KR20140143140A - 피분석물을 검출 및 측정하기 위한 방법 및 장치 - Google Patents

피분석물을 검출 및 측정하기 위한 방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

상부가 작용기화되어 있는 표적 실체에 대한 센서, 이 표적 실체에 특이적인 적어도 하나의 압타머, 및 이를 제조 및 사용하는 방법이 당화된 단백질 모니터링 및/또는 바이오마커에서의 용도에 대해 기술한다.

Description

피분석물을 검출 및 측정하기 위한 방법 및 장치{METHODS AND DEVICES FOR DETECTION AND MEASUREMENT OF ANALYTES}
관련 출원에 대한 참고 설명
본 발명은 2012년 1월 31일에 출원한 미국 임시특허출원 61/593,054의 우선권을 주장한다. 상기 임시 출원의 전체 명세서는 본원에 분명히 참고인용된다.
연방정부 보조를 받은 연구에 관한 진술
본 발명은 정부 보조를 받지 않았고, 이에 정부는 본 발명에 어떠한 권리도 없다.
서열목록
본 출원은 EFS-웹을 통해 제출한 서열목록을 갖고 있고, 여기에 그 전체가 참고 인용된다. 2013년 1월 31일자로 만든 ASCII 카피의 파일명은 420_53354_SEQ_LIST_D2012-15.txt이며, 크기는 3,888바이트이다.
기술분야 및 산업상 이용가능성
본 발명은 압타머(aptamer) 작용기화된 표면 플라스몬 공명(SPR) 센서, 이를 제조하는 방법 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
이하의 설명은 본 발명과 관련된 요약된 정보를 제공하며, 본원에 제공된 정보 또는 본원에 언급된 공보가 모두 본 발명의 선행 기술임을 시인하는 것은 아니다.
혈액 단백질의 직접 검출은 많은 과학적 및 임상적 이용분야, 예컨대 당뇨병에서 특정 단백질 당화 비의 모니터링, 약물 연구 및 환경 모니터링을 위한 바이오마커, 암진단 및 치료 등에 혜택을 줄 수 있다. 혈액 단백질에 대한 현재의 임상적 및 실험실적 측정 기술은 보로네이트 친화성 면역분석, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 질량 분광분석 및 모세관-기반 시스템이며, 이들은 시간 소모적이고 비용이 많이 든다.
더욱 효과적이고 빠른 반응의 측정 방법은 관련 이용 분야, 특히 실시간 분석할 수 있는 차세대 휴대용 진단 장치를 개발하는데 큰 도움을 줄 수 있고 향상시킬 수 있다. 여러 가지 광학-기반의 진단 기술, 예컨대 근적외선 분광분석, 편광측정법, 광간섭단층촬영, 표면플라스몬공명(SPR), 라만 및 형광 분광분석법은 최근 혈액 성분을 모니터링하기 위해 조사되고 있다. 하지만, 이러한 많은 광학 방법들은 연구 중인 샘플에 존재할 수 있는 혼재성 물질의 영향으로 인해 유용성이 제한적이다.
표적 분자에 높은 특이성으로 결합할 수 있는 핵산 분자를 시험관내 선택하기 위한 1가지 방법은 일반적으로 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Amplification)로 알려져 있고, 본원에 참고 인용되는 미국 특허 5,475,096 ("Nucleic Acid Ligands" 및 미국 특허 5,270,163 ("Nucleic Acid Ligands")에 각각 기술되어 있다.
현재 사용되는 SELEX 방법은 유용하지만, 시험관내 선택 기술로부터 더욱 선택적인 압타머가 선택될 수 있도록 하는 개선된 방법은 항상 필요하다.
1가지 광범위한 관점에 따르면, 본 발명은 표적 실체(entity)의 존재를 검출하기 위한 센서로서, 아민-종결된 말단을 갖거나 기재에 유사 결합을 하는 압타머 프로브(aptamer probe)를 함유하고, 이 센서가 에너지원에 의해 여기될 때, i) 표적 실체와 압타머 프로브 사이에 특이적 상호작용의 부재 시에는 기준선 시그널이 방출되고; 또는 (ii) 표적 실체와 압타머 프로브 사이에 특이적 상호작용의 존재 시에는 검출 시그널이 방출되며, 기준선 시그널은 검출 시그널과 달라서, 표적 실체의 선택적 존재가 검출되는 센서를 제공한다.
특정 양태에 따르면, 압타머 프로브는 표적 실체와 특이적으로 상호작용하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정 양태에 따르면, 표적 실체는 큰 생체분자, 작은 생체분자, 유기 분자, 소분자, 핵산, 금속 이온, 단백질, 효소, 펩타이드, 약물, 염료, 암세포, 바이러스, 호르몬 또는 미생물 중 하나 이상이다. 특정 양태에 따르면, 단백질은 혈액 단백질이다.
특정 양태에 따르면, 압타머 프로브는 압타머 및 부착된 아민 모이어티(moiety)를 함유한다.
특정 양태에 따르면, 압타머 프로브는 기재와 아민 모이어티 사이에 SAM 링커를 포함한다.
특정 양태에 따르면, 아민-종결된 압타머 프로브는 3-머캅토프로피온산(MPA)에 의해 기재에 결합한다.
특정 양태에 따르면, 센서는 링커 특징에 기초하여, pM 내지 nM을 검출할 수 있는 검출가능 범위가 조율가능하다.
광범위한 관점에 따르면, 본 발명은 i) 본원에 기술된 바와 같은 센서와 샘플을 접촉시키는 단계; ii) 센서를 에너지원으로 여기시키는 단계; 및 iii) 방출된 시그널의 강도를 측정하여 샘플에 표적 실체가 존재하는지를 측정하는 단계를 포함하여, 표적 실체가 샘플에 존재하는지를 측정하는 방법을 제공한다.
특정 양태에 따르면, 에너지원은 표면플라스몬공명(SPR)을 사용하여 측정한다.
특정 양태에 따르면, 이 방법은 반응 시간이 1분 미만이다. 특정 양태에 따르면, 이 방법은 대략 상온에서 반응 시간이 1분 미만이다.
다른 광범위한 관점에 따르면, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 센서; 및 이 센서를 함유하고 샘플이 첨가될 수 있는 적어도 하나의 용기를 함유하는, 표적 실체를 검출하기 위한 키트를 제공한다.
