CN102367270B - 环孢霉素a半抗原的制备方法及环孢霉素a的酶联免疫定量检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明“环孢霉素A半抗原的制备方法及环孢霉素A的酶联免疫定量检测试剂盒”,属于医学检测试剂。本发明主要提供环孢霉素A半抗原的制备方方法及制备得到的环孢霉素A半抗原,采用该半抗原的环孢霉素A的酶联免疫定量检测试剂盒可以制作成板式酶标板以适应国内普及的检测设备,并且能保证检测灵敏度高,稳定性好,结果准确。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测试剂,特别是环孢霉素A半抗原的制备方法及环孢霉素A的酶联免疫定量检测试剂盒。
背景技术
环孢霉素A(cyclosporin A)是一种从真菌中提取,由瑞士山德士药厂1976年首次发现并报告有免疫抑制作用的药物。同年英国剑桥的R.Calne在动物的器官移植上应用取得了令人难忘的结果,并于1978年成功地试用于临床肾脏移植和骨髓移植。环孢霉素A的出现对器官移植的发展起了巨大的推动作用,如今被称之为“器官移植的环孢霉素”,是目前最常用的免疫抑制剂,也用于自身免疫疾病的治疗。其主要作用是通过可选择性地抑制免疫应答,有选择性地抑制活性T细胞增殖依赖的细胞因子IL-2,致使T细胞分化、发育产生障碍,从而保护移植物(器官)免遭T细胞毒性作用的破坏,而对其他的免疫细胞的抑制作用则相对较弱。
在临床上,环孢霉素A的使用剂量、血药浓度与疗效、药物毒性密切相关,在高血浓度时有一定的毒性,主要是神经毒性和肾毒性。因此临床使用需要制定合理的用药方案,经常测定血中环孢霉素A的浓度来监测环孢霉素A的用量是否合适。
据统计,截至2008年,我国移植手术总量已经超过10万次,现在我国已经成为继美国之后的世界第二大器官移植国家,每年器官移植手术已经超过1万例,而且随着经济及医疗水平的发展,以后的器官移植患者会越来越多。环孢霉素A由于具有上市早,药效明显,价格相对低廉的特点,是当前居于市场首位的免疫抑制剂,约占当前免疫抑制剂市场份额的25%。一般移植手术后2月内,病人需要每1-2周检测一次血药浓度,4月内每2-4周检测一次血药浓度,半年以上要每月检测一次血药浓度。
现在国内市场上用于环孢霉素A检测的试剂盒几乎全部依赖进口,生产检测试剂盒的厂家主要有美国Dade Behring公司、美国雅培制药有限公司、德国罗氏集团、西门子医学诊断产品公司,其中用于检测反应的半抗原环孢霉素A都包被为微粒子结构,以适用于配套的分析仪器进行检测,这样就提高了医院及检测中心的准入门槛,对检测实验操作人员要求也比较高,同样附加于病人的诊疗费用也相应提高。而国内实际情况是,人均国民经济水平偏低,器官移植患者对于进口试剂的经济承受能力有限,而且医疗卫生检测机构水平差距非常大,对于很多进口仪器的操作和数据分析,缺乏专业技术人员;而酶标仪已经逐步国产化,相对于进口试剂配套的检测仪器,酶标仪的价格是目前大多数地方医院及检测中心所能接受的,且酶标仪操作简单、便捷,对技术人员要求不高。现在的酶标仪只适合检测包被为板式的抗原板或抗体板,而环孢霉素A本身为小分子药物,属于半抗原,采用现有技术中常用的抗原包被方法,均无法得到灵敏度高、重复性好的适于检测应用的酶标板,因此,首先得克服这一技术困难,才能做成适于国内普遍适用的环孢霉素A检测试剂盒。
发明内容
根据上述领域的空白及需求,本发明提供一种环孢霉素A酶联免疫检测试剂盒,具有高灵敏度和精确度,能满足检测需要,而且操作简单快捷,不需要购买昂贵的分析仪器与之配套检测,不需要特殊的技术人员进行操作,这样可以解决二线、三线城市检测中心的检测需求。
环孢霉素A半抗原的制备方法,步骤如下:
(1)环孢霉素A按质量体积比3g:1ml比例溶于嘧啶中,再逐滴加入与嘧啶等体积的二氯甲烷,搅拌下逐滴加入三甲基氯硅烷,在常温充氩气环境中搅拌过夜;
