CN108490181A - 一种基于量子点标记的塑化剂快检试纸条及其制备方法 - Google Patents

一种基于量子点标记的塑化剂快检试纸条及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于量子点标记的塑化剂快检试纸条，包括PVC背衬、样品垫、结合垫、检测线、质控线、反应垫和吸收垫，检测线和质控线依次设置于反应垫上，检测线包被有塑化剂人工抗原，质控线包被有羊抗鼠抗体，结合垫被量子点标记的塑化剂单克隆抗体包被，本发明还提供了一种基于量子点标记的塑化剂快检试纸条的制备方法。本发明提供的快检试纸，样品垫部分盖住结合垫的设计，延长了检测结果的观察时间，同时样品垫可以将检测液体充分吸收，与抗体完全接触充分反应、减少误差，本发明的提供的试纸价格低，操作简单，无需专业人员即可操作，检测不受场地限制，同时检测时间短，当场就能快速得到检测结果，适用于大批样品的检测。

Description

一种基于量子点标记的塑化剂快检试纸条及其制备方法
技术领域
本发明属于食品检测领域，具体涉及一种基于量子点标记的塑化剂快检试纸条及其制备方法。
背景技术
塑化剂(DBP)，是一类环境雌激素，是常用增塑剂之一，被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品(如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液)等数百种产品中。最常见的塑化剂品种是邻苯二甲酸酯类化合物，邻苯二甲酸酯类化合物可干扰内分泌，使男性精子数量减少、运动能力低下、形态异常，严重的还会导致死精症和睾丸癌，是造成男性生殖问题的“罪魁祸首”，甚至影响胚胎发育，表现出殖发育毒性。由于塑化剂对环境及人类健康的危害，WHO1995年就已经公布，邻苯二甲酸酯类化合物是必须控制的一类扰乱内分泌的化学物质。基于PAEs在环境中的富集作用对人类健康造成的严重危害，EPA(美国国家环保局)将6种PAEs列为优先控制污染物：即邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DOP)和邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)，8种PAEs被列入WWF(世界野生动物保护基金会)的环境激素名单中。在我国，DMP、DBP和DOP被列入《中国环境优先污染物黑名单》。
世界各国对塑化剂类产品均加强了监控与检测。目前，塑化剂的检测方法有分光光度法、薄层色谱法、气相色谱法(GC)、气相色谱/质谱法(GC-MS)和高效液相色谱法(HPLC)。美国环境保护局的标准方法是GC-ECD-MS法，我国拟发布的标准方法是正相高效液相色谱法(NP-HPLC)。CN103076445A提供了一种利用线虫幼虫检测塑化剂的方法，解决了常规的塑化剂检测方法中操作复杂、仪器依赖度大、成本高的技术问题，该发明提供的方法包括以下步骤：配制胆固醇乙醇溶液，配制磷酸盐缓冲液，制备线虫培养基，向线虫培养基中均匀涂入大肠杆菌OP50菌液并培养，观测L2期线虫死亡率，线虫幼虫死亡率>10％，则表明待检测白酒含有塑化剂。该检测方法对实验条件要求低，不需要特殊的高精分析仪器和检测设备，实验操作方便，成本低廉，易于掌握，然而该方法前期准备工作需要时间较长，并且需要专业人员在实验室才能完成。CN105588940A公开了一种检测塑化剂的时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒，该检测试剂盒是由多孔包被板、缓冲液、塑化剂标准品、塑化剂的抗体冻干品、铕标记的羊抗鼠抗体、洗涤液和增强液所组成，检测方法包括下列步骤：制备免疫原，制备包被原，制备单克隆抗体，样品的前处理及检测，本发明检测时间短、平均回收率高、样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，检测成本低，同时具有检测特异性强，批内和批间差异小、灵敏度高和操作简单快速，适合大批量样品的检测，然而该法需要专业人员进行操作。CN103913525A公开了一种高效液相色谱-串联质谱法检测白酒中17种塑化剂的方法，该法将高效液相色谱质谱联用，可以将白酒样品直接进样实现定性检测，同时该发明专利还公开了HPLC-MS/MS的定量检测方法，该方法无需对白酒进行提取或净化处理，直接进样检测即可快速得到结果，节省了样品前处理的时间，避免了样品在前处理过程中塑化剂的引入，为白酒中塑化剂检测标准的制定提供了技术支持，该检测方法灵敏度高，结果可靠，然而所需的设备价格昂贵。
