RU2376605C1 - Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора d комплемента человека - Google Patents

Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора d комплемента человека Download PDF

Info

Publication number
RU2376605C1
RU2376605C1 RU2008138635/15A RU2008138635A RU2376605C1 RU 2376605 C1 RU2376605 C1 RU 2376605C1 RU 2008138635/15 A RU2008138635/15 A RU 2008138635/15A RU 2008138635 A RU2008138635 A RU 2008138635A RU 2376605 C1 RU2376605 C1 RU 2376605C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
factor
activity
human
complement
human complement
Prior art date
Application number
RU2008138635/15A
Other languages
English (en)
Inventor
Наталья Вадимовна Гора (RU)
Наталья Вадимовна Гора
Леонид Васильевич Козлов (RU)
Леонид Васильевич Козлов
Original Assignee
Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека filed Critical Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Priority to RU2008138635/15A priority Critical patent/RU2376605C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2376605C1 publication Critical patent/RU2376605C1/ru

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины и касается способа и набора для иммуноферментного определения функциональной активности фактора D комплемента человека. Сущность изобретения включает внесение в лунки микропанели лизоцима в качестве активатора альтернативного пути комплемента, затем внесение раствора реагента RD и анализированной пробы, далее проводят инкубацию в присутствии ионов Mg2+ и в отсутствие ионов Са2+, а затем вносят конъюгат фермента с антителами против компонента СЗ человека и субстрат этого фермента и проводят расчет активности фактора D по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Набор для определения функциональной активности фактора D комплемента человека содержит плоскодонную микропанель с сорбированным лизоцимом, реагент RD (сыворотку крови человека, лишенную активности фактора D), конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту СЗ комплемента человека, субстратный буфер и стандарт с известной активностью фактора D. Преимущество изобретения заключается в повышении чувствительности способа. 2 н.п. ф-лы, 1 ил.

Description

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности факторов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.
Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Известен способ определения функциональной активности фактора D альтернативного пути комплемента человека[1], который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета активатора альтернативного пути комплемента, выбранного из ряда: иммуноглобулин А, иммуноглобулин G, компонент С3, липополисахарид, затем внесение в лунки микропланшета раствора, содержащего реагент RD (сыворотки крови человека, лишенной активности фактора D), и анализируемой пробы, содержащей фактор D комплемента человека с неизвестной активностью, проведение инкубации в присутствии ионов Mg2+ и в отсутствие ионов Са2+ (в ходе которой происходит формирование С3-конвертазы (С3bВb) на сорбированном активаторе альтернативного пути в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого фактора D, осуществляющего активацию фактора В в ходе образования С3-конвертазы, в результате чего происходит активация этой конвертазой С3 и ковалентное связывание последнего на сорбированном активаторе), выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента СЗ человека и субстрата этого фермента и проведение расчета активности фактора D по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.
Единственным недостатком этого способа является относительно трудная доступность и плохая длительная сохраняемость активирующей способности индивидуальных, высокоочищенных препаратов активаторов альтернативного пути, сорбируемых на микропанели, а в случае липополисахаридов, кроме того, трудности в их сорбции на полистироловых планшетах, обычно используемых в иммуноферментном анализе.
Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность фактора D альтернативного пути системы комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата для использования в качестве активатора альтернативного пути комплемента.
Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропланшета аптечного препарата лизоцима, хорошо сохраняемого в обычных условиях, затем внесение в лунки микропланшета раствора, содержащего реагент RD (сыворотки крови человека, лишенной активности фактора D), и анализируемой пробы, содержащей фактор D комплемента человека с неизвестной активностью, проведение инкубации в присутствии ионов Mg2+ и в отсутствие ионов Са2+ (в ходе которой происходит формирование С3-конвертазы (С3bВb) на сорбированном активаторе альтернативного пути в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого фактора D, осуществляющего активацию фактора В в ходе образования С3-конвертазы, в результате чего происходит активация этой конвертазой С3 и ковалентное связывание последнего на сорбированном активаторе), выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента СЗ человека и субстрата этого фермента и проведение расчета активности фактора D по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.
Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным лизоцимом, реагент RD (например, сыворотку крови человека, лишенную активности фактора D), конъюгат фермента с антителами к компоненту СЗ комплемента человека, субстратный буфер и стандарт с известной активностью фактора D.
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для определения функциональной активности фактора D комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости использования труднодоступных высокоочищенных препаратов активаторов альтернативного пути, плохо сохраняющих свою активирующую способность, какими являются иммуноглобулина G и А, компонент С3 и липополисахарид.
Пример 1. Определение функциональной активности препарата фактора D. Растворяют активатор альтернативного пути комплемента - аптечный препарат лизоцима в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Три раза отмывают микропанель вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 10 мМ этиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту и 5 мМ MgCl2 (Mg-EGTA), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем микропанель осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки микропанели ряда вносят по 100 мкл раствора Mg-EGTA, содержащего 10 мкл реагента RD (RD - сыворотка человека, лишенная фактора D, с сохранением активностей остальных компонентов и факторов комплемента, получаемая, например, хроматографической сорбцией фактора D на колонке с СМ-сефадексом С-50 из сыворотки крови человека [2]) и анализируемую пробу, содержащую фактор D с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента СЗ человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Функциональную активность препарата фактора D рассчитывают по стандартной кривой (чертеж).
Пример 2. Набор для определения функциональной активности фактора D. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным лизоцимом, реагент RD (сыворотку крови человека, лишенную активности фактора D), конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту СЗ комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови в качестве стандарта. Данный набор используется в соответствии с примером 1.
Из приведенных результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного фактора D с коэффициентом корреляции R=0,996, что позволяет достоверно определять функциональную активность фактора D описанным способом с использованием описанного набора.
Литература.
1. Козлов Л.В., Романов СВ., Дьяков В.Л., Лахтин В.М. Способ определения функциональной активности фактора D комплемента человека. Патент РФ №223991, 20.07.2004.
2. Козлов Л.В., Соляков Л.С. Возможность участия зимогенных форм факторов В и D в активации альтернативного пути системы комплемента. Биоорганическая химия. 1982. Т.8. №3. С.342-348.

