CN108802358A - 一种时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条及制备方法 - Google Patents

一种时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条及制备方法，属于材料检测技术领域，包括PVC背衬、样品垫、结合垫、检测线、质控线、反应垫和吸收垫，检测线和质控线依次设置于反应垫上，检测线包被有二苯甲酮类化合物人工抗原，质控线包被有羊抗兔抗体，结合垫被时间分辨荧光微球标记的抗二苯甲酮类化合物特异性抗体包被。本发明提供的快检试纸，样本垫部分盖住结合垫的设计，延长了检测结果的观察时间，同时样本垫可以将检测液体充分吸收，与抗体完全接触充分反应、减少误差，本发明的提供的试纸价格低，操作简单，无需专业人员即可操作，检测不受场地限制，同时检测时间短，当场就能快速得到检测结果，适用于大批样品的检测。

Description

一种时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条 及制备方法
技术领域
本发明属于材料检测技术领域，具体涉及一种时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条及制备方法。
背景技术
二苯甲酮类光引发剂是自由基(II)光引发剂，主要用于自由基紫外光固化清漆体系，如UV木器漆、UV纸张上光油、UV涂料、UV油墨、UV粘合剂等，同时也是有机颜料、医药、香料、杀虫剂的中间体，广泛用于医药工业、香水和皂用香精中。由于二苯甲酮类化合物不采取功能性阻止的情况下可以迁移到接触的物质中，目前常用的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气质联用法(GC-MS)和液质联用法(LC-MS)等，上述方法大都需要复杂的前处理，仪器设备昂贵，检测费时费力，一次检测样品量少，检测时间长，不适合现场快速检测，仅可作为少数实验室的确证方法，满足不了原材料中检测快速简便的需要。因此如何克服现有技术的不足是目前材料检测技术领域亟需解决的问题。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的之一是提供一种基于时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条。
本发明的目的之二是提供上述二苯甲酮类化合物快检试纸条的制备方法。采用本发明快检试纸条检测时间短、平均回收率高、样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，检测成本低，同时具有检测特异性强，批内和批间差异小、灵敏度高和操作简单快速，适合大批量样品的检测，且不需要专业人员进行操作，易于推广应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条，包括PVC背衬、样品垫、结合垫、检测线、质控线、反应垫和吸收垫；
所述的样品垫、结合垫、反应垫和吸收垫依次排布在所述的PVC背衬上，所述的检测线和质控线依次设置于所述的反应垫上，其中检测线靠近结合垫端，质控线靠近吸收垫端，所述的检测线与质控线之间的距离为5～8mm；
所述的结合垫为涂覆有时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物特异性抗体的玻璃纤维膜；
所述的检测线包被有二苯甲酮类化合物人工抗原，所述的质控线包被有羊抗兔抗体。
进一步，优选的是，所述的二苯甲酮类化合物人工抗原为二苯甲酮类化合物-载体蛋白偶联物。
进一步，优选的是，所述的二苯甲酮类化合物-载体蛋白偶联物中的载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、卵清蛋白、铁蛋白或多聚赖氨酸。
进一步，优选的是，所述羊抗兔抗体为能捕获时间分辨荧光微球标记的抗二苯甲酮类化合物特异性抗体的羊抗兔IgG。
进一步，优选的是，所述的时间分辨荧光微球为内含镧系元素的水溶性荧光微球，可以为聚苯乙烯微球，但不限于此；所述水溶性荧光微球的发射波长为450nm～650nm，粒径为100～300nm。优选发射波长为550nm或者620nm，优选粒径为200或者300nm。镧系元素优选为铕或铽。
进一步，优选的是，吸收垫为吸水纸。
进一步，优选的是，样本处理垫材质为玻璃纤维纸。
本发明同时提供一种时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)，将二苯甲酮类化合物经过肟化与还原反应后，与载体蛋白偶联，制备得到二苯甲酮类化合物人工抗原；
步骤(2)，用时间分辨荧光微球标记二苯甲酮类化合物抗体，得到时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物特异性抗体；
步骤(3)，用步骤(2)制备得到的时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物特异性抗体涂覆玻璃纤维膜，得到结合垫；
步骤(4)，在硝酸纤维素膜上设置一条检测线和一条质控线，用步骤(1)制备得到的二苯甲酮类化合物人工抗原包被检测线，用羊抗兔抗体包被质控线，制备得到反应垫；