다른 광범위한 관점에 따르면, 본 발명은 i) 자가-조립 단층(SAM) 링커를 기재에 고정시키는 단계; 및 ii) 이 SAM 링커에 아민-종결된 압타머를 고정시키는 단계를 포함하는, 센서 제조방법을 제공한다.
다른 광범위한 관점에 따르면, 본 발명은 i) 자가-조립 단층(SAM) 링커로 기재를 작용기화하는 단계; ii) 단계 i)의 작용기화된 기재를 아민 모이어티가 SAM 링커에 고정화되기에 충분한 아민 모이어티를 보유하는 조성물에 노출시키는 단계; iii) 단계 ii)의 아민-작용기화된 기재를, 압타머가 아민 모이어티에 고정화되기에 충분한 적어도 하나의 압타머에 노출시키는 단계; (iv) 경우에 따라, 비-특이적으로 고정화된 압타머를 제거하는 단계; 및 v) 단계 iii) 또는 iv)의 아민-종결된 압타머 작용기화된 기재를, 아민 모이어티에 의해 활성화된 비-점유(non-occupied) SAM 부위를 차단하기에 충분한 차단제에 노출시키는 단계를 포함하는, 센서 제조방법을 제공한다.
특정 양태에 따르면, 아민 모이어티를 가진 조성물은 N-하이드록시석신이미드(NHS) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 중 하나 이상에 커플링된다.
다른 관점에 따르면, 본 발명은 본원에 기술된 센서를 사용하여 혈액 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.
다른 관점에 따르면, 본 발명은 당뇨병 치료 지침에 적용하기 위한 당화된 단백질의 초민감적이며 선택적인 검출 및 측정을 하기 위한 방법을 제공한다. 특별한 한 양태에 따르면, 이 방법은 표면플라스몬공명 분광법의 사용을 포함한다.
다른 양태에 따르면, 이 작용기화 방법은 라만 및 형광 분광분석을 비롯한 다른 감지 방식에 적용할 수 있고, 기존 모니터링 기술의 성능을 더욱 향상시키는 데에도 사용할 수 있다.
다른 관점에 따르면, 본 발명은 혈액 단백질의 특정 당화된 형태를 표적화하기 위해 압타머의 시험관내 선택을 최적화하는 방법을 제공한다. 한 양태에 따르면, 표면 작용기화 방법은 표적 특징을 기반으로 하여 감도 및 선택성을 최적화하기 위해 사용한다.
다른 관점에 따르면, 본 발명은 조사 중인 샘플에 존재할 수 있는 혼재성 물질의 영향을 더욱 감소시키기 위한 방법을 제공한다.
또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 기존의 대형 임상 기구와 유사한 성능을 달성할 수 있는, 튼튼하고 저가인 휴대용 감지 플랫폼을 제공한다. 또한, 통합 플랫폼은 인슐린 의존성 당뇨병 치료법에 따라 평가할 수 있는 진단 장치에 유용하다. 통합 플랫폼은 의사 사무실이나 가정 환경에서 사용될 수 있는 저가의 휴대용 장치를 가능케 한다. 또한, 통합 플랫폼은 수집된 데이터의 즉시 분석을 제공하여, 의료진 및/또는 환자가 환자의 장기간 글루코오스 조절 순응도(compliance)를 평가할 수 있게 한다.
다른 광범위한 관점에 따르면, 본 발명은 한정된 부위(예, 당화된 단백질 부위)에 표적화된 압타머를 동정하는 방법으로서, 적어도 제1 라운드의 SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential) 농축 프로토콜에 비-표적 후보(예, 비-당화 후보)를 도입시키는 단계, 및 이 비-표적 후보를 적어도 제2 라운드의 SELEX 프로토콜에 도입시켜 당화 및 비-당화 단백질 형태 모두에 친화성이 있는 압타머 후보를 제거하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 광범위한 관점에 따르면, 본 발명은 표적 및/또는 압타머 특징을 기반으로 하여 감도 및/또는 선택성을 최적화하는 표면 작용기화 방법으로서, 바람직한 결합 간격 및/또는 길이를 가진 결합을 사용하는 이중 자가-조립 단층(SAM) 형성 과정을 사용하는 것을 포함하고, 이때 결합 간격 및/또는 길이 중 적어도 하나는 표적 및/또는 압타머 특성을 기반으로 한 표면플라스몬공명(SPR) 감도 및 선택성을 최적화하도록 선택되는 것인 방법을 제공한다.
다른 관점에 따르면, 본 발명은 1 이상의 피분석물에 대한 센서의 감도 및/또는 선택성을 최적화하는 방법으로서, 1종 이상의 압타머를, 기재 상에 작용기화된 표면을 형성하기에 바람직한 결합 간격 및/또는 길이를 가진 자가-조립 단층(SAM) 결합을 이용하여 기재에 결합시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 바람직한 결합 간격 및/또는 길이는 피분석물 및/또는 압타머 특성을 기반으로 하여 표면 플라스몬 공명(SPR), 라만 분광분석법 또는 형광 분광분석법의 감도 및 선택성 중 적어도 하나를 최적화하도록 선택할 수 있다.
특정 양태에 따르면, SAM 결합의 적어도 하나의 패킹 밀도 및/또는 길이는 표면플라스몬 공명(SPR) 시그널에 영향을 미친다.
특정 양태에 따르면, 결합은 이원성 SAM 및 환원적 탈착 공정(reductive desorption process)을 통한 결합이다.
특정 양태에 따르면, 탈착 공정은 작용기화된 기재 상에 단백질의 비-특이적 흡착을 방지하기 위해 단백질 흡착에 저항성인 물질에 기재의 작용기화된 표면을 노출시키는 것을 포함한다.
특정 양태에 따르면, 단백질 흡착 저항성 물질은 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)이다.
특정 양태에 따르면, SAM 결합은 티올 SAM 고정화 방법을 사용하는 것을 포함하고, 이때 티올 화합물은 압타머와 안정한 결합을 형성할 수 있는 카르복시 모이어티를 보유한다.
특정 양태에 따르면, 티올 화합물은 디티오비스-N-석신이미딜 프로피오네이트(DTSP)를 함유한다.