(2)将步骤(1)的产物真空蒸发干燥得到固体残渣溶于二氯甲烷,溶液过凝胶柱分离纯化,得到二氧化硅化环孢霉素A(TMS-CsA));
(3)制备一级粗产品:
按质量体积比5g:1ml将TMS-CsA溶入乙醚中,再按TMS-CsA与甲苯的质量体积比为1g:30ml加入甲苯和按TMS-CsA与氢化钠质量比2:1加入氢化钠,在通氩气的条件下常温搅拌30min后冷却到4℃,按TMS-CsA与环氧乙烷的质量体积比为1g:6ml用注射器加入环氧乙烷,然后将反应器加盖封口,常温搅拌反应24小时后,加入2~3倍反应物体积的水,用1M的HCL酸化,加入4~6倍反应物体积的二氯甲烷混合,分离有机相后,加水洗提,洗提产物用硫酸镁干燥并过凝胶柱分离纯化得到一级粗产品;
(4)于常温、通氩气的条件下,将一级粗产品2份和1,4丁二醇二缩水甘油醚按质量1份溶于甲苯中,一级粗产品与甲苯的质量体积比为1g:5~10ml,常温搅拌2h后,按一级粗产品与乙酸乙酯质量体积比为1g:100~200ml加入乙酸乙酯,及与乙酸乙酯等体积的水,分离混合液中有机相,用50%的氯化钠溶液洗提有机相,洗提产物用硫酸镁干燥并过凝胶柱分离纯化得到二级粗产品;
(5)在搅拌状态下,取按二级粗产品与甲醇的质量体积比为1g:40ml将二级粗产品加入甲醇中,补充水直至混合液有明显雾团,加入与二级粗产品质量比为1:0.5~1.5的无水碳酸钾,常温通氩气搅拌过夜,用1M盐酸酸化处理,加入与甲醇等体积的水,用二氯甲烷提取有机相,用与甲醇等体积的盐水洗涤(有机相),硫酸镁干燥得到环孢霉素A半抗原。
环孢霉素A的酶联免疫定量检测试剂盒,包括:
抗环孢霉素A的特异性单克隆抗体或抗抗体包被的酶标板,酶标记的环孢霉素A半抗原;
或与载体蛋白偶联的环孢霉素A半抗原包被的酶标板,酶标记的抗环孢霉素A的特异性单克隆抗体或抗抗体;
其特征在于所述用于包被酶标板的环孢霉素A半抗原和酶标记的环孢霉素A半抗原采用上述制备方法获得。
所述抗环孢霉素A的特异性单克隆抗体包被的酶标板的包被浓度为:0.10-0.25μg/ml。
所述与载体蛋白偶联的环孢霉素A半抗原包被的酶标板的包被浓度为0.15-0.45μg/ml:
所述抗抗体包被的酶标板的包被浓度为:0.15-0.34μg/ml。
所述载体蛋白为甲状腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白、牛血清蛋白、兔血清蛋白、蓝血蛋白或卵清蛋白。
所述试剂盒还包括样品前处理液、样品稀释液、环孢霉素A标准品溶液、环孢霉素A质量控制溶液、显色液、终止液、浓缩洗涤液。
所述样品前处理液为含20-100mM硫酸锌的甲醇溶液与乙二醇混合液;
样品稀释液为含0.3-0.5M NaCL的50mM的磷酸盐缓冲液;
环孢霉素A标准品溶液,环孢霉素A质量控制品溶液为含有不同浓度环孢霉素A的人全血溶液;
所述浓缩洗涤液为pH值为7.2~8.5、终浓度为0.02~0.05%Proclin300、1.0~2.0%吐温-20、0.01~0.03mol/L的磷酸盐缓冲液。
所述酶标记所用的标记酶为辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酯酶。
所述酶标记所用的标记酶为辣根过氧化物酶,所述显色液由显色A液和显色B液组成,中A液为的组成为:pH值为7.2~8.5,浓度为10~30mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(V/V)为0.02~0.1%Proclin300,0.1~1.0%吐温-20和10mM过氧化脲溶液;B液为50mM的Tris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/V)为0.02~0.1%Proclin300,1.0~3.0mM的4-碘苯酚,0.1%~1%的BSA,0.1~1%的溴化十六烷基三甲基铵,10~50mM鲁米诺溶液。