上述方法大都需要复杂的前处理，仪器设备昂贵，检测费时费力，一次检测样品量少，检测时间长，不适合现场快速检测，仅可作为少数实验室的确证方法，满足不了环境和农产品对塑化剂检测的快速简便的需求。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的之一是提供一种基于量子点标记的塑化剂快检试纸条。
本发明的目的之二是提供上述塑化剂快检试纸条的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于量子点标记的塑化剂快检试纸条，包括PVC背衬、样品垫、结合垫、检测线、质控线、反应垫和吸收垫，所述的样品垫、结合垫、反应垫和吸收垫依次排布在所述的PVC背衬上，所述的检测线和质控线依次设置于所述的反应垫上，其中检测线靠近结合垫端，质控线靠近吸收垫端，所述的检测线与质控线之间的距离为5～8mm，所述的结合垫为涂覆有量子点标记的塑化剂单克隆抗体的玻璃纤维膜，所述的检测线包被有塑化剂人工抗原，所述的质控线包被有羊抗鼠抗体。
优选地，所述的塑化剂人工抗原为塑化剂半抗原和载体蛋白的偶联物。
进一步优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、卵清蛋白、铁蛋白和多聚赖氨酸中的一种。
优选地，所述的量子点为水溶性量子点，所述水溶性量子点的的发射波长为450nm～650nm，半峰宽为20～40nm。
一种基于量子点标记的塑化剂快检试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)将塑化剂经过硝化与还原反应后，得到塑化剂半抗原，再与载体蛋白偶联，制备得到塑化剂人工抗原；
(2)用量子点标记塑化剂单克隆抗体，得到量子点标记的塑化剂单克隆抗体；
(3)用步骤(2)制备得到的量子点标记的塑化剂单克隆抗体包被玻璃纤维膜，得到结合垫；
(4)在硝酸纤维素膜上设置一条检测线和一条质控线，用步骤(1)制备得到的人工抗原包被检测线，用羊抗鼠抗体包被质控线，制备得到反应垫；
(5)将玻璃纤维纸用处理液浸泡后干燥，得到样品垫；
(6)在PVC背衬上按顺序依次粘附反应垫、吸收垫、结合垫和样品垫，相邻垫之间互相部分重叠，即得塑化剂快检试纸，将所述的试纸切割成试纸条。
优选地，步骤(1)所述的塑化剂人工抗原的具体制备方法为，取碳化二亚胺用磷酸缓冲盐溶液充分溶解得到A液，取塑化剂用二甲基甲酰胺溶解得到B液，取载体蛋白用用磷酸盐缓冲溶液溶解得到C液，将B液与C液混合，搅拌下逐渐加入A液，透析后即得塑化剂人工抗原。
优选地，步骤(2)中所述的量子点的浓度为1～2μg/ml。
优选地，步骤(4)所述的人工抗原包被检测线的包被浓度为0.5～1μg/cm2，羊抗鼠抗体包被质控线的包被浓度为0.5～1μg/cm2。
优选地，步骤(5)中所述处理液的成分包括Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl、牛血清白蛋白、蔗糖、叠氮钠、兔血清和去离子水。
进一步优选地，每升样品垫处理液的制备方法为：向去离子水中依次加入3gNa2HPO4·12H2O、0.3g NaH2PO4·2H2O、8.0gNaCl、10g牛血清白蛋白、20g蔗糖、1g叠氮钠和10ml兔血清，充分溶解后，再用浓度为1M的NAOH或者HCL调节pH值至8.0，最后用去离子水定容至1L。
优选地，步骤(6)中所述的试纸条的宽度为2.5～3.5mm。
优选地，还可以通过外加塑料盒的方式，将试纸条制作成试纸卡，所述的外加塑料盒包括卡盖和与所述卡盖彼此连接的底座，所述的卡盖设置有加样孔和观察孔，其中所述加样孔开口于所述样品垫的上侧，以暴露出样品垫的部分区域，所述观察孔开口于所述反应垫底上侧，以暴露出所述检测线和所述质控线的全部区域。