특정 양태에 따르면, SAM 결합은 디티오비스-N-석신이미딜 프로피오네이트(DTSP) 및 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)을 사용하여 형성되며, 이때 PEG3은 단백질의 비특이적 흡착을 방해하고, DTSP 상의 카르복시 모이어티는 압타머와 안정한 결합을 형성한다.
특정 양태에 따르면, 이원성 SAM 티올 용액은 SAM 결합에 사용된다.
특정 양태에 따르면, 이원성 SAM 티올 용액은 이원성 SAM의 총 농도를 약 1mM로 유지하면서, 3-머캅토프로피온산(MPA)과 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)의 1mM 에탄올 용액들을 혼합하여 제조한다.
특정 양태에 따르면, MPA 및 PEG3은 약 20:80, 약 50:50 또는 약 80:20의 비로 존재한다.
특정 양태에 따르면, 이 방법은 추가로 MPA를 환원적 탈착에 의해 제거하고 PEG3을 본래(intact) 상태대로 잔류시키는 단계; 및 디티오비스-N-석신이미딜 프로피오네이트(DTSP)를 압타머 상의 아미노 기와 공유 결합하게 하여, 압타머는 DTSP에만 부착하게 하고, 반면 PEG3은 어떠한 결합도 형성하지 않는 단계를 포함한다.
특정 양태에 따르면, 압타머는 MPA 상에 고정될 수 있는 아민-변형 압타머를 함유한다.
특정 양태에 따르면, 표면은 약 5nM 내지 약 1000nM 범위에서 최적 동력(dynamic)을 나타낸다.
특정 양태에 따르면, 센서는 혼합 길이의 스페이서 층을 포함한다.
특정 양태에 따르면, 혼합 길이 층은 3-머캅토프로피온산(MPA)과 조합된 11-머캅토운데칸산(MUA)을 포함한다.
특정 양태에 따르면, 자가-조립 단층(SAM)을 형성하기 위해 표면에 직접 결합할 수 있는 수용성 티올-함유 아미노산이 사용된다. 특정 양태에 따르면, 아미노산은 시스테인을 함유한다.
다른 관점에 따르면, 1 이상의 피분석물에 대한 센서를 제조하는 방법으로서, 3-머캅토프로피온산(MPA) 및 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)로 이루어진 이원성 성분을 기재 위에 흡착시키는 단계; 단계 a)의 기재로부터 MPA를 환원적으로 탈착시키는 단계; 단계 b)의 기재를 DTSP 용액에 침지시켜 기재 위에 DTSP 층을 형성시키는 단계; 단계 c)의 기재 위에 적어도 1종의 압타머를 고정시키는 단계; 및 단계 d)의 기재 상의 PEG3으로부터 미결합된 압타머를 제거하고, 기재의 DTSP 층에 부착된 압타머를 남기는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
다른 관점에 따르면, 1 이상의 피분석물에 대한 센서를 제조하는 방법으로서, 3-머캅토프로피온산(MPA) 및 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)로 이루어진 이원성 성분을 에탄올 용액에서 금 표면 기재 위에 흡착시키는 단계; 0.5M KOH 용액에서 기재로부터 MPA를 환원적으로 탈착시키되, 이때 MPA와 PEG3의 상-분리된 이원성 자가-조립 단층(SAM)에서 흡착된 MPA는 용액에 -1.2V의 전위를 30분 동안 가함으로써 선택적으로 환원시키는 단계; 상부에 PEG3 층을 보유한 기재를 1mM DTSP 용액에 침지시켜 기재 위에 DTSP 층을 형성시키는 단계; 기재 위에 적어도 1종의 압타머를 고정시키는 단계; 및 기재의 DTSP 층에 부착된 압타머는 그대로 두고, 기재 위의 PEG3으로부터 압타머를 제거하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
특정 양태에 따르면, 기재는 금 표면을 보유한다.
특정 양태에 따르면, 피분석물은 혈액 또는 혈청 중의 단백질의 당화된 형태(glycated form)를 함유한다.
특정 양태에 따르면, 이 방법은 총 혈청 단백질 수준으로부터 특정 당화 단백질의 분획을 측정하는 단계를 포함한다.
특정 양태에 따르면, 피분석물은 사람 헤모글로빈, 알부민, 예컨대 사람 혈청 알부민(HSA), 면역글로불린 G(IgG), 면역글로불린 M(IgM), 피브리노겐 및/또는 이의 단편의 1 이상의 비-당화된 형태 및/또는 당화된 형태를 포함한다.
특정 양태에 따르면, 피분석물은 적어도 제2 피분석물과 반감기가 다른 적어도 제1 피분석물을 함유하고, 이 방법은 추가로 제1 및 제2 피분석물을 정량분석하여 1 이상 시간 기간 동안 제1 및 제2 피분석물의 수준에 관한 후향적(retrospective) 판단을 제공하는 단계를 포함한다.
특정 양태에 따르면, 제1 피분석물은 헤모글로빈을 포함하고, 제2 피분석물은 IgM을 포함한다.
특정 양태에 따르면, 피분석물은 적어도 제1 피분석물, 적어도 제2 피분석물 및 적어도 제3 피분석물을 함유하고, 이 제1, 제2 및 제3 피분석물들은 각각 반감기가 다르고, 이 방법은 추가로 제1, 제2 및 제3 피분석물을 정량분석하여 1 이상의 시간 기간 동안 제1, 제2 및 제3 피분석물의 수준에 관한 후향적 판단을 제공하는 단계를 포함한다.
특정 양태에 따르면, 제1 피분석물은 헤모글로빈을 함유하고, 제2 피분석물은 IgM을 함유하며, 제3 피분석물은 알부민을 함유한다.
특정 양태에 따르면, 이 방법은 과거 평균 글루코오스 수준을 모니터링하는데 유용하며, 이 방법은 본원에 기술된 방법으로 형성된 센서를 혈액 샘플과 접촉시키는 단계; 혈액에 존재하는 단백질의 당화된 형태의 양을 측정하는 단계; 및 당화된 형태로 혈액 샘플에 존재하는 단백질의 양을 주어진 시간 틀 동안 대조 글루코오스 수준과 상관관계를 입증하는 단계를 포함한다.
