CN102095877A - 一种采用竞争法检测环孢素a血药浓度的方法 - Google Patents

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孙庆莉
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Abstract

本发明涉及一种采用竞争法检测环孢素A血药浓度的方法，包括：在磁珠表面耦联上环孢素A，在样品孔中加入经抗凝稀释的血浆样品，加入荧光素标记的环孢素A单克隆抗体，经过洗脱，在激发光激发下测定荧光强度，即得环孢素A血药浓度。本发明操作简单，测定速度快，样品用量少，成本低，灵敏度以及线性范围比ELISA法更高更宽，具有良好的应用前景。

Description

一种采用竞争法检测环孢素A血药浓度的方法
技术领域
本发明属于检测环孢素A领域，特别涉及一种采用竞争法检测环孢素A血药浓度的方法。
背景技术
环孢素A(cyclosprine，CsA)是由11个氨基酸组成的环状多肽，是土壤中一种真菌的活性代谢物。1978年英国首次将CsA应用于临床肾移植，此后CsA又用于肝、心、肺、胰腺、骨髓等器官的移植，均取得令人满意的效果，明显提高病人的生存率。1984年环孢素A进入我国，形成了″环孢素A+硫唑嘌呤+激素″的三联免疫抑制方案，大大提高了移植存活率，同时也使移植术后急性排斥反应的发生率大幅下降。CsA作为一种强效免疫抑制剂，近年来人们对它的研究越来越多，发现它还可用来治疗自身免疫性疾病、血液病及寄生虫病等。
环孢索A口服吸收不完全，用药时间长，药动学参数个体差异大，有效治疗浓度范围狭窄。而且CsA血药浓度水平易受药物相互作用、肝胃肠功能、红细胞含量、服药方法、术后时间、性别、年龄以及饮食等众多因素的影响。其血药浓度过低时易引起排斥反应或诱发自身免疫性疾病，过高时对肝、肾及中枢神经系统均有一定毒性。因此，临床上必须定期监测其血药浓度，调整给药剂量，以充分发挥药效，减轻不良反应。
测定CsA血药浓度一般取谷值为参考值，即早晨服药前取血所测定的值。采用荧光偏振免疫测定的治疗范围：肾移植术后1个月内为300ng/ml左右，1～3个月内为250～300ng/ml，3～6个月内为250ng/ml左右，6～12个月内200～250ng/ml，12个月以后维持在200ng/ml左右。
需要说明的是：CsA个体差异非常大。有些患者CsA的浓度不高，却发生中毒；有些患者CsA浓度在治疗范围之内却发生排斥反应，即使同一患者，在术后的不同时间，相同的血药浓度却会产生不同的结果。所以CsA的有效浓度的制定必须个体化，必需在专科医生的指导下进行。
目前，国内外最常用的测定方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、高效液相质谱联用法(HPLC/MS)、高效毛细管电泳法(HPCE)、受体结合法(RBA)、荧光偏振免疫法(FPIA)、放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)等。其中以HPLC法和FPIA法应用最为广泛。
Luminex xMAP技术，又称流式荧光技术，又称悬浮阵列、液态芯片，该技术的核心是把直径为5.6um的聚苯乙烯小球用荧光染色的方法进行编码，通过调节两种荧光染料的不同配比获得最多可达100种具有不同特征荧光谱的微球，然后将每种编码微球共价交联上针对特定检测物的抗原、抗体或核酸探针等捕获分子。应用时，先把针对不同检测物的编码微球混合，再加入微量待检样本，在悬液中靶分子与微球表面交联的捕获分子发生特异性结合，在一个反应孔内可以同时完成多达100种不同的检测反应。最后用LuminexTM100进行分析，仪器通过两束激光分别识别微球的编码和检测微球上报告分子的荧光强度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种采用竞争法检测环孢素A血药浓度的方法，该方法操作简单，测定速度快，样品用量少，成本低，灵敏度以及线性范围比ELISA法更高更宽，具有良好的应用前景。
本发明的一种采用竞争法检测环孢素A血药浓度的方法，包括：
在磁珠表面耦联上环孢素A，在样品孔中加入经抗凝稀释的血浆样品，加入荧光素标记的环孢素A单克隆抗体，经过洗脱，在激发光激发下测定荧光强度，即得环孢素A血药浓度。
所述抗凝所用抗凝剂为乙二胺四乙酸，稀释倍数为4～6倍。
所述荧光素为PE。
所述激发光波长为530nm。
本发明原理：基于luminex XMAP技术平台，检测样品中的游离药物与环孢素A磁珠竞争结合荧光素标记的环孢素A单抗，导致荧光强度下降，荧光强度与游离药物浓度成反比。
有益效果
本发明操作简单，测定速度快，样品用量少，成本低，灵敏度以及线性范围比ELISA法更高更宽，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)将血浆样品用EDTA抗凝，并稀释4倍；
(2)超声波处理磁珠，用清水洗净，耦联上环孢素A；
(3)在luminex仪的样品孔中加入经抗凝稀释的血浆样品；
(4)加入PE标记的环孢素A单克隆抗体，经过洗脱，在530nm波长的激发光激发下，测定荧光强度。
实施例2
(1)将血浆样品用EDTA抗凝，并稀释6倍；
(2)超声波处理磁珠，用清水洗净，耦联上环孢素A；
(3)在luminex仪的样品孔中加入经抗凝稀释的血浆样品；
(4)加入PE标记的环孢素A单克隆抗体，经过洗脱，在530nm波长的激发光激发下，测定荧光强度。

Claims (4)

1.一种采用竞争法检测环孢素A血药浓度的方法，包括：
在磁珠表面耦联上环孢素A，在样品孔中加入经抗凝稀释的血浆样品，加入荧光素标记的环孢素A单克隆抗体，经过洗脱，在激发光激发下测定荧光强度，即得环孢素A血药浓度。
2.根据权利要求1所述的一种采用竞争法检测环孢素A血药浓度的方法，其特征在于：所述抗凝所用抗凝剂为乙二胺四乙酸，稀释倍数为4～6倍。
3.根据权利要求1所述的一种采用竞争法检测环孢素A血药浓度的方法，其特征在于：所述荧光素为PE。
4.根据权利要求1所述的一种采用竞争法检测环孢素A血药浓度的方法，其特征在于：所述激发光波长为530nm。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102368072A (zh) * 2011-06-30 2012-03-07 同昕生物技术（北京）有限公司 检测环孢霉素a药物浓度的化学发光酶联免疫检测试剂盒
CN102367270A (zh) * 2011-06-30 2012-03-07 同昕生物技术（北京）有限公司 环孢霉素a半抗原的制备方法及环孢霉素a的酶联免疫定量检测试剂盒

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