RU2417375C2 - Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека - Google Patents
Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2417375C2 RU2417375C2 RU2009128762/15A RU2009128762A RU2417375C2 RU 2417375 C2 RU2417375 C2 RU 2417375C2 RU 2009128762/15 A RU2009128762/15 A RU 2009128762/15A RU 2009128762 A RU2009128762 A RU 2009128762A RU 2417375 C2 RU2417375 C2 RU 2417375C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- component
- activity
- wells
- enzyme
- complement
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицинской иммунологии и касается способа и набора для определения функциональной активности компонента С3 комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Сущность способа заключается в том, что проводят сорбцию в лунках микропанели аптечного препарата дерината, представляющего собой дезоксирибонуклеат натрия. Затем в лунки вносят анализируемую пробу, содержащую компонент С3 с неизвестной активностью и раствор реагента R3 (сыворотку крови человека, лишенную активности компонента С3). Проводят инкубацию и после отмывки и осушения планшета в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С3 и субстрат этого фермента. Проводят расчет активности компонента С3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 комплемента человека, реагент R3 (сыворотку крови человека, лишенную активности компонента С3) и субстратный буфер. Способ позволяет достоверно и с высокой чувствительностью определять компонент С3. 2 н.п. ф-лы, 1 ил.
Description
Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.
Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Известен способ определения функциональной активности компонента С3 [1], который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета иммуноглобулина G, затем внесение в лунки микропланшета комплемента морской свинки, служащего в качестве источника компонентов С1, С2 и С4 (присутствующий компонент С3 морской свинки не обнаруживается специфическими антителами против С3 человека) и анализируемой пробы, содержащей компонент С3 человека с неизвестной активностью, и проведения инкубации для активации комплемента, в ходе которой происходит связывание С3 на молекулах активатора - сорбированного иммуноглобулина. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента С3 человека определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3, конъюгированных с ферментом.
Недостатком этого способа является трудность получения иммунохимически чистых препаратов иммуноглобулина G человека и плохое сохранение его активирующей способности при хранении, а также снижение чувствительности метода из-за присутствующего гетерологичного компонента С3 морской свинки.
Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность компонента С3 комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата дерината для использования в качестве активатора классического пути комплемента и заменой комплемента морской свинки гомологичным реагентом R3 - сыворотки крови человека, лишенной активности С3.
Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропанели аптечного препарата дерината, представляющего собой дезоксирибонуклеат натрия, хорошо сохраняемого в обычных условиях, затем внесения в лунки микропланшета реагента R3 (сыворотки человека, лишенной активности компонента С3 с сохранением активностей остальных компонентов комплемента, получаемой, например, обработкой ее в течение 18 ч при 4°С раствором KBr [2]) и анализируемой пробы, содержащей компонент С3 с неизвестной активностью, и проведения инкубации для активации комплемента, в ходе которой происходит ковалентное связывание С3 на молекулах сорбированного дерината. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента С3 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3 - фракции иммуноглобулинов G, конъюгированных с ферментом. Тем самым достигается определение функциональной активности С3 иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.
Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 комплемента человека, реагент R3, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови в качестве стандарта.
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для определения функциональной активности компонента С3, обладающих высокой чувствительностью и отсутствием необходимости использования трудно выделяемого и плохо сохраняющего свою активирующую способность препарата иммуноглобулинов.
Пример 1. Определение функциональной активности препарата компонента С3. Растворяют аптечный препарат дерината в вероналовом буферном растворе, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Са2+ и 0,5 мМ Mg2+ (VBS2+), в концентрациях 10-150 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Содержимое лунок выливают, отмывают планшет тем же буфером, затем осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора VBS2+, содержащего 10 мкл реагента R3 (сыворотки крови человека, лишенной активности компонента С3), и анализируемую пробу, содержащую компонент С3 с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, (ЗФР-Т) и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента С3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, отмывки ЗФР-Т и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера с ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 5-10 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Функциональную активность препарата С2 рассчитывают по стандартной кривой (см. чертеж).
Пример 2. Приготовление R3. К 10 мл охлажденной до 4°С свежей сыворотки крови человека при непрерывном помешивании медленно приливают 10 мл насыщенного при 4°С раствора KBr. Смесь инкубируют 18 ч при 4°С, затем диализуют 18 ч против изотонического фосфатного буфера, рН 7,2, разливают по пробиркам и хранят при -50°С. В качестве реагента R3 используют препарат, разбавленный вероналовым буфером в соотношении 2:3.
Пример 3. Набор для определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту С3 комплемента человека, реагент R3, субстратный буфер и стандарт с известной активностью компонента С3.
Из приведенных на чертеже результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного компонента С2 с коэффициентом корреляции R2=0,992, что позволяет достоверно определять функциональную активность компонента С3 описанным способом с использованием описанного набора. Предложенный способ позволяет определять активность С3 в концентрациях от 7 нг/мл до 1000 нг/мл, что выгодно отличает его от чувствительности прототипа, позволяющего определять активность С3, начиная с концентрации 50 нг/мл.
Источники информации
1. Козлов Л.В., Романов С.В., Дьяков В.Л. Способ определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека по классическому пути. 2005.