특정 양태에 따르면, 단백질의 당화된 형태의 양은 표면플라스몬공명(SPR)을 사용하여 측정한다.
다른 관점에 따르면, 1 이상의 피분석물의 존재를 검출하기 센서로서, 본원에 기술된 어느 한 방법에 의해 제조되는 센서가 제공된다.
특정 양태에 따르면, 압타머는 특정 피분석물과 상호작용할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정 양태에 따르면, 센서는 큰 생체분자, 작은 생체분자, 유기 분자, 소분자, 핵산, 금속 이온, 단백질, 효소, 펩타이드, 약물, 염료, 암세포, 바이러스, 호르몬 또는 미생물 중에서 선택되는 1 이상의 피분석물과 상호작용할 수 있다.
특정 양태에 따르면, 피분석물은 생물학적 샘플, 환경 샘플, 화학적 샘플, 약학적 샘플, 식품 샘플, 농업적 샘플 및 수의학적 샘플 중 하나 이상이다.
특정 양태에 따르면, 단백질은 혈액 단백질이다.
특정 양태에 따르면, 센서는 링커 특성을 기반으로 하여, pM 내지 nM을 검출할 수 있는 조율가능한 검출성 범위를 나타낸다.
특정 양태에 따르면, 센서는 반응 시간이 1분 미만이다.
특정 양태에 따르면, 센서는 대략 실온에서 반응 시간이 1분 미만이다.
다른 관점에 따르면, 본원에 기술된 센서 및 이 센서를 함유하고 샘플이 첨가될 수 있는 1 이상의 용기를 함유하는, 1 이상의 피분석물을 검출하기 위한 키트가 제공된다.
다른 관점에 따르면, 샘플에 존재할 수 있는 적어도 하나의 혼재성 물질의 효과를 감소시키는 방법으로서, 기재 위의 비-결합 위치에 1 이상의 친수성 기를 혼재성 물질의 비특이적 흡착을 실질적으로 감소시키거나/방지하기에 충분하게 혼입시키는 단계, 이 기재에 압타머를 자가-조립 단층(SAM) 결합을 이용하여 결합시키되, 이 SAM 결합은 기재 위에 작용기화된 표면을 형성시키기 위해 바람직한 결합 간격 및/또는 길이을 보유하는 단계, 및 압타머 결합 반응을 정상 SPR 검출 한계 이상의 이격 거리에서 SPR 센서로 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한, 표면 플라스몬 공명(SPR) 분광분석 및 주문 개발된 압타머-기반의 작용기화된 센서 표면을 이용하여 검사 환경에서 1 이상의 표적 분자 또는 이의 단편을 검출 및/또는 정량하는 방법이 기술된다. 이 방법은 다양한 범위의 반감기를 가진 상기 분자들, 예컨대 헤모글로빈보다 짧은 반감기를 가진 표적 분자 등(이에 국한되지 않음)을 검출 및/또는 측정할 수 있도록 한다. 또한, 이 방법은 형광 염료와 같은 태그(tag) 또는 라벨(label), 또는 광가교를 사용함이 없이 수행할 수 있다. 또한, 이 방법은 샘플 소비가 적고, 반응 시간이 빨라서(일반적으로 수초), 혈당 순응도(glycemic compliance)를 평가하는 이용분야에 유용성이 있다.
다른 관점에 따르면, 기재에 작용기화된 표면을 형성하기에 바람직한 결합 간격 및/또는 길이를 가진 자가-조립 단층(SAM) 결합으로 기재에 결합된 1종 이상의 압타머를 함유하되, 상기 바람직한 결합 간격 및/또는 길이는 표면 플라스몬 공명(SPR), 라만 분광법 또는 형광 분광법 감도 및 선택성 중 적어도 하나를 피분석물 및/또는 압타머 특성에 기초하여 최적화하도록 선택되는, 센서가 제공된다.
특정 양태에 따르면, SAM 결합의 적어도 하나의 패킹 밀도 및/또는 길이는 표면 플라스몬 공명(SPR) 시그널에 영향을 미친다.
특정 양태에 따르면, 결합은 이원성 SAM과 환원적 탈착 공정을 통해서 이루어진다.
특정 양태에 따르면, 기재의 작용기화된 표면은 이 작용기화된 표면에 비특이적 단백질 흡착을 억제하기에 충분한 단백질 흡착 저항성 물질에 노출된 것이다.
특정 양태에 따르면, 단백질 흡착 저항성 물질은 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)을 함유한다.
SAM 결합은 압타머와 안정한 결합을 형성할 수 있는 카르복시 모이어티를 가진 티올 화합물을 함유한다.
특정 양태에 따르면, 티올 화합물은 티디오비스-N-석신이미딜 프로피오네이트(DTSP)를 함유한다.
특정 양태에 따르면, SAM 결합은 디티오비스-N-석신이미딜 프로피오네이트(DTSP) 및 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)을 사용하여 형성되며, 이 PEG3은 단백질의 비특이적 흡착을 방지하고, DTSP 상의 카르복시 모이어티는 압타머와 안정한 결합을 형성한다.
특정 양태에 따르면, 이원성 SAM 티올 용액은 SAM 결합에 사용된다.
특정 양태에 따르면, 이원성 SAM 티올 용액은 이원성 SAM의 총 농도를 약 1mM로 유지시키면서 3-머캅토프로피온산(MPA) 및 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)의 1mM 에탄올 용액들을 혼합하여 제조한다.
특정 양태에 따르면, MPA와 PEG3은 약 20:80, 약 50:50 또는 약 80:20의 비로 존재한다.
특정 양태에 따르면, PEG3은 본래 상태로 잔류시키면서 MPA는 환원적 탈착에 의해 제거되었고; 디티오비스-N-석신이미딜 프로피오네이트(DTSP)는 압타머 상의 아미노 기와 결합되었고, PEG3은 어떠한 결합도 형성하지 않는다.
특정 양태에 따르면, 압타머는 3-머캅토프로피온산(MPA) 위에 고정될 수 있는 아민-변형 압타머를 함유한다.
특정 양태에 따르면, 표면은 약 5nM 내지 약 1000nM 범위에서 최적 동력(dynamic)을 나타낸다.
특정 양태에 따르면, 센서는 혼합 길이 스페이서 층을 포함한다.