检测时，样品滴入试剂卡孔内，当塑化剂在样品中浓度低时，量子点抗体在层析过程中会被固定在反应垫上的塑化剂人工抗原结合，检测线和质控线会变为红色，呈阴性；如果塑化剂在样品中浓度高时，因为竞争反应，量子点抗体与塑化剂全部结合，检测线上缺乏量子点抗体与人工抗原结合，因此检测线不会变为红色，仅质控线变为红色，呈阳性。需要注意到是，当质控线没有变为红色时，无论检测线是否变为红色，该次检测应判为无效。
本发明的有益效果
1、本发明提供的检测试纸，样品垫部分盖住结合垫的设计，延长了检测结果的观察时间，同时样品垫可以将检测液体充分吸收，与抗体完全接触充分反应、减少误差；
2、本发明的提供的试纸价格低，操作简单，无需专业人员即可操作，检测不受场地限制，同时检测时间短，当场就能快速得到检测结果，适用于大批样品的检测；
3、本发明提供的试纸敏感度高，其中针对邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的检测限可以达到0.1ppm，邻苯二甲酸二异丁脂(DIBP)的检测限可以达到0.25ppm，邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)的检测限可以达到0.5ppm。
附图说明
图1为本发明快检试纸条的组装示意图；
图2为快检试纸卡的示意图；
图3为塑化剂快检试纸卡的检测结果分析示意图。
具体实施方式
实施例1
一种基于量子点标记的塑化剂快检试纸条，如图1所示，包括PVC背衬1、样品垫2、结合垫3、检测线4、质控线5、反应垫6和吸收垫7，样品垫2、结合垫3、反应垫6和吸收垫7依次排布在PVC背衬1上，检测线4和质控线5依次设置于反应垫6上，其中检测线4靠近结合垫3端，质控线5靠近吸收垫7端，检测线4与质控线5之间的距离为5～8mm，结合垫3为涂覆有量子点标记的抗塑化剂特异性抗体的玻璃纤维膜，检测线4包被有塑化剂人工抗原，质控线5包被有羊抗鼠抗体。
实施例2
一种基于量子点标记的塑化剂快检试纸卡，如图2所示，卡盖8设置有加样孔9和观察孔10，加样孔9开口于样品垫的上侧，以暴露出样品垫的部分区域，观察孔10开口于反应垫6上侧，以暴露出检测线4和所述质控线5的全部区域。
图3为塑化剂快检试纸卡的检测结果分析示意图。检测时，样品滴入试剂卡孔内，当塑化剂在样品中浓度低时，量子点抗体在层析过程中会被固定在反应垫上的人工抗原结合，检测线和质控线会变为红色，呈阴性；如果塑化剂在样品中浓度高时，因为竞争反应，量子点抗体与塑化剂全部结合，检测线上缺乏量子点抗体与人工抗原结合，因此检测线不会变为红色，仅质控线变为红色，呈阳性。需要注意到是，当质控线没有变为红色时，无论检测线是否变为红色，该次检测应判为无效。
实施例3
制备了一种基于量子点标记的塑化剂快检试纸条，具体步骤如下：
(1)将塑化剂经过硝化与还原反应后，得到塑化剂半抗原，与载体蛋白偶联，制备得到塑化剂人工抗原，具体为：取碳化二亚胺100mg，用pH为8.0的10mol/L的PBS溶液3.0ml充分溶解得到A液，取塑化剂10mg溶于1ml二甲基甲酰胺得到B液，取牛血清白蛋白20mg溶于1ml pH为8.0的10mol/L的PBS得到C液，将B液与C液混合，在磁力搅拌下逐渐加入A液，4℃搅拌12h后，用蒸馏水使充分透析4～6天，得到塑化剂人工抗原；
(2)用量子点标记塑化剂单克隆抗体，得到量子点标记的塑化剂特异性抗体，具体为：在磁力搅拌下，用0.1M碳酸钾将量子点的pH值调至8.2，按1～2μg/ml的比例将量子点标记物加入塑化剂单克隆抗体中，继续搅拌30min，加入10％的BSA至终浓度为1％，静置30min，12000rpm、4℃下离心30min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，复溶缓冲液具体为：将2.8g Na2HPO4·12H2O、0.2g NaH2PO4·2H2O、8.0g NaCl、10g牛血清白蛋白、5g蔗糖和1g叠氮钠溶于800ml去离子水中，再调节pH值至7.4，最后用去离子水定容至1L，用初始量子点标记物体积1/20的复溶缓冲液将沉淀重悬，在4℃下贮存备用，保存期限为60天；