步骤(5)，将吸水纸裁切，即得吸收垫；
步骤(6)，将玻璃纤维纸在样本垫处理液中浸泡4～16小时，浸泡完后取出干燥，后裁切，即得样本垫；
步骤(7)，在PVC背衬上按顺序依次粘附吸收垫、反应垫、结合垫和样本垫，相邻垫之间互相部分重叠，即得一种时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条。
进一步，优选的是，步骤(1)所述的二苯甲酮类化合物人工抗原的具体制备方法为：
取羧甲基羟胺半盐酸盐用二甲基甲酰胺溶解得到A液；
取二苯甲酮类化合物用二甲基甲酰胺溶解得到B液；
将A液和B液按照摩尔浓度比为1～10:1的比例进行混合，并置于70℃水浴中反应5～10小时；
将反应后的液体用氮气吹干后，用去离子水溶解并调节pH值到3.0以下，得到肟化物溶液；之后用是肟化物溶液体积3～10倍的乙酸乙酯对肟化物溶液进行提取，将得到的提取液在氮气下吹干后用二甲基甲酰胺溶解得到C液；
将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)用磷酸盐缓冲溶液溶解得到D液；
将N-羟基琥珀酰亚胺用磷酸盐缓冲溶液溶解得E液；
将C液、D液和E液按照摩尔浓度比为1:(20～50):(40～100)的比例进行混合得F液，室温或者在2～8℃的低温条件下，反应2～16小时，得到第一反应液；
将载体蛋白用磷酸盐缓冲溶液溶解得到G液，搅拌条件下逐渐加入第一反应液进行偶联，偶联后透析，即得二苯甲酮类化合物人工抗原；其中，制备第一反应液所采用的C液与G液的摩尔浓度比为5～50:1。
其中，调节pH采用盐酸。
进一步，优选的是，步骤(2)中，用1～2μg/ml的时间分辨荧光微球标记二苯甲酮类化合物抗体；步骤(4)所述的人工抗原包被检测线的包被浓度为0.5～1μg/cm2，羊抗兔抗体包被质控线的包被浓度为0.5～1μg/cm2。
进一步，优选的是，步骤(6)中，样本垫处理液包括：0.25％吐温-20，0.1％PVP40，0.1M pH7.4磷酸盐缓冲溶液，1％牛血清血白蛋白；0.05％Procl in 300；所述的干燥为晾干或者风干。
进一步，优选的是，步骤(7)中所述的试纸条宽度为2.5～3.5mm；相邻垫之间互相部分重叠部分的长度为0.5～2mm。
在制备过程中，将吸水纸裁切成长为25～30cm，宽1.0～2.0cm纸条，即得吸收垫；将浸泡并干燥处理完玻璃纤维纸切成为25～30cm，宽0.5～2.0cm，即得样本垫。
检测时，样品滴在样品垫上，当二苯甲酮类化合物在样品中浓度低时，荧光微球抗体在层析过程中会被固定在反应垫上的人工抗原结合，检测线和质控线会变为蓝色或红色，呈阴性；如果二苯甲酮类化合物在样品中浓度高时，因为竞争反应，荧光微球抗体与二苯甲酮类化合物全部结合，检测线上缺乏荧光微球抗体与人工抗原结合，因此检测线不会变为红色，仅质控线变为蓝色或者红色，呈阳性。需要注意到是，当质控线没有变为蓝色或者红色时，无论检测线是否变为蓝色或者红色，该次检测应判为无效。
本发明所述的二苯甲酮类化合物可以为二苯甲酮、2-甲基二苯甲酮、1-羟基环己基苯基甲酮、3-甲基二苯甲酮、4-甲基二苯甲酮、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、联苯基苯甲酮、4,4-双(二甲基氨基)二苯酮、4,4-双(二乙基氨基)二苯酮，但不限于此。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
1、本发明提供的检测试纸，样本垫部分盖住结合垫的设计，延长了检测结果的观察时间，同时样本垫可以将检测液体充分吸收，与抗体完全接触充分反应、减少误差；
2、本发明的提供的试纸价格低，操作简单，无需专业人员即可操作，检测不受场地限制，同时检测时间短，当场就能快速得到检测结果，适用于大批样品的检测；
3、本发明提供的试纸敏感度高，针对二苯甲酮类化合物比例按照二苯甲酮：2-甲基二苯甲酮：1-羟基环己基苯基甲酮：3-甲基二苯甲酮：4-甲基二苯甲酮：2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮：联苯基苯甲酮：4,4-双(二甲基氨基)二苯酮为1：1：1：1：1：1：1：1：1时，最低检出总量限为0.1mg/m2。
附图说明
图1为本发明检测试纸的组装示意图；
其中，1、PVC背衬；2、样品垫；3、结合垫；4、检测线；5、质控线；6、反应垫；7、吸收垫。
图2为本发明的检测结果分析示意图。
当检测有效时，质控线(C线)会变为蓝色或红色，然而检测线(T线)会随着二苯甲酮类化合物在样品中浓度发现变化时变化，T线显色的强弱就体现了样本中二苯甲酮类化合物的浓度水平；如图2中A和B显示的情况。
当质控线(C线)没有变为蓝色或者红色时，无论检测线(T线)是否变为蓝色或者红色，该次检测应判为无效。如图2中C和D显示的情况。
图3为本发明采用干式荧光分析仪器检测检测线(T线)和控制线(C线)的荧光强度值，按照T/C的比值与各标准品浓度绘制的拟合曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明除非另有说明，否则百分号代表质量百分数。