특정 양태에 따르면, 혼합 길이 층은 3-머캅토프로피온산(MPA)과 조합된 11-머캅토운데칸산(MUA)을 함유한다.
특정 양태에 따르면, SAM 결합은 기재의 표면에 직접 결합할 수 있는 수용성 티올-함유 아미노산을 함유한다.
특정 양태에 따르면, 아미노산은 시스테인을 함유한다.
다른 관점에 따르면, 최소한 기재의 표면이 금인 센서가 제공된다.
특정 양태에 따르면, 이 센서는 혈중 단백질의 당화된 형태로 이루어진 피분석물을 감지하도록 구성된다.
특정 양태에 따르면, 이 센서는 총 혈청 단백질 수준으로부터 특정 당화 단백질의 분율을 측정하도록 구성된다.
특정 양태에 따르면, 피분석물은 사람 헤모글로빈, 알부민, 예컨대 사람 혈청 알부민(HSA), 면역글로불린 G(IgG), 면역글로불린 M(IgM), 피브리노겐, 및/또는 이의 단편 중 하나 이상을 함유하고, 이 피분석물은 당화된 형태 또는 비-당화된 형태이다.
특정 양태에 따르면, 피분석물은 적어도 제2 피분석물과 다른 반감기를 가진 적어도 제1 피분석물을 함유한다.
특정 양태에 따르면, 제1 피분석물은 헤모글로빈을 함유하고, 제2 피분석물은 면역글로불린 M(IgM)을 함유하며; 제1 피분석물과 제2 피분석물 중 어느 하나는 당화된 형태 또는 비-당화된 형태로 존재한다.
특정 양태에 따르면, 피분석물은 적어도 제1 피분석물, 적어도 제2 피분석물 및 적어도 제3 피분석물을 함유하고, 이 제1, 제2 및 제3 피분석물은 각각 반감기가 다른 것이다.
특정 양태에 따르면, 제1 피분석물은 헤모글로빈을 함유하고, 제2 피분석물은 IgM을 함유하며, 제3 피분석물은 알부민을 함유하고; 이러한 제1 피분석물, 제2 피분석물 또는 제3 피분석물 중 하나 이상은 당화된 형태 또는 비-당화된 형태로 존재한다.
다른 관점에 따르면, 본원에 기술된 방법에 의해 형성된 센서를 혈액 샘플과 접촉시키고; 혈중 피분석물의 당화된 형태의 양을 측정하며; 혈액 샘플 피분석물에 존재하는 당화된 형태의 피분석물의 양을 주어진 시간 틀(time frame) 동안 대조군 수준과 상관관계를 입증하여, 과거 평균 혈액 피분석물 수준을 모니터하는데 사용되는, 본원에 기술된 센서들 중 어느 하나의 용도가 제공된다.
특정 양태에 따르면, 단백질의 당화된 형태의 양은 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 측정한다.
특정 양태에 따르면, 압타머는 특정 피분석물과 상호작용할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정 양태에 따르면, 센서는 큰 생체분자, 작은 생체분자, 유기 분자, 소분자, 핵산, 금속 이온, 단백질, 효소, 펩타이드, 약물, 염료, 암 세포, 바이러스, 호르몬 또는 미생물 중에서 선택되는 1 이상의 피분석물과 상호작용할 수 있다.
특정 양태에 따르면, 피분석물은 생물학적 샘플, 환경적 샘플, 화학적 샘플, 약학적 샘플, 식품 샘플, 농업적 샘플 및 수의학적 샘플 중 하나 이상이다.
특정 양태에 따르면, 피분석물은 혈액 단백질이다.
특정 양태에 따르면, 센서는 링커 특성을 기반으로 하여, pM 내지 nM을 검출할 수 있는 조율가능한 검출성 범위가 있다.
특정 양태에 따르면, 센서는 반응 시간이 1분 미만인 것이다.
특정 양태에 따르면, 센서는 대략 주위 온도에서 반응 시간이 1분 미만인 것이다.
특정 양태에 따르면, 센서는 서열 번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15 중 어느 하나의 전체 서열과 동일성이 70% 이상인 DNA 서열을 함유하는 압타머를 포함한다.
다른 관점에 따르면, 본원에 기술된 어느 하나 이상의 센서; 및 이 센서를 포함하는 적어도 하나의 용기를 함유하고, 이 용기에 샘플이 첨가될 수 있는, 1 이상의 피분석물을 검출하기 위한 키트가 제공된다.
특정 양태에 따르면, 이 키트는 추가로 1 이상의 고체 지지체를 함유하고, 용출액(elute)으로부터 센서를 분리하기 위한 1 이상의 분리제, 및 센서로부터 압타머를 분리하기 위한 1 이상의 시약을 함유한다.
다른 관점에 따르면, 단일 표적 부위 결합 압타머와 비-표적 단백질 결합 압타머를 보유한 핵산 푸울(pool)로부터 단일 표적 부위 결합 압타머를 동정하는 방법으로서,
a) 상기 핵산 푸울에 단일 부위 표적 단백질 복합체를 첨가하여, 이 푸울에 존재하는 단일 표적 부위 결합 압타머와 비-표적 단백질 결합 압타머 모두를 단일 부위 표적 단백질 복합체에 결합시키고 단일 표적 부위 결합 압타머 + 비-표적 단백질 결합 압타머 + 단일 부위 표적 단백질 복합체를 형성시키는 단계;
b) 단일 표적 부위 결합 압타머 + 비-표적 단백질 결합 압타머 + 단일 부위 표적 단백질 복합체를 푸울로부터 분리하는 단계;
c) 단일 부위 표적 단백질 복합체로부터 단일 표적 부위 결합 압타머와 비-표적 단백질 결합 압타머를 용출시키는 단계;
d) 상기 단계의 용출액에 비-표적 단백질 복합체를 첨가하여, 단계 c)의 용출액에 존재하는 비-표적 단백질 결합 압타머를 비-표적 단백질 복합체에 결합시키고 비-표적 단백질 결합 압타머 + 비-표적 단백질 복합체를 형성시키는 단계;
e) 앞 단계의 용출액으로부터 비-표적 단백질 결합 압타머 + 비-표적 단백질-복합체를 분리해내고, 용출액에 단일 표적 부위 결합 압타머를 잔류시키는 단계; 및
f) 용출액으로부터 단일 표적 부위 결합 압타머를 분리하고; 경우에 따라 추가로 이 단일 표적 부위 결합 압타머를 증폭시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
특정 양태에 따르면, 단일 표적 부위 결합 압타머는 헤모글로빈, 면역글로불린 G(IgG), 면역글로불린 M(IgM) 및 알부민 중 하나를 선택하는데 사용된다.