(3)将玻璃纤维膜浸泡于含有0.1～1.5％的卵清蛋白的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制的缓冲液中浸湿30s，37℃烘2h,用点膜仪将步骤(2)制备好的塑化剂特异性抗体均匀包被在玻璃纤维膜上，真空干燥，真空封装，置4℃备用；
(4)在硝酸纤维素膜上设置一条检测线和一条质控线，用步骤(1)制备得到的塑化剂人工抗原包被检测线，用羊抗鼠抗体包被质控线，制备得到反应垫，具体方法为：将硝酸纤维素膜用含3％甲醇的磷酸缓冲液将人工抗原稀释到10mg/mL，用点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜作为检测线，包被量为0.8μg/cm2，检测线靠近结合垫端，距结合垫端约8mm，用pH为7.4浓度为0.01M的PBS缓冲液(含3％的甲醇)将羊抗鼠IgG抗体稀释到150μg/ml，用点膜仪将其包被于纤维素膜作为质控线，包被量为0.8μg/cm2，再用含0.1％牛血清的封闭液进行封闭，质控线靠近吸收垫，距吸收垫约8mm，检测线和质控线距离为5～8mm，包被后于37℃烘干并封装；
(5)将玻璃纤维纸用处理液浸泡后干燥，得到样品垫，具体为：先将玻璃纤维纸裁切成1.5cm×30cm大小，将裁切好的玻璃纤维纸，全部浸泡入样品垫处理液中，每100条垫子加2000ml样品垫处理液，室温浸泡16小时，浸泡完后，拿出沥干水分，置于37度鼓风干燥箱中干燥2h即可，其中样品垫处理液的制备方法为：分别称取3gNa2HPO4·12H2O、0.3gNaH2PO4·2H2O、8.0gNaCl、10g牛血清白蛋白、20g蔗糖、1g叠氮钠、10ml兔血清，先用800ml去离子水充分溶解，再用1M NAOH或者HCL调节pH值至8.0，最后用去离子水定容至1L；
(6)在PVC背衬上按顺序依次粘附反应垫、吸收垫、结合垫和样品垫，相邻垫之间互相部分重叠，即得塑化剂快检试纸，将所述的试纸进行切割成2～3mm宽的试纸条，外加塑料盒真空包装即得成品，原包装应在18～25℃的环境中储存，有效期一年。
上述方法制备得到的试纸条，针对邻苯二甲酸二丁酯(DBP)灵敏度可达0.1ppm，邻苯二甲酸二异丁脂(DIBP)检出限可达0.25ppm，邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)灵敏度可达0.5ppm。
实施例4
本实施例用试纸卡和HPLC法检测了样本中残留的塑化剂，试纸卡的检测过程包括以下步骤：
(1)样本前处理：称取白酒、剪碎的聚苯乙烯塑料瓶、白醋、方便面和酱油样本各50g，匀浆，放入具塞三角瓶中，加入100ml正己烷提取60分钟，然后5000rpm，室温离心10分钟，取5mL上清，置于50℃下氮气吹干，用0.5ml PBS复溶；
(2)用试纸卡检测：将步骤(1)处理后的样品用滴管滴入试剂卡孔内，滴加3滴，加后计时，5-8min内于紫外灯下观察结果，超过10min的样品检测判读无效；
(3)检测结果分析，如图3所示：
阳性：当质控线5显红色，而检测线4不显色，判为阳性；
阴性：当质控线5显示出红色，检测线4同时也显示出红色，且检测线颜色接近或浅于质控线5时，判为阴性；
无效：当质控线5不显示红色，则无论检测线4显示出红色与否，该次检测结果判为无效。
试纸卡与HPLC法的部分样品检测结果如表1所示。
表1量子点检测卡与HPLC检测实际样本检测情况
按照本实施步骤(1)的样本前处理方法，本实施例还通过向检测结果为阴性的白酒和聚苯乙烯塑料瓶样品中分别添加不同浓度的DBP、DIBP和BBP的标准品来制备样品，并对每个样品使用8个检测卡进行平行测试，确定了使用本发明提供的试纸检测塑化剂时，邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二异丁脂(DIBP)和邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)的检测限。结果如表2～4所示。