本发明图2为本发明快检试纸条按照常规方法装配成试纸卡的外观图，本领域技术人员应当知晓，这并不作为本发明产品的使用情况的限制。
实施例1
本实施例为一种基于时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条，如图1所示，包括PVC背衬1、样品垫2、结合垫3、检测线4、质控线5、反应垫6和吸收垫7，样品垫2、结合垫3、反应垫6和吸收垫7依次排布在PVC背衬1上，检测线4和质控线5依次设置于反应垫上，其中检测线4靠近结合垫3端，质控线5靠近吸收垫7端，检测线4与质控线5之间的距离为5～8mm，结合垫3为涂覆有时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物特异性抗体的玻璃纤维膜，检测线4包被有二苯甲酮类化合物人工抗原，质控线5包被有羊抗兔抗体。
实施例2
本实施例为一种二苯甲酮类化合物人工抗原的制备方法，包括以下步骤：
将二苯甲酮经过肟化与还原反应后，与载体蛋白偶联，制备得到二苯甲酮类化合物人工抗原，具体为：称取羧甲基羟胺半盐酸盐12.7mg用1mL二甲基甲酰胺溶解充分溶解得到A液；
在称取二苯甲酮1.82mg用1mL二甲基甲酰胺溶解得到B液，将A液和B液混合，并置于70℃水浴中反应7小时；
将反应后的液体用50℃氮气吹干，再用1mL去离子水溶解调节pH值到3.0，再用1.5mL的乙酸乙酯提取反应后的肟化物，吸取上层液体装入另一个10mL离心管中，重复该步骤3次；再将提取好的肟化物溶液在氮气下吹干用1mL二甲基甲酰胺溶解得到C液；
称取134.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)用pH 6.00.02M磷酸盐缓冲溶液溶解得到D液；
称取40.3mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，用pH 6.0 0.02M磷酸盐缓冲溶液溶解得到E；
将C液、D液和E液按照摩尔浓度比为1:35:70的比例进行混合得F液，室温下反应16小时，得到第一反应液；
称取32mg牛血清白蛋白(BSA)用pH 8.0 0.02M磷酸盐缓冲溶液溶解得到G液，搅拌下逐渐加入第一反应液，室温下反应4个小时，偶联完成后用pH 7.0 0.02M磷酸盐缓冲溶液透析4，期间换液4～5次，透析后即得二苯甲酮类化合物人工抗原。
实施例3
本实施例为二苯甲酮类多克隆抗血清的制备方法，包括以下步骤：
(1)挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只(约2Kg)，使其适应新的生活环境，至少稳定一周；
(2)将制备得到二苯甲酮类化合物人工抗原，用pH为7.0的0.01mol/L PBS调整浓度为1mg/mL；取0.5mg浓度调整后的人工抗原，与等体积的弗氏完全佐剂进行混匀，乳化成油包水状态，采取颈背部皮下多点和腿部肌肉注射免疫新西兰大白兔；
(3)上述免疫完成后3～4周，再取0.2mg步骤(2)中调整浓度后的二苯甲酮类化合物人工抗原，与等体积的弗氏不完全佐剂进行混匀，乳化成油包水状态，采取颈背部皮下多点和腿部肌肉注射免疫新西兰大白兔；
(4)按照上述(3)的过程加强免疫3次，加强免疫间隔时间为3周，免疫完成后心脏采血进行纯化及鉴定。
实施例4
本实施例为二苯甲酮类化合物人工抗原免疫亲和柱的制备方法，包括以下步骤：
1.按照下述方法配制溶液：
1.1碳酸氢钠溶液pH＝8.3，0.1M
秤取42.005gNaHCO3，加入超纯水大约5000mL，用HCl调节pH＝8.3后定容至5000mL。
1.2盐酸溶液1mM
将83.33μL浓盐酸小心滴入超纯水中，最终定容至1000mL。
1.3 Tris-HCl缓冲液pH＝8.0，0.1M
秤取12.114g Tris，加入超纯水大约900mL，用浓HCl调节pH＝8.0后定容至1000mL。
1.4 NaCl pH＝4.0 0.2M+醋酸缓冲液0.1M
秤取冰醋酸5.095g，醋酸钠2.062g，5.844gNaCl最后用超纯水定容至1000mL。
1.5 pH＝7.4 0.02M PBS+防腐剂
秤取NaCl 4g；KCl 0.1g；Na2HPO4 0.72g；KH2PO4 0.12g加H2O至500ml调节PH至7.4，再加入0.25ml Proclin300搅拌混匀。
2琼脂糖凝胶偶联二苯甲酮类化合物人工抗原：
2.1秤取1g琼脂糖凝胶，将之悬浮于1mM HCl中使之溶胀，一般1g可以溶胀成3.5mL，时间：20-30min，溶胀后用200mL 1mM HCl溶液洗涤(15min内)，避免柱料干燥；
2.2洗涤完成后用NaHCO3溶液洗涤平衡缓冲体系，洗涤体积5个柱体积以上；
2.3平衡完柱料后吸取1mL柱料与5mg二苯甲酮类化合物人工抗原，4℃过夜振荡，得到偶联好的柱料；
2.4次日将偶联好的柱料装柱，用5倍柱体积NaHCO3溶液缓冲洗涤；
2.5封闭多余活化位点，用Tris-HCl洗涤柱料，洗涤体积大于5个柱体积，然后在室温放置2h或4℃过夜；
2.6封闭后用pH＝4.0 0.2M NaCl+0.1M醋酸缓冲液与0.1M pH＝8.0Tris-HCl缓冲液更换洗涤3次，洗涤体积约为5个柱体积，洗涤后用pH＝7.4 0.02MPBS+防腐剂洗涤5倍柱体积，置4℃保存。