所述酶标记所用的标记酶为碱性磷酸酯酶时,显色剂为硝基磷酸盐缓冲液,终止液为1~2mol/L氢氧化钠溶液。
本发明提供环孢霉素A的活化方法,经该活化方法处理的环孢霉素A能够用于制备用于化学发光免疫检测的酶标板。与现有技术相比,该方法活化后的环孢霉素A制备的酶标板具有检测灵敏度高,稳定性好等优点,检测效果与进口试剂相近,但可用国内大多数医疗机构具备的检测设备进行定量检测器官移植患者全血中的环孢霉素A的浓度。
实验结果表明,本试剂盒具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点;本试剂盒的主要试剂都采用工作液形式,使用方便,成本低廉。用本发明试剂盒检测环孢霉素A的方法,操作简便,简化了传统检测方法的步骤,缩短了检测时间,对样品的前处理要求低,能同时快速检测大批量的样品。
附图说明
图1为环孢霉素A的结构式。
图2为环孢霉素与二氯甲烷反应后产生的中间产品
图3为包被原为环孢霉素A的单克隆抗体的检测试剂盒的标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
实施例1.制备环孢霉素A半抗原
1)秤取1800mg环孢霉素A(CsA)溶于6ml嘧啶,再逐滴加入6ml二氯甲烷,搅拌下逐滴加入三甲基氯硅烷,在常温充氩气环境中搅拌过夜;
2)将以上产物进行真空蒸发干燥后的固体残渣溶于二氯甲烷,过凝胶柱分离纯化,得到TMS-CsA(1700mg,89%);
3)取以上产物(1000mg,0.78mmol)加入0.2ml乙醚中,加入30ml甲苯,加入氢化钠(450mg,形成50%矿物油悬浮液,用甲苯提取),在通氩气的条件下常温搅拌30min后,冷却到4℃,用注射器加入6ml环氧乙烷后,将反应器加盖,用石蜡封口,常温搅拌24后,加入100ml水,用(1N)HCL酸化,加200ml二氯甲烷。将有机相分离后,加100ml水洗提,用硫酸镁干燥处理后,将粗产品进行凝胶分离纯化;
4)常温,通氩气的条件下,取以上产物(300mg;0.23mmol)加入1,4丁二醇二缩水甘油醚(150mg)溶于2ml甲苯,加入50ml乙酸乙酯,50ml水,将有机相分离后,用盐水/水(1:1,2×50ml)洗提,用硫酸镁干燥处理后,将粗产品进行凝胶分离纯化;
5)在搅拌状态下,取以上产品(250mg,0.17mmol)加入到10ml甲醇,补充水直至混合液有明显雾团,加无水碳酸钾200mg,常温通氩气搅拌过夜。用(1N)盐酸酸化处理,加20ml水。用二氯甲烷(3×75ml)提取有机相,用10ml盐水洗涤,硫酸镁干燥处理得到环孢霉素A半抗原。
对照环孢霉素A半抗原的制备:方法参照文献《环孢霉素A免疫全抗原合成及检测用单克隆抗体制备研究》(陈米娜,2004年博士论文)中方法进行,具体操作为:用电子天平准确称量60.0mg CsA和12.0mg BBa(4-苯甲酰苯甲酸)。于721型分光光度计比色皿(b=5mm)中,加入丙酮约1.Sml充分溶解,少量取样(0")。用针管导入小股氮气(N2)流均匀鼓泡约25分钟(min),打开冷却风扇及紫外光源开始光照。比色皿外部用冰水冷却,反应过程持续通入N2。由于氮气夹带及光照使溶液温度升高致溶剂挥发,皿内液面不断下降,当残余液量降至约0.4-0.5m1时停止光照,少量取样(1)。补加丙酮至1.8ml左右,继续通入N2并光照及取样。重复以上操作直至所取样品在小薄层层析板跑样结果非常接近,即反应速度己十分缓慢时最终结束光照。