Claims (2)

1. Способ определения функциональной активности фактора D комплемента человека, предусматривающий сорбцию в лунках микропанели активатора альтернативного пути комплемента, внесение в лунки микропанели раствора, содержащего реагент RD, и анализируемой пробы, содержащей фактор D комплемента человека с неизвестной активностью, инкубирование в присутствии ионов Mg2+ и в отсутствии ионов Са2+, выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента СЗ человека и субстрата этого фермента, проведение расчета активности фактора D по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции, отличающийся тем, что в качестве активатора альтернативного пути комплемента используют лизоцим.
2. Набор для определения функциональной активности фактора D комплемента человека, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным лизоцимом, реагент RD, конъюгат фермента с антителами к компоненту СЗ комплемента человека, субстратный буфер и стандарт с известной активностью фактора D.
RU2008138635/15A 2008-09-30 2008-09-30 Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора d комплемента человека RU2376605C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2008138635/15A RU2376605C1 (ru) 2008-09-30 2008-09-30 Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора d комплемента человека

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2008138635/15A RU2376605C1 (ru) 2008-09-30 2008-09-30 Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора d комплемента человека

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2376605C1 true RU2376605C1 (ru) 2009-12-20

Family

ID=41625775

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2008138635/15A RU2376605C1 (ru) 2008-09-30 2008-09-30 Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора d комплемента человека

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2376605C1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2542407C1 (ru) * 2013-11-06 2015-02-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ определения функциональной активности фактора d комплемента человека
RU2565454C1 (ru) * 2014-10-09 2015-10-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора н комплемента человека

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GICLAS PC., Alternative pathway evaluation, Curr. Protoc. Immunol, 2001, May, Chapter 13, unit 13.2. BARNUM SR. et al., Quantitation of complement factor D in human serum by a solid radioimmunoassay, Immunol. Method., 1984, Mar. 16, v. 67, (2), p.303-309. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2542407C1 (ru) * 2013-11-06 2015-02-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ определения функциональной активности фактора d комплемента человека
RU2565454C1 (ru) * 2014-10-09 2015-10-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора н комплемента человека

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPS63294799A (ja) グルコ−ス及び1,5−アンヒドログルシト−ルの同時測定法
RU2232991C1 (ru) Способ определения функциональной активности фактора d комплемента человека
CN102367270B (zh) 环孢霉素a半抗原的制备方法及环孢霉素a的酶联免疫定量检测试剂盒
RU2417375C2 (ru) Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека
RU2380707C1 (ru) Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по альтернативному пути активации
JPS5879163A (ja) 糖結合ヘモグロビンの測定法
RU2376605C1 (ru) Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора d комплемента человека
RU2376606C1 (ru) Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с4 комплемента человека
RU2232992C1 (ru) Способ определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по альтернативному пути активации
JP4622836B2 (ja) 分析装置
RU2374650C1 (ru) Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора в комплемента человека
RU2195662C1 (ru) Способ определения функциональной активности c1-ингибитора комплемента человека
CN111610333A (zh) 一种基于指尖血的酶联免疫分析方法
RU2405042C1 (ru) Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с2 комплемента человека
RU2413224C1 (ru) СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА C1q КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА
RU2506594C1 (ru) Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека
US5958785A (en) Detection of a carbohydrate biomarker directly associated with chronic alcoholism
RU2425383C1 (ru) СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ C1r2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА
RU2232993C1 (ru) Способ определения функциональной активности фактора b комплемента человека
RU2450275C1 (ru) Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с9 комплемента человека по альтернативному пути
CN109799352B (zh) 化学发光试剂及其在免疫检测中应用
RU2457491C1 (ru) Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с9 комплемента человека по классическому пути
RU2495432C1 (ru) Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с4 комплемента человека
RU2251697C1 (ru) Способ определения функциональной активности компонента c3 комплемента человека по классическому пути активации
RU2195670C1 (ru) Способ определения функциональной активности компонента c2 комплемента человека

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20171001