实施例5
本实施例为二苯甲酮类化合物多克隆抗体(二苯甲酮类化合物抗体)的亲和纯化的方法，包括以下步骤：
1.按照下述方法配制溶液：
1.1磷酸盐缓冲液pH＝7.4，50mM
称取0.99g磷酸二氢钠，5.16g磷酸氢二钠，氯化钠8.0g，最后加入超纯水至1000mL。
1.2 Tris-HCl缓冲液pH＝9.0
称取Tris 6.057g加入超纯水大约900mL，用浓HCl调节pH＝9.0后定容至1000mL。
1.3 pH＝3.0Gly-HCl NaCl缓冲液，
准确秤取Gly3.7535g，并加入4.095gNaCl，再加入超纯水大约900mL，用浓HCl调节pH＝3.0后定容至1000mL。
1.4尿素溶液8M
秤取240.24g尿素，加入超纯水定容至500mL。
1.5 pH＝7.4 0.02M PBS+防腐剂
秤取NaCl 4g；KCl 0.1g；Na2HPO4 0.72g；KH2PO4 0.12g加H2O至500ml调节PH至7.4，再加入0.25ml Proclin300搅拌混匀。
2抗人工抗原兔子免疫血清亲和纯化：
2.1将制备好的二苯甲酮类化合物人工抗原免疫亲和柱柱料，装填入免疫层析柱管中，用去离子水压实；
2.2用8M尿素冲洗(3倍柱料体积，清洗1次)；
2.3冲洗完后用10倍柱料体积的去离子水冲洗，完成后用3倍柱料体积的pH＝7.4的50mM磷酸盐缓冲液平衡填料；
2.4将实施例3制备的二苯甲酮类多克隆抗血清用5倍体积的pH＝7.4的50mM磷酸盐缓冲液稀释，再用0.45μM的滤膜过滤，过滤完后的液体加入已经处理好的二苯甲酮类化合物人工抗原免疫亲和柱中上样，上样速度为2s/1滴；
2.5上样完成后用10倍柱料体积的pH＝7.4的50mM磷酸盐缓冲液平衡填料；
2.6平衡完成后，用5倍柱料体积pH＝3.0的Gly-HCl洗液洗脱，再用pH＝9.0Tris-HCl缓冲液调节pH到7.0，用紫外可见分光光度计测定OD280值，计算抗体浓度；
2.7将收集的抗体用pH＝7.4 0.02M PBS+防腐剂透析3～5天，透析完成后-20℃保存。
实施例6
本实施例为一种基于时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1.按照下述方法配制溶液：
1.1磷酸盐缓冲液pH＝7.4，50mM
称取0.99g磷酸二氢钠，5.16g磷酸氢二钠，氯化钠8.0g，最后加入超纯水至1000mL。
(1)将二苯甲酮类化合物经过经过肟化与还原反应后，与载体蛋白偶联，制备得到二苯甲酮类化合物人工抗原；
(2)用时间分辨荧光微球标记二苯甲酮类化合物抗体，得到时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物特异性抗体，方法为：在磁力搅拌下，用0.1M碳酸钾将荧光微球的pH值调至8.2，按1～2μg/ml的比例将未标记的时间分辨荧光微球加入二苯甲酮类化合物多克隆抗体中，继续搅拌30min，加入10％的BSA至终浓度为1％，静置30min，12000rpm、4℃下离心30min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次(注：复溶缓冲液具体为2.8g Na2HPO4·12H2O；0.2gNaH2PO4·2H2O；8.0gNaCl；10g牛血清白蛋白；5g蔗糖；1g叠氮钠，先用800mL去离子水充分溶解，再调节pH值至7.4，最后用去离子水定容至1L。)，用初始时间分辨荧光微球标记物体积1/20的复溶缓冲液将沉淀重悬，得到时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物特异性抗体；在4℃下贮存备用，保存期限为60天；所述的时间分辨荧光微球为：物料名称为荧光微球PS-COOH；规格为300nm Europium Chelate(365,610)；产家为Bangs；目录号为FCEU003。
(3)用点膜仪将步骤(2)制备好的时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物特异性抗体，按照3ul/cm(单位表示为：ul表示时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物特异性抗体的体积；cm表示玻璃纤维膜的长度)均匀包被在玻璃纤维膜上，真空干燥，真空封装，置4℃备用。
(4)在硝酸纤维素膜上设置一条检测线和一条质控线，用步骤(1)制备得到的人工抗原包被检测线，用羊抗兔抗体包被质控线，制备得到反应垫，具体方法为：用含3％甲醇的pH7.4 0.05M磷酸缓冲液将人工抗原稀释到1mg/mL，用点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜作为检测线，包被量为0.8μg/cm2，检测线靠近结合垫端，距结合垫端约8mm；用0.01M pH为7.4的PBS缓冲液(含3％的甲醇)将羊抗兔IgG抗体稀释到150μg/ml，用点膜仪将其包被于纤维素膜作为质控线，包被量为0.8μg/cm2，再用含0.1％牛血清的封闭液进行封闭，质控线靠近吸收垫，距吸收垫约8mm，检测线和质控线距离为5-8mm，包被后于37℃烘干并封装。