在光解反应后的残余液(约0.4-0.5ml略呈淡黄色)加入少量丙酮使终体积在lml左右。用带S号针头的2m1注射器吸取该混合溶液,在干燥的大薄层板一端划一道粗细均匀的样品线,用吹风使溶剂挥发完全。将板末端浸入盛有层析液的层析缸中层析,待溶剂展开完全时取出层析板,标记溶剂的前沿线。将板置于通风橱中,待溶剂挥发至干,在254nm紫外灯下显色,用铅笔标出各带的大致范围。刮下Rf值约为0.55的颜色较深带的硅胶,压碎后用2×20ml甲醇抽提,合并抽提液,离心、过滤并旋转蒸干即可得到白色固体粉末状产物。取少量在相同展开体系中进行薄层层析,分析所含杂质情况,如仍含CsA和BBa,可换种展开体系CH2CI2/CH3OH/CH3COOH=95:4:1(体积比)再次薄层层析分离。最终得到的产物即为环孢霉素A半抗原
实施例2、环孢霉素A单克隆抗体为包被原,标记物为酶标半抗原的试剂盒制备及使用
一、以环孢霉素A单克隆抗体为包被原、酶标记半抗原为标记物的试剂盒检测原理如下:
在微孔条上预包被环孢霉素A抗体,样本中的环孢霉素A与酶标记的环孢霉素A与微孔条上预包被的抗环孢霉素A抗体进行竞争性结合,这样,样本吸光值与其样本中所含环孢霉素A的含量成负相关,与标准曲线比较即可得出样本中环孢霉素A的量。
二、以环孢霉素A单克隆抗体为包被原、酶标记半抗原为标记物的试剂盒组成一般可以包括如下:
1、包被有包被原的酶标板:包被原为抗环孢霉素A的鼠源单克隆抗体,包被浓度为0.10-0.25μg/ml。
2、酶标记半抗原为辣根过氧化物酶标记的环孢霉素A半抗原,其工作稀释度为1:500。
3、环孢霉素A标准品溶液:6瓶,2ml/瓶,浓度分别为0ng/ml、30ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、800ng/ml、1500ng/ml。
4、环孢霉素A质量控制液:2瓶,2ml/瓶,浓度分别为200ng/ml、1000ng/ml。
5、样品稀释液:为含0.3M NaCL的50mM的磷酸盐缓冲液,20ml/瓶,1瓶
6、底物显色液:其中A液为的组成为:pH值为8.0,浓度为30mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(V/V)为0.05%Proclin300,0.5%吐温-20和10mM过氧化脲溶液;B液为50mM的Tris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/V)为0.05%Proclin300,3mM的4-碘苯酚,1%的BSA,1%的溴化十六烷基三甲基铵,50mM鲁米诺溶液。
7、终止液:2mol/l硫酸。
8、浓缩洗涤液:pH值为7.4,含有在所述浓缩洗涤液中的终浓度为0.05%Proclin300、在所述浓缩洗涤液中的终浓度为2.0%吐温-20、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液,40ml/瓶,1瓶。
9、样品处理液:为含20~100mM硫酸锌的甲醇溶液与乙二醇混合液,10ml/瓶,1瓶。三、以环孢霉素A单克隆抗体为包被原、酶标记半抗原为标记物的试剂盒的制备
1、包被有环孢霉素A单克隆抗体的酶标板的制备
(1)环孢霉素A单克隆抗体
选择Fitzgerald公司生产的环孢霉素A单克隆抗体mouse monoclonal anti-Cyclosporine Aantibody,IgG。
(2)包被有包被原的酶标板的制备
用包被缓冲液(pH值为9.6、0.1mol/L碳酸盐缓冲液)将以上环孢霉素A抗体IgG进行1:4000稀释(即0.25ug/ml),加入到酶标板孔中,每孔100μl,37℃反应2小时,甩掉包被液后,拍干,每孔加入200μl的封闭液(含终浓度为2%牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液),37℃反应2小时,甩掉封闭液,拍干,自然晾干,用铝箔袋真空包装保存。
2、酶标环孢霉素A半抗原和对照酶标半抗原的制备