表2量子点检测卡DBP灵敏度检测情况
表3量子点检测卡DIBP灵敏度检测情况
表4量子点检测卡BBP灵敏度检测情况
从表2～4可知，使用本发明提供的试纸检测塑化剂时，邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的检测限可以达到0.1ppm，邻苯二甲酸二异丁脂(DIBP)检测限可以达到0.25ppm，邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)检测限可以达到0.5ppm。

Claims (10)

1.一种基于量子点标记的塑化剂快检试纸条，包括PVC背衬、样品垫、结合垫、检测线、质控线、反应垫和吸收垫，其特征在于，所述的样品垫、结合垫、反应垫和吸收垫依次排布在所述的PVC背衬上，所述的检测线和质控线依次设置于所述的反应垫上，其中检测线靠近结合垫端，质控线靠近吸收垫端，所述的检测线与质控线之间的距离为5～8mm，所述的结合垫为涂覆有量子点标记的塑化剂单克隆抗体的玻璃纤维膜，所述的检测线包被有塑化剂人工抗原，所述的质控线包被有羊抗鼠抗体。
2.根据权利要求1所述的基于量子点标记的塑化剂快检试纸条，其特征在于，所述的塑化剂人工抗原为塑化剂半抗原和载体蛋白的偶联物。
3.根据权利要求2所述的基于量子点标记的塑化剂快检试纸条，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、卵清蛋白、铁蛋白和多聚赖氨酸中的一种。
4.根据权利要求1所述的基于量子点标记的塑化剂快检试纸条，其特征在于，所述的量子点为水溶性量子点，所述水溶性量子点的的发射波长为450～650nm，半峰宽为20～40nm。
5.一种如权利要求1～4任一项所述塑化剂快检试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将塑化剂经过硝化与还原反应后，与载体蛋白偶联，制备得到塑化剂人工抗原；
(2)用量子点标记塑化剂单克隆抗体，得到量子点标记的塑化剂单克隆抗体；
(3)用步骤(2)制备得到的量子点标记的塑化剂单克隆抗体包被玻璃纤维膜，得到结合垫；
(4)在硝酸纤维素膜上设置一条检测线和一条质控线，用步骤(1)制备得到的人工抗原包被检测线，用羊抗鼠抗体包被质控线，制备得到反应垫；
(5)将玻璃纤维纸用处理液浸泡后干燥，得到样品垫；
(6)在PVC背衬上按顺序依次粘附反应垫、吸收垫、结合垫和样品垫，相邻垫之间互相部分重叠，即得塑化剂快检试纸，将所述的试纸切割成试纸条。
6.根据权利要求5所述塑化剂快检试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的塑化剂人工抗原的具体制备方法为，取碳化二亚胺用磷酸缓冲盐溶液充分溶解得到A液，取塑化剂用二甲基甲酰胺溶解得到B液，取载体蛋白用磷酸缓冲盐溶液溶解得到C液，将B液与C液混合，搅拌下逐渐加入A液，透析后即得塑化剂人工抗原。
7.根据权利要求5所述塑化剂快检试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的量子点的浓度为1～2μg/ml。
8.根据权利要求5所述塑化剂快检试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述的人工抗原包被检测线的包被浓度为0.5～1μg/cm2，羊抗鼠抗体包被质控线的包被浓度为0.5～1μg/cm2。
9.根据权利要求5所述塑化剂快检试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述处理液的成分包括Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl、牛血清白蛋白、蔗糖、叠氮钠、兔血清和去离子水。
10.根据权利要求5所述塑化剂快检试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述的试纸条的宽度为2.5～3.5mm。
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