특정 양태에 따르면, 단일 표적 부위 결합 압타머는 서열 번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15 중에서 선택된다.
특정 양태에 따르면, 단일 부위 표적 단백질은 고체 지지체 상에 고정된다.
특정 양태에 따르면, 비-표적 단백질 복합체는 고체 지지체 상에 고정된다.
특정 양태에 따르면, 고체 지지체는 자성 비드, 크로마토그래픽 매트릭스, 미량역가 접시 또는 어레이를 포함한다.
다른 관점에 따르면, 당화된 헤모글로빈에 결합하고, 서열번호 4 및 5로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열을 함유하는 압타머가 제공된다.
특정 양태에 따르면, 당화된 헤모글로빈은 사람 헤모글로빈이다.
특정 양태에 따르면, 압타머는 사람 헤모글로빈에 대한 해리 상수가 100nM 이하인 것이다.
다른 관점에 따르면, 당화된 헤모글로빈에 결합하고 서열번호 4 및 5로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열 및 5'-링커와 3'-링커 중 하나 이상을 함유하는, 본원에 기술된 압타머가 제공된다.
특정 양태에 따르면, 링커는 자가-조립 단층(SAM)이다.
다른 관점에 따르면, 서열번호 4 및 5 중 어느 하나의 전체 서열과 70% 이상의 동일성이 있고 사람 당화된 헤모글로빈에 결합하는 압타머가 제공된다.
다른 관점에 따르면, 당화된 헤모글로빈의 영역에 특이적으로 결합할 수 있고 서열번호 4 및 5로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 핵산 압타머 분자에 접합된 자가-조립 단층(SAM)을 함유하는 당해의 조성물이 제공된다.
다른 관점에 따르면, 비-당화된 헤모글로빈에 결합하고, 서열번호 6 및 7로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열을 함유하는 압타머가 제공된다.
특정 양태에 따르면, 비-당화된 헤모글로빈은 사람 헤모글로빈이다.
특정 양태에 따르면, 압타머는 사람 헤모글로빈에 대한 해리 상수가 100nM 이하인 것이다.
다른 관점에 따르면, 비-당화된 헤모글로빈에 결합하고 서열번호 6 및 7로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열과 5'-링커 및 3'-링커 중 하나 이상을 함유하는 압타머가 제공된다.
특정 양태에 따르면, 링커는 자가-조립 단층(SAM)이다.
다른 관점에 따르면, 서열번호 6 및 7 중 어느 하나의 전체 서열과 70% 이상의 동일성이 있고 사람 비-당화된 헤모글로빈에 결합하는 압타머가 제공된다.
다른 관점에 따르면, 비-당화된 헤모글로빈의 영역에 특이적으로 결합할 수 있고 서열번호 6 및 7로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 핵산 압타머 분자에 접합된 자가-조립 단층(SAM)을 함유하는 당해의 조성물이 제공된다.
다른 관점에 따르면, 당화된 혈청 알부민에 결합하고, 서열번호 3, 8 및 9로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열을 함유하는 압타머가 제공된다.
특정 양태에 따르면, 당화된 혈청 알부민은 사람 당화된 혈청 알부민이다.
특정 양태에 따르면, 압타머는 사람 당화된 혈청 알부민에 대한 해리 상수가 100nM 이하인 것이다.
다른 관점에 따르면, 당화된 혈청 알부민에 결합하고 서열번호 3, 8 및 9로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열과 5'-링커 및 3'-링커 중 하나 이상을 함유하는 압타머가 제공된다.
특정 양태에 따르면, 링커는 자가-조립 단층(SAM)이다.
다른 관점에 따르면, 서열번호 3, 8 및 9 중 어느 하나의 전체 서열과 70% 이상의 동일성이 있고 사람 당화된 혈청 알부민에 결합하는 압타머가 제공된다.
다른 관점에 따르면, 당화된 혈청 알부민의 영역에 특이적으로 결합할 수 있고 서열번호 3, 8 및 9로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 핵산 압타머 분자에 접합된 자가-조립 단층(SAM)을 함유하는 당해의 조성물이 제공된다.
다른 관점에 따르면, 비-당화된 혈청 알부민에 결합하고, 서열번호 10, 11, 12, 13, 14 및 15로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열을 함유하는 압타머가 제공된다.
특정 양태에 따르면, 비-당화된 혈청 알부민은 사람 당화된 혈청 알부민이다.
특정 양태에 따르면, 압타머는 사람 비-당화된 혈청 알부민에 대한 해리 상수가 100nM 이하인 것이다.
다른 관점에 따르면, 비-당화된 혈청 알부민에 결합하고 서열번호 10, 11, 12, 13, 14 및 15로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열과 5'-링커 및 3'-링커 중 하나 이상을 함유하는 압타머가 제공된다.
특정 양태에 따르면, 링커는 자가-조립 단층(SAM)이다.
다른 관점에 따르면, 서열번호 10, 11, 12, 13, 14 및 15 중 어느 하나의 전체 서열과 70% 이상의 동일성이 있고 사람 비-당화된 혈청 알부민에 결합하는 압타머가 제공된다.
다른 관점에 따르면, 비-당화된 혈청 알부민의 영역에 특이적으로 결합할 수 있고 서열번호 10, 11, 12, 13, 14 및 15로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 핵산 압타머 분자에 접합된 자가-조립 단층(SAM)을 함유하는 당해의 조성물이 제공된다.
특정 양태에 따르면, 압타머는 적어도 하나의 화학적 변형을 함유한다.
특정 양태에 따르면, 변형은 당 위치에서의 화학적 치환, 뉴클레오타이드간 결합에서의 화학적 치환 및 염기 위치에서의 화학적 치환으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
다른 관점에 따르면, 본원에 기술된 유효량의 압타머, 또는 이의 염 및 이에 대한 지지체를 함유하는 검사 시약이 제공된다.