(5)在PVC背衬上按顺序依次粘附反应垫、吸收垫、结合垫和样本垫，相邻垫之间互相部分重叠(叠加部分长度均为1mm)，即得二苯甲酮类化合物快检试纸，将所述的试纸进行切割成3mm宽的试纸条，外加塑料盒真空包装即得成品，原包装应在18-25℃的环境中储存，有效期一年。
实施例7
本实施例检测了样本中残留的二苯甲酮类化合物，检测过程包括以下步骤：
(1)样本前处理：量取1平方分米的包装材料，剪碎，放入具塞三角瓶中，加入10ml正己烷超声提取10分钟，然后再加入10ml去离子水超声提取10分钟，然后5000rpm，室温离心5分钟，取0.5mL上清，置于10mL离心管中，加入4.5mL离子水稀释，混匀待检测；
(2)向经气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测二苯甲酮类化合物含量为未检出包装材料中添加二苯甲酮类化合物标准品溶液(二苯甲酮类化合物含量比例为，二苯甲酮：2-甲基二苯甲酮：1-羟基环己基苯基甲酮：3-甲基二苯甲酮：4-甲基二苯甲酮：2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮：联苯基苯甲酮：4,4-双(二甲基氨基)二苯酮：4,4-双(二乙基氨基)二苯酮的比值为1：1：1：1：1：1：1：1：1)，使其浓度分别达到0mg/m2、0.1mg/m2、0.3mg/m2、1mg/m2、3mg/m2、10mg/m2、30mg/m2，通过下面的检测方法进行检测；
备注：气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测二苯甲酮类化合物的标准方法为《YQT31-2013卷烟条与盒包装材料中光引发剂的测定》。
(3)用试纸条检测：将步骤(1)、(2)处理后的样品用滴管滴在样品垫上，滴加3滴，加后计时，8min后采用干式荧光分析仪器检测，超过15min的样品检测判读无效；
(4)采用干式荧光分析仪器检测检测线(T线)和控制线(C线)的荧光强度值，按照T/C的比值绘制相应标准曲线，如图3示，并计算待检测样本的检测结果：
无效：当质控线不显示红色，则无论检测线显示出红色与否，该次检测结果判为无效。
随机挑选16份样品，其中样本处理方式荧光微球检测卡按照实施例7中(1)进行；GC-MS样本处理方式按照《YQT31-2013卷烟条与盒包装材料中光引发剂的测定》进行。
本发明试剂条与GC-MS实际样本检测情况参见表1。
表1.本发明试剂条与GC-MS检测实际样本检测情况
随机挑选16份样品，荧光微球检测卡与GC-MS测定二苯甲酮类光引发剂物质总量结果偏差不超过15％，其中GC-MS检测结果未检出时，荧光微球检测卡结果同样显示低于检出限，说明这两者方法测定的结果基本一致。
实施例8
一种时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条，包括PVC背衬、样品垫、结合垫、检测线、质控线、反应垫和吸收垫；
所述的样品垫、结合垫、反应垫和吸收垫依次排布在所述的PVC背衬上，所述的检测线和质控线依次设置于所述的反应垫上，其中检测线靠近结合垫端，质控线靠近吸收垫端，所述的检测线与质控线之间的距离为5mm；
所述的结合垫为涂覆有时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物特异性抗体的玻璃纤维膜；
所述的检测线包被有二苯甲酮类化合物人工抗原，所述的质控线包被有羊抗兔抗体。
其中，所述的二苯甲酮类化合物人工抗原为二苯甲酮类化合物-载体蛋白偶联物。
所述的二苯甲酮类化合物-载体蛋白偶联物中的载体蛋白为人血清白蛋白。
所述羊抗兔抗体为能捕获时间分辨荧光微球标记的抗二苯甲酮类化合物特异性抗体的羊抗兔IgG。
所述的时间分辨荧光微球为内含镧系元素的水溶性荧光微球；所述水溶性荧光微球的发射波长为550nm，粒径为200nm。
本实施例时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)，将二苯甲酮类化合物经过肟化与还原反应后，与载体蛋白偶联，制备得到二苯甲酮类化合物人工抗原；
步骤(2)，用时间分辨荧光微球标记二苯甲酮类化合物抗体，得到时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物特异性抗体；
步骤(3)，用步骤(2)制备得到的时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物特异性抗体涂覆玻璃纤维膜，得到结合垫；
步骤(4)，在硝酸纤维素膜上设置一条检测线和一条质控线，用步骤(1)制备得到的二苯甲酮类化合物人工抗原包被检测线，用羊抗兔抗体包被质控线，制备得到反应垫；
步骤(5)，将吸水纸裁切，即得吸收垫；
步骤(6)，将玻璃纤维纸在样本垫处理液中浸泡4小时，浸泡完后取出干燥，后裁切，即得样本垫；
步骤(7)，在PVC背衬上按顺序依次粘附吸收垫、反应垫、结合垫和样本垫，相邻垫之间互相部分重叠，即得一种时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条。
其中，步骤(1)所述的二苯甲酮类化合物人工抗原的具体制备方法为：
取羧甲基羟胺半盐酸盐用二甲基甲酰胺溶解得到A液；