称取1mg实施例1制备得到环孢霉素A半抗原和对照环孢霉素A半抗原,分别溶于3mlN,N-二甲基甲酰胺,室温搅拌30min,逐滴加入到10ml(含3mg)的辣根过氧化物酶溶液中,室温搅拌过夜后,用Sephadex G-25进行层析纯化得到酶标环孢霉素A半抗原和对照酶标环孢霉素A半抗原。
四、以环孢霉素A单克隆抗体为包被原、酶标记环孢霉素A半抗原为酶标记物的试剂盒的应用:
1、人全血样品的前处理
将2-8℃冰箱保存的人全血环孢霉素A标准品及质量控制品溶液和待检样品,在振荡器上充分振荡混匀,立即精确吸取150μl每个样品到相应的离心管中,加入等体积的样品前处理液后立即盖好管盖,用漩涡混合仪高速旋转,确保每个样品充分混匀,将离心管放入离心机,13000r/min,离心6分钟。取20μl用于分析。
2、检测
向包被有环孢霉素A单克隆抗体的酶标板中加入样品稀释液30μl,然后在每孔中加入环孢霉素A标准品溶液、质量控制品溶液及样品溶液20μl,每孔中各加入辣根过氧化物酶标记的半抗原50μl,用盖板模封板,37℃恒温箱中反应1小时,甩干孔内液体,洗板5次,拍干;每孔加入底物显色液A液过氧化脲,底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB),轻轻振荡混匀,37℃恒温箱避光显色15分钟,每孔加入2mol/l硫酸终止液50μl,轻轻振荡混匀,用酶标仪波长设定在450/630nm处,测定每孔吸光值(OD值)。
对照检测同上,区别仅在于酶标半抗原为对照环孢霉素A半抗原。
3、检测结果分析
以标准品浓度标示值为X轴,以检测吸光度值为Y轴,进行四参数拟合,得到回归方程及拟合曲线图3。将待检测样品吸光度带入回归方程,即可求得样品浓度。本发明中检测结果的分析还可以利用计算机专业软件,此法更便于大量样品的快速分析。
五、试剂盒灵敏度、精密度、准确度和保存期检测
1、标准品精密度试验:
从实施例2步骤三中不同时间段制备的不同批次(01批、02批、03批)的试剂盒中各抽取10个试剂盒,从每个试剂盒的酶标板中各抽出20个微孔,测定300ng/ml环孢霉素A标准溶液的吸光值(OD值),计算变异系数CV%。
实验结果如表1所示,标准品吸光值的变异系数在3.9%-11.4%之间,符合精密度小于或者等于20%的规定。
而采用对照环孢霉素A半抗原的对照试剂盒的检测结果:标准品吸光值的变异系数在8.68%-21.3%。
表1 本发明试剂盒对标准品检测的重复性试验(CV%)
2、样品的精密度和准确度试验:
向不含环孢霉素A的全血中添加环孢霉素A标准品,使环孢霉素A在样品中的终浓度为200ng/ml、1000ng/ml,再按照实施例1步骤四中样本的处理方法进行样品前处理。从实施例2步骤三中不同时间段制备的不同批次(01批、02批、03批)的试剂盒中各抽取3个试剂盒,进行实验,每个样品重复10次,分别计算变异系数(CV%)。
结果如表2所示,结果表明样品的变异系数在4.58%-7.89%之间,符合精密度小于或者等于20%的规定。以样品标示浓度为1000ng/ml的样品计算批间差,见表3,结果显示该试剂盒批间变异系数为1.83%。
而采用对照环孢霉素A半抗原的试剂盒的检测结果表明样品的变异系数在9.46%-21.1%之间,批间变异系数为20.35%。
综上所述,该试剂盒批内差、批间差均小于10%,完全符合符合试剂盒精密度应该小于或者等于20%的规定。而对照试剂盒却不能很好的满足这个要求。
表2 本发明的试剂盒对样品的重复性试验(CV%)
表3 样品的批次间差异(CV%)
标示值 | 01批 | 02批 | 03批 | 平均值 | 标准差 | 批间CV% |
1000 | 1109.6 | 1089.73 | 1069.8 | 1089.71 | 19.9 | 1.83 |
