RU2376605C1 - Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора d комплемента человека - Google Patents
Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора d комплемента человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2376605C1 RU2376605C1 RU2008138635/15A RU2008138635A RU2376605C1 RU 2376605 C1 RU2376605 C1 RU 2376605C1 RU 2008138635/15 A RU2008138635/15 A RU 2008138635/15A RU 2008138635 A RU2008138635 A RU 2008138635A RU 2376605 C1 RU2376605 C1 RU 2376605C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- factor
- activity
- human
- complement
- human complement
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и касается способа и набора для иммуноферментного определения функциональной активности фактора D комплемента человека. Сущность изобретения включает внесение в лунки микропанели лизоцима в качестве активатора альтернативного пути комплемента, затем внесение раствора реагента RD и анализированной пробы, далее проводят инкубацию в присутствии ионов Mg2+ и в отсутствие ионов Са2+, а затем вносят конъюгат фермента с антителами против компонента СЗ человека и субстрат этого фермента и проводят расчет активности фактора D по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Набор для определения функциональной активности фактора D комплемента человека содержит плоскодонную микропанель с сорбированным лизоцимом, реагент RD (сыворотку крови человека, лишенную активности фактора D), конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту СЗ комплемента человека, субстратный буфер и стандарт с известной активностью фактора D. Преимущество изобретения заключается в повышении чувствительности способа. 2 н.п. ф-лы, 1 ил.
Description
Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности факторов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.
Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Известен способ определения функциональной активности фактора D альтернативного пути комплемента человека[1], который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета активатора альтернативного пути комплемента, выбранного из ряда: иммуноглобулин А, иммуноглобулин G, компонент С3, липополисахарид, затем внесение в лунки микропланшета раствора, содержащего реагент RD (сыворотки крови человека, лишенной активности фактора D), и анализируемой пробы, содержащей фактор D комплемента человека с неизвестной активностью, проведение инкубации в присутствии ионов Mg2+ и в отсутствие ионов Са2+ (в ходе которой происходит формирование С3-конвертазы (С3bВb) на сорбированном активаторе альтернативного пути в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого фактора D, осуществляющего активацию фактора В в ходе образования С3-конвертазы, в результате чего происходит активация этой конвертазой С3 и ковалентное связывание последнего на сорбированном активаторе), выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента СЗ человека и субстрата этого фермента и проведение расчета активности фактора D по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.
Единственным недостатком этого способа является относительно трудная доступность и плохая длительная сохраняемость активирующей способности индивидуальных, высокоочищенных препаратов активаторов альтернативного пути, сорбируемых на микропанели, а в случае липополисахаридов, кроме того, трудности в их сорбции на полистироловых планшетах, обычно используемых в иммуноферментном анализе.
Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность фактора D альтернативного пути системы комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата для использования в качестве активатора альтернативного пути комплемента.
Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропланшета аптечного препарата лизоцима, хорошо сохраняемого в обычных условиях, затем внесение в лунки микропланшета раствора, содержащего реагент RD (сыворотки крови человека, лишенной активности фактора D), и анализируемой пробы, содержащей фактор D комплемента человека с неизвестной активностью, проведение инкубации в присутствии ионов Mg2+ и в отсутствие ионов Са2+ (в ходе которой происходит формирование С3-конвертазы (С3bВb) на сорбированном активаторе альтернативного пути в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого фактора D, осуществляющего активацию фактора В в ходе образования С3-конвертазы, в результате чего происходит активация этой конвертазой С3 и ковалентное связывание последнего на сорбированном активаторе), выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента СЗ человека и субстрата этого фермента и проведение расчета активности фактора D по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.
Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным лизоцимом, реагент RD (например, сыворотку крови человека, лишенную активности фактора D), конъюгат фермента с антителами к компоненту СЗ комплемента человека, субстратный буфер и стандарт с известной активностью фактора D.
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для определения функциональной активности фактора D комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости использования труднодоступных высокоочищенных препаратов активаторов альтернативного пути, плохо сохраняющих свою активирующую способность, какими являются иммуноглобулина G и А, компонент С3 и липополисахарид.
Пример 1. Определение функциональной активности препарата фактора D. Растворяют активатор альтернативного пути комплемента - аптечный препарат лизоцима в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Три раза отмывают микропанель вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 10 мМ этиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту и 5 мМ MgCl2 (Mg-EGTA), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем микропанель осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки микропанели ряда вносят по 100 мкл раствора Mg-EGTA, содержащего 10 мкл реагента RD (RD - сыворотка человека, лишенная фактора D, с сохранением активностей остальных компонентов и факторов комплемента, получаемая, например, хроматографической сорбцией фактора D на колонке с СМ-сефадексом С-50 из сыворотки крови человека [2]) и анализируемую пробу, содержащую фактор D с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента СЗ человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Функциональную активность препарата фактора D рассчитывают по стандартной кривой (чертеж).