Патент РФ 2251397. Бюл.№13. 10.05.2005.
2. Козлов Л.В., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, С3, С4 и С5. Биоорганическая химия. 1982. Т.8. №5. С.652-659.
Claims (2)
1. Способ определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека, предусматривающий сорбцию в лунках микропанели активатора классического пути комплемента, внесение в лунки микропанели анализируемой пробы, содержащей компонент С3 комплемента человека с неизвестной активностью, и раствора, содержащего компоненты С1, С2 и С4, инкубацию, выливание содержимого лунок, внесение конъюгата фермента с антителами против компонента С3 человека, а затем, после инкубации и удаления инкубационного раствора, внесение субстратного буфера, проведение расчета активности компонента С3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции, отличающийся тем, что в качестве активатора классического пути комплемента используют деринат, а в качестве раствора, содержащего компоненты С1, С2 и С4, реагент R3, представляющий собой сыворотку крови человека, лишенную активности С3.
2. Набор для определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 комплемента человека, реагент R3, представляющий собой сыворотку крови человека, лишенную активности С3, и субстратный буфер.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2009128762/15A RU2417375C2 (ru) | 2009-07-28 | 2009-07-28 | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2009128762/15A RU2417375C2 (ru) | 2009-07-28 | 2009-07-28 | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2009128762A RU2009128762A (ru) | 2011-02-10 |
RU2417375C2 true RU2417375C2 (ru) | 2011-04-27 |
Family
ID=44731724
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2009128762/15A RU2417375C2 (ru) | 2009-07-28 | 2009-07-28 | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2417375C2 (ru) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2506594C1 (ru) * | 2012-09-26 | 2014-02-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека |
RU2542401C1 (ru) * | 2013-11-06 | 2015-02-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ определения функциональной активности компонента с2 комплемента человека |
RU2542404C1 (ru) * | 2013-11-06 | 2015-02-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ определения функциональной активности компонента с4 комплемента человека |
RU2545775C1 (ru) * | 2013-11-06 | 2015-04-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ определения функциональной активности компонента сз комплемента человека |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2495432C1 (ru) * | 2012-09-26 | 2013-10-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с4 комплемента человека |
-
2009
- 2009-07-28 RU RU2009128762/15A patent/RU2417375C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
«Набор жидких реагентов для количественного определения общего гомоцистеина в сыворотке и плазме крови» Инструкция к применению. [найдено в Интернет: www.lachema.ru]. «Набор жидких реагентов для количественного определения кислой фосфатазы в крови» Инструкция к применению, [найдено в Интернет: www.labix.ru]. * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2506594C1 (ru) * | 2012-09-26 | 2014-02-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека |
RU2542401C1 (ru) * | 2013-11-06 | 2015-02-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ определения функциональной активности компонента с2 комплемента человека |
RU2542404C1 (ru) * | 2013-11-06 | 2015-02-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ определения функциональной активности компонента с4 комплемента человека |
RU2545775C1 (ru) * | 2013-11-06 | 2015-04-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ определения функциональной активности компонента сз комплемента человека |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2009128762A (ru) | 2011-02-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPH0684970B2 (ja) | 糞便中の潜血検出方法 | |
RU2417375C2 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека | |
CA3007177A1 (en) | A method of quantitative determination of sarcosine in a biological sample using anti-sarcosine antibodies and peroxidase-active gold nanoparticles or quantum dots | |
RU2232991C1 (ru) | Способ определения функциональной активности фактора d комплемента человека | |
STRAUS | Cytochemical detection of sites of antibody to horseradish peroxidase in spleen and lymph nodes | |
RU2380707C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по альтернативному пути активации | |
JP4197393B2 (ja) | IgA腎症の検査法 | |
RU2405042C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с2 комплемента человека | |
RU2232992C1 (ru) | Способ определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по альтернативному пути активации | |
RU2195662C1 (ru) | Способ определения функциональной активности c1-ингибитора комплемента человека | |
RU2376606C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с4 комплемента человека | |
RU2413224C1 (ru) | СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА C1q КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА | |
RU2376605C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора d комплемента человека | |
RU2425383C1 (ru) | СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ C1r2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА | |
RU2506594C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека | |
RU2374650C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора в комплемента человека | |
RU2450275C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с9 комплемента человека по альтернативному пути | |
FR2644894A1 (fr) | Trousse et methode de dosage enzymatique applicables a des cellules entieres | |
RU2232993C1 (ru) | Способ определения функциональной активности фактора b комплемента человека | |
RU2457491C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с9 комплемента человека по классическому пути | |
RU2195670C1 (ru) | Способ определения функциональной активности компонента c2 комплемента человека | |
RU2495432C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с4 комплемента человека | |
RU2571289C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по способности связываться с лизоцимом | |
RU2251697C1 (ru) | Способ определения функциональной активности компонента c3 комплемента человека по классическому пути активации | |
RU2313094C1 (ru) | СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕЙСТВИЯ ВЕЩЕСТВ НА СВЯЗЫВАНИЕ СУБКОМПОНЕНТОВ C1q КОМПЛЕМЕНТА |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170729 |