样品准确度=实际测量值/实际添加值,根据表2的检测结果,以02批试剂盒中标示值为200ng/ml的样本为例,其样本的准确度结果见表4,如表中所示,样本中环孢霉素A的添加回收率在88%-110%之间。
而对照试剂盒的结果显示,样本中环孢霉素A的添加回收率在78%~123.6%之间
表4 试剂盒的准确度
3、交叉反应率试验:
选择与环孢霉素A有类似结构和类似功能的3种药物测定交叉反应率,通过各种药物的标准曲线分别得到其50%抑制浓度。用下面的公式计算步骤三中试剂盒对其他药物的交叉反应率。试剂盒对于环孢霉素A的交叉反应率越大,则其对该药物检测的特异性就越好。重复测定3次,结果取平均值。
交叉反应率(%)=(引起50%抑制环孢霉素A的浓度/引起50%抑制的环孢霉素A类似物浓度)×100%
实验结果如表5所示,本结果表明本发明试剂盒对环孢霉素A的特异性好,即本发明试剂盒可以用于特异性检测人全血中环孢霉素A的药物浓度。
而对照试剂盒特异性也良好。
表5 试剂盒的特异性
药物名称 | 交叉反应率(%) |
环孢霉素A | 100 |
他克莫司 | ﹤1 |
雷帕霉素 | ﹤1 |
4、试剂盒保存期试验
试剂盒保存条件为2-8℃,经过6个月的测定,试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50%抑制率、环孢霉素A添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中,会有非正常保存条件出现,将试剂盒在37℃保存的条件下放置5天,进行加速老化试验,结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。从以上结果可得出试剂盒在2-8℃至少可以保存6个月。
5、试剂盒的最低检测限(灵敏度)
取不含环孢霉素A的阴性人的全血样品,用步骤三中试剂盒分别进行20次检测,测定结果的平均值加上2倍标准差作为试剂盒的最低检测限。经过试验表明试剂盒的最低检测限为10ng/ml。对照试剂盒最低检测限为:18ng/ml
实施例3、用于检测人全血中环孢霉素A药物浓度的试剂盒还可以有如下几种:
一、包被原为环孢霉素A半抗原与载体蛋白偶联物,酶标二抗为酶标记物的试剂盒
1、本试剂盒的工作原理为:
当在酶标板微孔条上的包被原为环孢霉素A半抗原与载体蛋白偶联物时,向酶标板微孔中加入标准品溶液或样品溶液后,加入抗环孢霉素A的特异性抗体,样品中的环孢霉素A与酶标板上的环孢霉素A偶联抗原竞争此抗体,再加入酶标抗抗体进行放大作用,用底物显色液显色,这样样品的吸光度值与环孢霉素A的含量呈负相关,根据标准品所得的标准曲线即可得出样品中环孢霉素A的含量。
2、本试剂盒的组成为:
1)酶标板:包被原为环孢霉素A半抗原(实施例1制备)与牛血清蛋白偶联物(载体蛋白也可以为甲状腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白、牛血清蛋白、兔血清蛋白、蓝血蛋白或卵清蛋白其中一种),包被浓度为0.15-0.45μg/ml。
2)环孢霉素A特异性抗体工作液:环孢霉素A单克隆抗体工作液,用稀释液将环孢霉素A单克隆抗体稀释2000倍,得到特异性抗体工作液。
3)酶标记抗抗体为辣根过氧化物酶标记的羊(兔)抗鼠IgG,其工作稀释度为1:5000。
4)环孢霉素A标准品溶液:6瓶,2ml/瓶,浓度分别为0ng/ml、30ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、800ng/ml、1500ng/ml。
5)环孢霉素A质量控制液:2瓶,2ml/瓶,浓度分别为200ng/ml、1000ng/ml。
6)样品稀释液:为含0.3M NaCL的50mM的磷酸盐缓冲液,20ml/瓶,1瓶