다른 관점에 따르면, 본원에 기술된 적어도 하나의 압타머를 함유하는 키트가 제공된다.
특정 양태에 따르면, 압타머는 PEG화된다.
특정 양태에 따르면, PEG화된 압타머 분자는 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)을 포함한다.
특정 양태에 따르면, SAM 결합은 디티오비스-N-석신이미딜 프로피오네이트(DTSP)와 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)에 의해 형성된다.
특정 양태에 따르면, 압타머는 적어도 하나의 화학적 변형을 함유한다.
특정 양태에 따르면, 변형은 당 위치에서의 화학적 치환, 뉴클레오타이드간 결합에서의 화학적 치환 및 염기 위치에서의 화학적 치환으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
본원에 기술된 유효량의 1 이상의 압타머 또는 이의 염 및 이에 대한 지지체를 함유하는 검사 시약.
본원에 기술된 1 이상의 압타머를 함유하는 키트.
다른 관점에 따르면, 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 정제 및 분리된 비-자연 발생의 DNA 서열이 제공된다.
다른 관점에 따르면, 샘플에 존재할 수 있는 적어도 하나의 혼재성 물질의 효과를 감소시키는 방법으로서, a) 기재 위의 비-결합 위치에 1 이상의 친수성 기를, 혼재성 물질의 비특이적 흡착을 실질적으로 감소시키거나/방지하기에 충분하게 혼입시키는 단계, b) 이 기재에 압타머를 자가-조립 단층(SAM) 결합으로 결합시키되, 이 SAM 결합은 기재 위에 작용기화된 표면을 형성시키기 위해 바람직한 결합 간격 및/또는 길이인 단계, 및 c) 압타머 결합 반응을 정상 SPR 검출 한계를 넘는 이격 거리에서 SPR 센서로 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 시스템, 방법, 특징 및 이점은 이하 도면 및 상세한 설명의 검토 후 당업자에게 자명하거나 자명해질 것이다. 이러한 추가적인 시스템, 방법, 특징 및 이점은 모두 본 명세서에 포함되고, 본 발명의 영역에 포함되며, 후속 특허청구범위에 의해 보호되는 것으로 생각되어야 한다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 1 이상의 도면 및/또는 1 이상의 사진을 함유할 수 있다. 이러한 특허 또는 특허 출원 공보의 사본과 컬러 도면(들) 및/또는 사진(들)은 특허청에 청구서와 필요 비용을 납부하여 제공할 것이다.
도 1: 감지성 표면 작용기화 방법의 모식도.
도 2: 5mM Fe(CN)6 3-/Fe(CN)4-을 함유하는 100mM PB 용액(pH 7.2)에서 수득된 임피던스 스펙트럼의 극좌표선도(Nyquist plot). (컬럼 A) 기본(Bare) Au; (컬럼 B) Au/MPA/EDC-NHS/EA/PPA; (컬럼 C) Au/MPA/EDC-NHS/EA/PPA/APT1. 우측 플롯은 각 층의 (Ret)를 나타낸 것이다. 임피던스 스펙트럼은 5mV rms의 퍼텐셜 진폭 및 10 포인트/decade 하에 0.1Hz 내지 100kHz의 주파수 범위에서 수집했다.
도 3: 자성 비드 커플링 방법에 의한 압타머/트롬빈 결합 비(mol)를 보여주는 그래프.
도 4: 기본 Au와 압타머-변형 센서의 SPR 반응을 보여주는 그래프. 모든 데이터 포인트는 3회의 실험 데이터 판독값으로부터 평균을 낸 것이다. 샘플은 트롬빈(상단 플롯) 및 트롬빈과 400nM BSA(하단 플롯)이다. 인레이 플롯은 동일 데이터를 로그 비율로 플롯팅하여 더 낮은 농도에서의 가시성을 향상시킨 것이다.
도 5: 400nM BSA(BSA 그룹), 500nM 트롬빈(트롬빈 그룹), 및 500nM 트롬빈+400nM BSA(트롬빈+BSA 그룹)에 대한 여러 감지 표면들의 SPR 반응을 도시한 그래프. 오차 막대는 3개의 갓 제조한 샘플들에서 측정된 값의 표준편차이다.
도 6: 400nM BSA 존재 및 부재 하에 50nM, 250nM, 500nM 트롬빈에 대한 여러 감지 표면들의 SPR 반응을 도시한 그래프. 상부 축(APT1), 하부 축(APT2); 하부 축의 0 위치는 중첩될 데이터 점들을 서로 더 잘 구별하기 위해 의도적으로 이동시켰다.
도 7: 여기된 표면 플라스몬의 모식도.
도 8a: 크레취만 구성(Kretchmann configuration)으로 나타낸 SPR의 모식도.
도 8b: 굴절률의 변화로 인한 공명각 이동의 모식도.
도 9: SPR 감지 표면에 부착된 SAM 표면에 고정된 압타머와 HbA1c의 결합성을 도시한 모식도(위); 및 굴절률의 변화로 인한 공명각의 이동을 나타낸 모식도(아래).
도 10: 여러 당화 수준(% 비; 당화 단백질/총 단백질)에서 HSA에 대한 SPR 반응을 도시한 그래프. 주: 각 샘플의 총 단백질 농도는 1㎍/ml 총 단백질 수준으로 일정하다. (녹색) 압타머 작용기화된 표면 (적색) 기본-Au 표면.
도 11a 내지 11e: DTSP-PEG3 이원성 SAM 형성을 위한 환원적 탈착의 모식도: (도 11a) Au 위에 MPA와 PEG3의 공동흡착; (도 11b) MPA의 환원적 탈착; (도 11c) DTSP의 흡착; (도 11d) 압타머 고정화; 및 (도 11e) PEG3으로부터 압타머 제거.
도 12: SELEX 과정에 있어서 MB 역선택(counter selection)의 모식도.
본 명세서 전반에서, 각종 공보, 특허 및 특허 공개 명세서는 식별 인용구로 언급되어 있다. 이 공보, 특허 및 특허 공개 명세서는 본 명세서에 참고 인용되어 본 발명이 속하는 기술 상태를 더욱 충분하게 설명하려 한다.