Пример 2. Набор для определения функциональной активности фактора D. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным лизоцимом, реагент RD (сыворотку крови человека, лишенную активности фактора D), конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту СЗ комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови в качестве стандарта. Данный набор используется в соответствии с примером 1.
Из приведенных результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного фактора D с коэффициентом корреляции R=0,996, что позволяет достоверно определять функциональную активность фактора D описанным способом с использованием описанного набора.
Литература.
1. Козлов Л.В., Романов СВ., Дьяков В.Л., Лахтин В.М. Способ определения функциональной активности фактора D комплемента человека. Патент РФ №223991, 20.07.2004.
2. Козлов Л.В., Соляков Л.С. Возможность участия зимогенных форм факторов В и D в активации альтернативного пути системы комплемента. Биоорганическая химия. 1982. Т.8. №3. С.342-348.
Claims (2)
1. Способ определения функциональной активности фактора D комплемента человека, предусматривающий сорбцию в лунках микропанели активатора альтернативного пути комплемента, внесение в лунки микропанели раствора, содержащего реагент RD, и анализируемой пробы, содержащей фактор D комплемента человека с неизвестной активностью, инкубирование в присутствии ионов Mg2+ и в отсутствии ионов Са2+, выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента СЗ человека и субстрата этого фермента, проведение расчета активности фактора D по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции, отличающийся тем, что в качестве активатора альтернативного пути комплемента используют лизоцим.
2. Набор для определения функциональной активности фактора D комплемента человека, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным лизоцимом, реагент RD, конъюгат фермента с антителами к компоненту СЗ комплемента человека, субстратный буфер и стандарт с известной активностью фактора D.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008138635/15A RU2376605C1 (ru) | 2008-09-30 | 2008-09-30 | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора d комплемента человека |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008138635/15A RU2376605C1 (ru) | 2008-09-30 | 2008-09-30 | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора d комплемента человека |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2376605C1 true RU2376605C1 (ru) | 2009-12-20 |
Family
ID=41625775
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008138635/15A RU2376605C1 (ru) | 2008-09-30 | 2008-09-30 | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора d комплемента человека |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2376605C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2542407C1 (ru) * | 2013-11-06 | 2015-02-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ определения функциональной активности фактора d комплемента человека |
RU2565454C1 (ru) * | 2014-10-09 | 2015-10-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора н комплемента человека |
-
2008
- 2008-09-30 RU RU2008138635/15A patent/RU2376605C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
GICLAS PC., Alternative pathway evaluation, Curr. Protoc. Immunol, 2001, May, Chapter 13, unit 13.2. BARNUM SR. et al., Quantitation of complement factor D in human serum by a solid radioimmunoassay, Immunol. Method., 1984, Mar. 16, v. 67, (2), p.303-309. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2542407C1 (ru) * | 2013-11-06 | 2015-02-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ определения функциональной активности фактора d комплемента человека |
RU2565454C1 (ru) * | 2014-10-09 | 2015-10-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора н комплемента человека |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPS63294799A (ja) | グルコ−ス及び1,5−アンヒドログルシト−ルの同時測定法 | |
RU2232991C1 (ru) | Способ определения функциональной активности фактора d комплемента человека | |
CN102367270B (zh) | 环孢霉素a半抗原的制备方法及环孢霉素a的酶联免疫定量检测试剂盒 | |
RU2417375C2 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека | |
RU2380707C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по альтернативному пути активации | |
JPS5879163A (ja) | 糖結合ヘモグロビンの測定法 | |
RU2376605C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора d комплемента человека | |
RU2376606C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с4 комплемента человека | |
RU2232992C1 (ru) | Способ определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по альтернативному пути активации | |
JP4622836B2 (ja) | 分析装置 | |
RU2374650C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора в комплемента человека | |
RU2195662C1 (ru) | Способ определения функциональной активности c1-ингибитора комплемента человека | |
CN111610333A (zh) | 一种基于指尖血的酶联免疫分析方法 | |
RU2405042C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с2 комплемента человека | |
RU2413224C1 (ru) | СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА C1q КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА | |
RU2506594C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека | |
US5958785A (en) | Detection of a carbohydrate biomarker directly associated with chronic alcoholism | |
RU2425383C1 (ru) | СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ C1r2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА | |
RU2232993C1 (ru) | Способ определения функциональной активности фактора b комплемента человека | |
RU2450275C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с9 комплемента человека по альтернативному пути | |
CN109799352B (zh) | 化学发光试剂及其在免疫检测中应用 | |
RU2457491C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с9 комплемента человека по классическому пути | |
RU2495432C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с4 комплемента человека | |
RU2251697C1 (ru) | Способ определения функциональной активности компонента c3 комплемента человека по классическому пути активации | |
RU2195670C1 (ru) | Способ определения функциональной активности компонента c2 комплемента человека |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171001 |