7)底物显色液:其中A液为的组成为:pH值为8.0,浓度为10mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(V/V)为0.02%Proclin300,1.0%吐温-20和10mM过氧化脲溶液;B液为50mM的Tris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/V)为0.02%Proclin300,2mM的4-碘苯酚,0.1%的BSA,0.1%的溴化十六烷基三甲基铵,10Mm鲁米诺溶液。
8)终止液:2mol/l硫酸。
9)浓缩洗涤液:pH值为7.4,含有在所述浓缩洗涤液中的终浓度为0.05%Proclin300、在所述浓缩洗涤液中的终浓度为2.0%吐温-20、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液,40ml/瓶,1瓶。
10)样品处理液:为含20-100mM硫酸锌的甲醇溶液与乙二醇混合液,10ml/瓶,1瓶。
二、包被原为环孢霉素A半抗原与载体蛋白偶联物,酶标记物为酶标环孢霉素A特异性抗体的试剂盒
1、本试剂盒的工作原理为:
当在酶标板微孔条上的包被原为环孢霉素A半抗原与载体蛋白偶联物时,加入样品溶液或标准品溶液后,再加入酶标记的环孢霉素A特异性抗体,样品中的环孢霉素A或环孢霉素A标准品与酶标板上包被的环孢霉素A竞争结合酶标记的环孢霉素A特异性抗体,用底物显色液显色,这样样品的吸光度值与环孢霉素A的含量呈负相关,根据标准品所得的标准曲线即可得出样品中环孢霉素A的含量。
2、本试剂盒的组成为:
1)包被有包被原的酶标板:包被原为环孢霉素A半抗原(实施例1)与牛血清蛋白偶联(载体蛋白也可以为甲状腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白、牛血清蛋白、兔血清蛋白、蓝血蛋白或卵清蛋白等),载体蛋白与半抗原的偶联物包被浓度可以为0.15-0.45μg/ml。
2)酶标记的环孢霉素A特异性抗体工作液:酶标记环孢霉素A单克隆抗体工作液,用稀释液将酶标记的环孢霉素A单克隆抗体稀释3000倍,得到特异性抗体工作液。
3)环孢霉素A标准品溶液:6瓶,2ml/瓶,浓度分别为0ng/ml、30ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、800ng/ml、1500ng/ml。
4)环孢霉素A质量控制液:2瓶,2ml/瓶,浓度分别为200ng/ml、1000ng/ml。
5)样品稀释液:为含0.3M NaCL的50mM的磷酸盐缓冲液,20ml/瓶,1瓶
6)底物显色液:其中A液为的组成为:pH值为8.0,浓度为20mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(V/V)为0.04%Proclin300,0.1%吐温-20和10mM过氧化脲溶液;B液为50mM的Tris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/V)为0.04%Proclin300,2mM的4-碘苯酚,0.7%的BSA,0.4%的溴化十六烷基三甲基铵,30mM鲁米诺溶液。
7)终止液:2mol/l硫酸。
8)浓缩洗涤液:pH值为7.4,含有在所述浓缩洗涤液中的终浓度为0.05%Proclin300、在所述浓缩洗涤液中的终浓度为2.0%吐温-20、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液,40ml/瓶,1瓶。
9)样品处理液:为含20-100mM硫酸锌的甲醇溶液与乙二醇混合液,10ml/瓶,1瓶。
三、包被原为抗抗体,酶标记物为酶标环孢霉素A半抗原的试剂盒
1、工作原理
当在酶标板微孔条上预包被抗抗体时,加入环孢霉素A特异性抗体孵育后,加入样品溶液或者标准品溶液,再加入酶标记的环孢霉素A半抗原,这样,样本中的环孢霉素A与酶标记的环孢霉素A与微孔条上预包被的抗环孢霉素A抗体进行竞争性结合,这样,样本吸光值与其样本中所含环孢霉素A的含量成负相关,与标准曲线比较即可得出样本中环孢霉素A的量。
