5000, что соответствует массе клеточных мембран кардиомиоцитов Полу- 1енный антиген миокарда (белок мемб- ан кардиомиоцитов) имеет морфологическую (в том числе и антигенную) структуру, идентичную миокарду взрослого человека. Плод считаетс  жизне- :пособным в возрасте свьше 28 недель , а к 20 неделе развити  уже пол- ;иостью формируютс  элементы сердечнососудистой системы. Использование : мбрионального антигенного материала 11иокарда  вл етс  наиболее благопри- тным, так как миокард эмбриона, :Ьз тый сразу после его гибели, не Подвергалс  воздействию вредных аген- jroB, способных вли ть на антигенную Структуру кардиомиоцитов. Полученный тиген миокарда не содержал миогло- бин (мол,масса J7600), что было под- |гверждено при радиоиммунологическом $1сследоваш1И с набором антител к Циоглобулину Atomique Nucleare, Дл  в зь1вани  антигена миокарда с твердой фазой (внутренней поверхностью юлистироловой пробирки) в полисти- |роловые пробирки помещали раствор антигена миокарда в концентрации 25 мкг/мл, Данна  концентраци  антигена  вл етс  наиболее оптимальной, Так как использование концентраций антигена 12,5 мкг/мл и меньше существенно снижает чувствительность спосо Ба, тогда как при применении концент рацк  антигена миокарда 50 мкг/мл и больше заметно не повышает чувстви- ельность способа, а расход ценного

,

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

реактива - антигена миокарда - значительно увеличиваетс . Пробирки инкубируют в течение 1,5 ч при во влажной среде, содержащей 5% СО. При инкубации более 2 ч чувствительность способа повышаетс  незначительно , а при инкубации менее 1 ч отмечено значительное снижение чувствительности метода. Температурный режим и уровень концентрации СО соот-/ ветствуют внутренней среде живого организма и наилучшим образом вли ют на кислотно-щелочное равновесие используемых растворов.

После инкубации провод т п тикрат ную отмывку фосфатным буфером (рН 7,2) и 0,05%-ным раствором Твин-20 дл  уменьшени  неспецифического св - зывйни  белков. П ть последователь- ных отмывок достаточно дл  полного удалени  из пробирок реактивов, участвовавших в предыдущем этапе исследовани . После этого в пробирки добавл ют 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина, обеспечивающего полное закрытие оставшейс  свободной поверхности полистирола, способного участвовать в неспецифической сорбции белков. Использование альбумиеа в концентрации меньше 1% не обеспечивает полного закрыти  полистироловой поверхности, что в значительной мере снижает специфичность способа, а при применении концентрации альбумина , . больше 1,3% существенно не вли ет на специфичность способа и приводит к большему расходу реактива (альбумина ) . Эти данные получили при использовании альбумина в интервалах кон- це нтрации от 0,05 до 2%. Параллельно формируют контрольную группу пробирок , численно равную опытной, которые заполн ют только указанньм раствором альбумина. Все пробирки инкубируют и отмывают в указаньых услови х. Последующую инкубацию провод т с сыворотками больного, формиру  три разведени  сыворотки 1:10, 1:100 и 1:1000, которые внос т в три пробирки из контрольной и три пробирки из опытной rpyni:, создава  серию из шести пробирок , соответствующую каждому больному . Указанные пробирки инкубируют и отмывают в указанных услови х.В отмытые пробирки добавл ли сьшоротку крови кролика, содержащую антитела к иммуноглобулинам человека, в разведении 1:1000, Данное разведение сыво3lAl

ротки  вл етс  наиболее оптимальдым дл  увеличени  чувствительности и специфичности способа Инкубацию и отмывку провод т в указанных услови х,После этого в пробирки внос т сыворотку свиньи, содержащую антитела к иммуноглобулинам кролика, меченую пероксидазой, в разведении 1:1000. Данное разведение сыворотки обеспечивает избыточное содержание антител, меченных пероксидазой, что необходимо дл  следующего этапа способа.

После инкубации и отмывки в указанных услови х в пробирки внос т субстратную систему, состо щую из ABTS и НаОе (ABTS - 2,2-азидоди-З этилбентиазолинсульфоновой кислоты) , Провод т инкубацию при комиатной температуре в течение 25-20 мин, В течение этого времени цветна  реакци  достигает достаточной дл  измерени  интенсивности. После этого в пробирки добавл ют раствор азида натри  дл  блокировани  цветной реакции,Степень окраски оценивали при спектрофо- тометрии при длине волны 650 нм, i.;; Волновые параметры подобраны дл  использовани  этой ферментной системы. Степень окраски в каждой пробирке из опытной серии и соответствующей пробирке из контрольной серии характеризовали индексом абсорбции, который вычисл ли по формуле

01П

ИА

где ИА - индекс абсорбции;

ОПр показатель оптической плотности в опытной серии пробирок ;

ОП..- показатель оптической плотности к контрольной серии пробирок.

Обследовали J08 доноров. Антитела к миокарду диагностируют при значени х индекса абсорбции больше 0,75, Антитела к миокарду не вы вл ют при значени х индекса абсорбции меньше 0,37, Результаты считали недостоверными , если индекс абсорбции находилс  в интервале 0,37-0,75,

Пример 1, Кролика иммунизируют очищенным антигеном миокарда, выделенным в указанных услови х, после чего у него забирают сыворотку крови. Полученную от кролика сыворотку исследовали при помощи иммунофер672

ментного способа на наличие антител к миокарду, В качестве контрол  использовали сыворотку, полученную из крови здорового человека, В резуль- тате проведенного исследовани  получили следую1дие данные: индекс абсорбции в опыте составил 0,99, в контроле - 0,44, Данные позвол ют гово..

рить о наличии антител к миокарду в

сьшоротке крови иммунизированного . кролика, тогда как в сьшоротке контрольного животного антител к миокарду не вы вили,

5 Пример 2, Исследовали сыворотку больного через 20 дней после операции на сердце (крмиссуротомии) по поводу порока сердца (митрального стеноза). В пост операционном периоде

0 У больного развилс  постперикардио- томический синдром, в патогенезе которого антитела к миокарду играют .ведущую роль, В результате-исследовани  при помощи иммуноферментного спо5 соба получены данные: индекс абсоррг- ции в опыте (сыворотка-больного) 0,89, а в контроле - 0,54. Результаты исследовани  указывают на наличие антител к миокарду в сыворотке бола-.

0 ного. На основании клинических симптомов заболевани , а также данных, полученных при помощи иммунофермент - ного способа, больному был поставлен Диагноз постперикардиотомического

5 синдрома аутоиммунной природы и проведен курс иммуностатнческой тера- ,пии с положительным клиникр-лаборат торным эффектом, Эффективность предлагаемого спосо0 ба определени  антител к миокарду в сьшоротке крови больных состоит в том, что он обладает специ(|«чностью, дл  исследовани  достаточно наличи  сыворотки больного, что исключает 45 проведение биопсии миокарда и упрощает метод.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   gQ Способ определени  антител к миокарду , включающий выделение карди апьного антигена и добавление его к исследуемой сыворотке с последук цим определением антител в иммунологичес еких реакци х, отличающий- с   тем, что, с целью упрощени  способа , кардиальный антиген выдел ют из эмбриональной сердечной ткани человека с помощью гель-хроматографии,

   514116726

   а определение противокардиальных ан- муноферментным методом по.интенсивнос- гител осуществл ют твердофазным им-ти развивающейс  цветной реакции.