取二苯甲酮类化合物用二甲基甲酰胺溶解得到B液；
将A液和B液按照摩尔浓度比为1:1的比例进行混合，并置于70℃水浴中反应5小时；
将反应后的液体用氮气吹干后，用去离子水溶解并调节pH值到3.0以下，得到肟化物溶液；之后用是肟化物溶液体积3倍的乙酸乙酯对肟化物溶液进行提取，将得到的提取液在氮气下吹干后用二甲基甲酰胺溶解得到C液；
将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)用磷酸盐缓冲溶液溶解得到D液；
将N-羟基琥珀酰亚胺用磷酸盐缓冲溶液溶解得E液；
将C液、D液和E液按照摩尔浓度比为1:20:40的比例进行混合得F液，在2℃的低温条件下，反应2小时，得到第一反应液；
将载体蛋白用磷酸盐缓冲溶液溶解得到G液，搅拌条件下逐渐加入第一反应液进行偶联，偶联后透析，即得二苯甲酮类化合物人工抗原；其中，制备第一反应液所采用的C液与G液的摩尔浓度比为5:1。
其中，调节pH采用盐酸。
步骤(2)中，用1μg/ml的时间分辨荧光微球标记二苯甲酮类化合物抗体；步骤(4)所述的人工抗原包被检测线的包被浓度为0.5μg/cm2，羊抗兔抗体包被质控线的包被浓度为0.5μg/cm2。
步骤(6)中，样本垫处理液包括：0.25％吐温-20，0.1％PVP40，0.1M pH7.4磷酸盐缓冲溶液，1％牛血清血白蛋白；0.05％Proclin 300；所述的干燥为晾干。
步骤(7)中所述的试纸条宽度为2.5mm；相邻垫之间互相部分重叠部分的长度为0.5mm。
实施例9
一种时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条，包括PVC背衬、样品垫、结合垫、检测线、质控线、反应垫和吸收垫；
所述的样品垫、结合垫、反应垫和吸收垫依次排布在所述的PVC背衬上，所述的检测线和质控线依次设置于所述的反应垫上，其中检测线靠近结合垫端，质控线靠近吸收垫端，所述的检测线与质控线之间的距离为8mm；
所述的结合垫为涂覆有时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物特异性抗体的玻璃纤维膜；
所述的检测线包被有二苯甲酮类化合物人工抗原，所述的质控线包被有羊抗兔抗体。
其中，所述的二苯甲酮类化合物人工抗原为二苯甲酮类化合物-载体蛋白偶联物。
所述的二苯甲酮类化合物-载体蛋白偶联物中的载体蛋白为钥孔血蓝蛋白。
所述羊抗兔抗体为能捕获时间分辨荧光微球标记的抗二苯甲酮类化合物特异性抗体的羊抗兔IgG。
所述的时间分辨荧光微球为内含镧系元素的水溶性荧光微球；所述水溶性荧光微球的发射波长为520nm，粒径为300nm。
本实施例时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)，将二苯甲酮类化合物经过肟化与还原反应后，与载体蛋白偶联，制备得到二苯甲酮类化合物人工抗原；
步骤(2)，用时间分辨荧光微球标记二苯甲酮类化合物抗体，得到时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物特异性抗体；
步骤(3)，用步骤(2)制备得到的时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物特异性抗体涂覆玻璃纤维膜，得到结合垫；
步骤(4)，在硝酸纤维素膜上设置一条检测线和一条质控线，用步骤(1)制备得到的二苯甲酮类化合物人工抗原包被检测线，用羊抗兔抗体包被质控线，制备得到反应垫；
步骤(5)，将吸水纸裁切，即得吸收垫；
步骤(6)，将玻璃纤维纸在样本垫处理液中浸泡16小时，浸泡完后取出干燥，后裁切，即得样本垫；
步骤(7)，在PVC背衬上按顺序依次粘附吸收垫、反应垫、结合垫和样本垫，相邻垫之间互相部分重叠，即得一种时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条。
其中，步骤(1)所述的二苯甲酮类化合物人工抗原的具体制备方法为：
取羧甲基羟胺半盐酸盐用二甲基甲酰胺溶解得到A液；
取二苯甲酮类化合物用二甲基甲酰胺溶解得到B液；
将A液和B液按照摩尔浓度比为10:1的比例进行混合，并置于70℃水浴中反应10小时；
将反应后的液体用氮气吹干后，用去离子水溶解并调节pH值到3.0以下，得到肟化物溶液；之后用是肟化物溶液体积10倍的乙酸乙酯对肟化物溶液进行提取，将得到的提取液在氮气下吹干后用二甲基甲酰胺溶解得到C液；
将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)用磷酸盐缓冲溶液溶解得到D液；
将N-羟基琥珀酰亚胺用磷酸盐缓冲溶液溶解得E液；
将C液、D液和E液按照摩尔浓度比为1:50:100的比例进行混合得F液，在8℃的低温条件下，反应16小时，得到第一反应液；
将载体蛋白用磷酸盐缓冲溶液溶解得到G液，搅拌条件下逐渐加入第一反应液进行偶联，偶联后透析，即得二苯甲酮类化合物人工抗原；其中，制备第一反应液所采用的C液与G液的摩尔浓度比为50:1。
其中，调节pH采用盐酸。
步骤(2)中，用2μg/ml的时间分辨荧光微球标记二苯甲酮类化合物抗体；步骤(4)所述的人工抗原包被检测线的包被浓度为1μg/cm2，羊抗兔抗体包被质控线的包被浓度为1μg/cm2。