2、本试剂盒的组成为:
1)包被有包被原的酶标板:包被原为羊(兔)抗鼠抗抗体,包被浓度可以为0.15-0.34μg/ml。
2)酶标记物:辣根过氧化物酶标记实施例1中制备得到环孢霉素A半抗原。
3)特异性抗体工作液:环孢霉素A单克隆抗体工作液,用稀释液将酶标记的环孢霉素A单克隆抗体稀释2000倍,得到特异性抗体工作液。
4)环孢霉素A标准品溶液:6瓶,2ml/瓶,浓度分别为0ng/ml、30ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、800ng/ml、1500ng/ml。
5)环孢霉素A质量控制液:2瓶,2ml/瓶,浓度分别为200ng/ml、1000ng/ml。
6)样品稀释液:为含0.3M NaCL的50mM的磷酸盐缓冲液,20ml/瓶,1瓶
7)底物显色液:其中A液为的组成为:pH值为8.0,浓度为30mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(V/V)为0.05%Proclin300,0.5%吐温-20和10mM过氧化脲溶液;B液为50mM的Tris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/V)为0.05%Proclin300,3mM的4-碘苯酚,1%的BSA,1%的溴化十六烷基三甲基铵,50mM鲁米诺溶液。。
8)终止液:2mol/l硫酸。
9)浓缩洗涤液:pH值为7.4,含有在所述浓缩洗涤液中的终浓度为0.05%Proclin300、在所述浓缩洗涤液中的终浓度为2.0%吐温-20、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液,40ml/瓶,1瓶。
10)样品处理液:为含20-100mM硫酸锌的甲醇溶液与乙二醇混合液,10ml/瓶,1瓶。
Claims (2)
1.环孢霉素A半抗原的制备方法,步骤如下:
(1)获得如下图所示结构的二氧化硅化环孢霉素A,
(2)制备一级粗产品:
按质量体积比5g:1ml将二氧化硅化环孢霉素A溶入乙醚中,再按二氧化硅化环孢霉素A与甲苯的质量体积比为1g:30ml加入甲苯和按二氧化硅化环孢霉素A与氢化钠质量比2:1加入氢化钠,在通氩气的条件下常温搅拌30min后冷却到4℃,按二氧化硅化环孢霉素A与环氧乙烷的质量体积比为1g:6ml用注射器加入环氧乙烷,然后将反应器加盖封口,常温搅拌反应24小时后,加入2~3倍反应物体积的水,用1M的HCl酸化,加入4~6倍反应物体积的二氯甲烷混合,分离有机相后,加水洗提,洗提产物用硫酸镁干燥并过凝胶柱分离纯化得到一级粗产品;
(3)于常温、通氩气的条件下,按质量将一级粗产品2份和1,4丁二醇二缩水甘油醚1份溶于甲苯中,一级粗产品与甲苯的质量体积比为1g:5~10ml,常温搅拌2h后,按一级粗产品与乙酸乙酯质量体积比为1g:100~200ml加入乙酸乙酯,及与乙酸乙酯等体积的水,分离混合液中有机相,用50%的氯化钠溶液洗提有机相,洗提产物用硫酸镁干燥并过凝胶柱分离纯化得到二级粗产品;
(4)在搅拌状态下,取按二级粗产品与甲醇的质量体积比为1g:40ml将二级粗产品加入甲醇中,补充水直至混合液有明显雾团,加入与二级粗产品质量比为1:0.5~1.5的无水碳酸钾,常温通氩气搅拌过夜,用1M盐酸酸化处理,加入与甲醇等体积的水,用二氯甲烷提取有机相,用与甲醇等体积的盐水洗涤有机相后用硫酸镁干燥得到环孢霉素A半抗原。
2.权利要求1的制备方法得到的环孢霉素A半抗原。
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