步骤(6)中，样本垫处理液包括：0.25％吐温-20，0.1％PVP40，0.1M pH7.4磷酸盐缓冲溶液，1％牛血清血白蛋白；0.05％Proclin 300；所述的干燥为风干。
步骤(7)中所述的试纸条宽度为3.5mm；相邻垫之间互相部分重叠部分的长度为2mm。
在制备过程中，将吸水纸裁切成长为25～30cm，宽1.0～2.0cm纸条，即得吸收垫；将浸泡并干燥处理完玻璃纤维纸切成为25～30cm，宽0.5～2.0cm，即得样本垫。
实施例10
一种时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条，包括PVC背衬、样品垫、结合垫、检测线、质控线、反应垫和吸收垫；
所述的样品垫、结合垫、反应垫和吸收垫依次排布在所述的PVC背衬上，所述的检测线和质控线依次设置于所述的反应垫上，其中检测线靠近结合垫端，质控线靠近吸收垫端，所述的检测线与质控线之间的距离为7mm；
所述的结合垫为涂覆有时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物特异性抗体的玻璃纤维膜；
所述的检测线包被有二苯甲酮类化合物人工抗原，所述的质控线包被有羊抗兔抗体。
其中，所述的二苯甲酮类化合物人工抗原为二苯甲酮类化合物-载体蛋白偶联物。
所述的二苯甲酮类化合物-载体蛋白偶联物中的载体蛋白为多聚赖氨酸。
所述羊抗兔抗体为能捕获时间分辨荧光微球标记的抗二苯甲酮类化合物特异性抗体的羊抗兔IgG。
所述的时间分辨荧光微球为内含镧系元素的水溶性荧光微球，为聚苯乙烯微球；所述水溶性荧光微球的发射波长为450nm，粒径为100nm。
本实施例时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)，将二苯甲酮类化合物经过肟化与还原反应后，与载体蛋白偶联，制备得到二苯甲酮类化合物人工抗原；
步骤(2)，用时间分辨荧光微球标记二苯甲酮类化合物抗体，得到时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物特异性抗体；
步骤(3)，用步骤(2)制备得到的时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物特异性抗体涂覆玻璃纤维膜，得到结合垫；
步骤(4)，在硝酸纤维素膜上设置一条检测线和一条质控线，用步骤(1)制备得到的二苯甲酮类化合物人工抗原包被检测线，用羊抗兔抗体包被质控线，制备得到反应垫；
步骤(5)，将吸水纸裁切，即得吸收垫；
步骤(6)，将玻璃纤维纸在样本垫处理液中浸泡10小时，浸泡完后取出干燥，后裁切，即得样本垫；
步骤(7)，在PVC背衬上按顺序依次粘附吸收垫、反应垫、结合垫和样本垫，相邻垫之间互相部分重叠，即得一种时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条。
其中，步骤(1)所述的二苯甲酮类化合物人工抗原的具体制备方法为：
取羧甲基羟胺半盐酸盐用二甲基甲酰胺溶解得到A液；
取二苯甲酮类化合物用二甲基甲酰胺溶解得到B液；
将A液和B液按照摩尔浓度比为6:1的比例进行混合，并置于70℃水浴中反应8小时；
将反应后的液体用氮气吹干后，用去离子水溶解并调节pH值到3.0以下，得到肟化物溶液；之后用是肟化物溶液体积4倍的乙酸乙酯对肟化物溶液进行提取，将得到的提取液在氮气下吹干后用二甲基甲酰胺溶解得到C液；
将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)用磷酸盐缓冲溶液溶解得到D液；
将N-羟基琥珀酰亚胺用磷酸盐缓冲溶液溶解得E液；
将C液、D液和E液按照摩尔浓度比为1:40:50的比例进行混合得F液，在6℃的低温条件下，反应10小时，得到第一反应液；
将载体蛋白用磷酸盐缓冲溶液溶解得到G液，搅拌条件下逐渐加入第一反应液进行偶联，偶联后透析，即得二苯甲酮类化合物人工抗原；其中，制备第一反应液所采用的C液与G液的摩尔浓度比为30:1。
其中，调节pH采用盐酸。
步骤(2)中，用1.3μg/ml的时间分辨荧光微球标记二苯甲酮类化合物抗体；步骤(4)所述的人工抗原包被检测线的包被浓度为0.7μg/cm2，羊抗兔抗体包被质控线的包被浓度为0.8μg/cm2。
步骤(6)中，样本垫处理液包括：0.25％吐温-20，0.1％PVP40，0.1M pH7.4磷酸盐缓冲溶液，1％牛血清血白蛋白；0.05％Proclin 300；所述的干燥为晾干。
步骤(7)中所述的试纸条宽度为3mm；相邻垫之间互相部分重叠部分的长度为1mm。
在制备过程中，将吸水纸裁切成长为25～30cm，宽1.0～2.0cm纸条，即得吸收垫；将浸泡并干燥处理完玻璃纤维纸切成为25～30cm，宽0.5～2.0cm，即得样本垫。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条，其特征在于，包括PVC背衬、样品垫、结合垫、检测线、质控线、反应垫和吸收垫；
所述的样品垫、结合垫、反应垫和吸收垫依次排布在所述的PVC背衬上，所述的检测线和质控线依次设置于所述的反应垫上，其中检测线靠近结合垫端，质控线靠近吸收垫端，所述的检测线与质控线之间的距离为5~8mm；
所述的结合垫为涂覆有时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物特异性抗体的玻璃纤维膜；
所述的检测线包被有二苯甲酮类化合物人工抗原，所述的质控线包被有羊抗兔抗体。
2.根据权利要求1所述的时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条，其特征在于，所述的二苯甲酮类化合物人工抗原为二苯甲酮类化合物-载体蛋白偶联物。
3.根据权利要求2所述的时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条，其特征在于，所述的二苯甲酮类化合物-载体蛋白偶联物中的载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、卵清蛋白、铁蛋白或多聚赖氨酸。
4.根据权利要求1所述的时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条，其特征在于，所述羊抗兔抗体为能捕获时间分辨荧光微球标记的抗二苯甲酮类化合物特异性抗体的羊抗兔IgG。
5.根据权利要求1所述的时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条，其特征在于，所述的时间分辨荧光微球为内含镧系元素的水溶性荧光微球；所述水溶性荧光微球的发射波长为450nm~650nm，粒径为100~300nm。
6.权利要求1-5任意一项所述的一种时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1），将二苯甲酮类化合物经过肟化与还原反应后，与载体蛋白偶联，制备得到二苯甲酮类化合物人工抗原；
步骤（2），用时间分辨荧光微球标记二苯甲酮类化合物抗体，得到时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物特异性抗体；
步骤（3），用步骤（2）制备得到的时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物特异性抗体涂覆玻璃纤维膜，得到结合垫；
步骤（4），在硝酸纤维素膜上设置一条检测线和一条质控线，用步骤（1）制备得到的二苯甲酮类化合物人工抗原包被检测线，用羊抗兔抗体包被质控线，制备得到反应垫；
步骤（5），将吸水纸裁切，即得吸收垫；
步骤（6），将玻璃纤维纸在样本垫处理液中浸泡4~16小时，浸泡完后取出干燥，后裁切，即得样本垫；
步骤（7），在PVC背衬上按顺序依次粘附吸收垫、反应垫、结合垫和样本垫，相邻垫之间互相部分重叠，即得一种时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条。
7.根据权利要求6所述的时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的二苯甲酮类化合物人工抗原的具体制备方法为：
取羧甲基羟胺半盐酸盐用二甲基甲酰胺溶解得到A液；
取二苯甲酮类化合物用二甲基甲酰胺溶解得到B液；
将A液和B液按照摩尔浓度比为1~10:1的比例进行混合，并置于70℃水浴中反应5～10小时；
将反应后的液体用氮气吹干后，用去离子水溶解并调节pH值到3.0以下，得到肟化物溶液；之后用是肟化物溶液体积3～10倍的乙酸乙酯对肟化物溶液进行提取，将得到的提取液在氮气下吹干后用二甲基甲酰胺溶解得到C液；
将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐用磷酸盐缓冲溶液溶解得到D液；
将N-羟基琥珀酰亚胺用磷酸盐缓冲溶液溶解得E液；
将C液、D液和E液按照摩尔浓度比为1:（20~50）:（40~100）的比例进行混合得F液，室温或者在2~8℃的低温条件下，反应2~16小时，得到第一反应液；
将载体蛋白用磷酸盐缓冲溶液溶解得到G液，搅拌条件下逐渐加入第一反应液进行偶联，偶联后透析，即得二苯甲酮类化合物人工抗原；其中，制备第一反应液所采用的C液与G液的摩尔浓度比为5~50:1。
8.根据权利要求6所述的时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，用1～2μg/ml的时间分辨荧光微球标记二苯甲酮类化合物抗体；步骤（4）所述的人工抗原包被检测线的包被浓度为0.5~1μg/cm2，羊抗兔抗体包被质控线的包被浓度为0.5~1μg/cm2。
9.根据权利要求6所述的时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条的制备方法，其特征在于，步骤（6）中，样本垫处理液包括：0.25% 吐温-20，0.1% PVP40，0.1MpH7.4 磷酸盐缓冲溶液，1% 牛血清血白蛋白；0.05% Proclin 300；所述的干燥为晾干或者风干。
10.根据权利要求6所述的时间分辨荧光微球标记的二苯甲酮类化合物快检试纸条的制备方法，其特征在于，步骤（7）中所述的试纸条宽度为2.5~3.5mm；相邻垫之间互相部分重叠部分的长度为0.5~2mm。
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