정의
본 명세서에 인용된 모든 공보, 공개된 특허 서류 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 당업계의 기술 수준을 나타낸다. 본원에 인용된 모든 공보, 공개된 특허 서류 및 특허 출원은 각각의 개별 공보, 공개된 특허 서류 또는 특허 출원이 특이적이고 개별적으로 참고 인용된 것처럼 표시되었지만, 동일한 정도로 참고 인용된 것이다.
특허청구범위를 비롯한 본 명세서에 사용된, 단수적 표현은 다른 분명한 표시가 없는 한 복수의 표현을 포함하며, "적어도 하나" 및 "하나 이상"과 호환 사용된다. 즉, 예컨대 "압타머"에 대한 언급은 압타머의 혼합물을 포함하고, "핵산"에 대한 언급은 핵산 혼합물을 포함한다.
본원에 사용된 "약"이란 수치 값이 관련된 아이템의 기본적 기능이 변화되지 않을 정도로 수치 값의 사소한 변형 또는 변경을 나타낸다.
본원에 사용된 "함유한다", "함유하는", "포함한다", "포함하는", "내포한다", "내포하는" 및 이의 임의의 변형은 비-배타적 내포를 포함하려는 것으로, 구성부재 또는 일련의 구성부재를 함유하거나, 포함하거나 또는 내포하는 당해의 공정, 방법, 공정에 의한 산물 또는 조성물이 그 구성부재 만을 포함하는 것이 아니라, 이러한 당해의 공정, 방법, 공정에 의한 산물, 또는 조성물에 명백하게 나열되거나 내재되지 않은 다른 구성부재를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "압타머"란 용어는 특정 표적 실체에 결합할 수 있는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자를 나타낸다. 일반적으로, 압타머는 약물 및 염료와 같은 소분자에서부터 효소, 펩타이드 및 단백질과 같은 복잡한 생물학적 분자에 이르기까지 다양한 표적 화합물에 대한 높은 친화성과 선택성으로 인해 항체 모방체(mimics)로서 작용할 수 있는 인공 올리고뉴클레오타이드이다. 통상의 압타머는 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Amplification)라 불리는 시험관내 반복 공정에 의해 랜덤 올리고뉴클레오타이드 라이브러리로부터 특정 표적 분자에 대해 동정될 수 있다. SELEX 공정의 예에 대해서는 본원에 전문이 참고 인용된 미국 특허 5,270,163; 5,475,096; 및 5,567,588을 참조한다.
압타머는 항체와 유사하게 자신의 표적 화합물에 특이적인 수용체로서 작용하는 3D 구조를 형성할 수 있다. 또한, 압타머는 광범위한 pH 및 염 농도에 대한 내성, 열 안정성, 합성 용이성 및 비용 효율성과 같이 항체에 비해 많은 이점이 있다. 압타머의 특이성과 친화성은 항체보다 높지는 않아도 비슷하다. 또한, 압타머는 표적 화합물의 방출을 위해 가역적으로 변성될 수 있어, 압타머를 생물감지 이용분야에 특히 유용한 수용체로 만든다.
예를 들어, 압타머는 다양한 표적에 결합하도록 시험관내 선택의 반복 과정 또는 당업자라면 식별할 수 있는 등가의 기술을 통해 조작된 화학적으로 합성된 펩타이드 및/또는 단일 가닥(ss) 올리고뉴클레오타이드로 구성될 수 있다.
"압타머" 또는 "핵산 리간드"는 특별한 뉴클레오타이드 서열을 가진 핵산 분자의 1 종류 또는 종들의 카피 세트이다. 압타머는 임의의 적당한 수의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. "압타머"는 이러한 1 세트보다 많은 세트의 분자를 의미한다. 다른 압타머는 동일한 수 또는 다른 수의 뉴클레오타이드를 보유할 수 있다. 압타머는 DNA 또는 RNA일 수 있고, 단일 가닥, 이중 가닥일 수 있거나, 또는 이중 가닥 영역을 함유할 수 있다.
압타머와 피분석물 또는 표적 간의 친화성 상호작용은 정도 문제라는 것이 이해되어야 한다. 즉, 압타머의 이의 표적에 대한 "특이적 결합 친화성"은 압타머가 이의 표적에 대해 일반적으로, 이러한 압타머가 혼합물 또는 샘플 내의 다른 비-표적 성분에 결합할 수 있는 것보다 훨씬 높은 정도의 친화성으로 결합한다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "증폭" 또는 "증폭성"이란 용어는 한 분자 또는 한 분자 클래스의 카피의 양 또는 수를 증가시키는 임의의 공정 또는 공정 단계들의 조합을 의미한다.
본원에 사용된 "푸울"은 이로부터 바람직한 리간드가 선택되는 여러 서열을 가진 핵산의 혼합물이다. 푸울의 근원은 자연 발생의 핵산 또는 이의 단편, 화학적으로 합성된 핵산, 효소적으로 합성된 핵산 또는 이러한 기술들의 조합에 의해 제조된 핵산에서 유래할 수 있다. 변형 뉴클레오타이드, 예컨대 검출가능한 라벨, 반응성 기 또는 다른 변형을 가진 뉴클레오타이드는 푸울에 혼입될 수 있다. 특정 양태에 따르면, SELEX 공정 및/또는 본원에 기술된 개량된 SELEX 방법은 푸울을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 푸울은 하나 이상의 공동 구조 모이어티를 가진 핵산을 함유할 수 있어, 핵산들은 화학적, 크기 또는 다른 분리 방법이 아닌 구조별로 분리될 수 있다. 본원에 사용된, 푸울은 때론 "라이브러리" 또는 "후보 또는 핵산 혼합물"이라 지칭되기도 한다. 예를 들어, "RNA 푸울"은 RNA로 구성된 후보 혼합물을 의미한다.
본원에 사용된 "핵산", "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 임의의 길이의 뉴클레오타이드 중합체를 의미하는 것으로 호환 사용되며, 이러한 뉴클레오타이드들은 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드 및/또는 유사체 또는 화학적으로 변형된 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드" 및 "핵산"이란 용어는 3중 나선 분자뿐만 아니라 이중가닥 분자 또는 단일가닥 분자를 포함한다.
본원에 사용된 "센서"란 용어는 물리적 양을 측정하고 이를 관찰자 또는 기구가 판독할 수 있는 시그널로 변환시키는 장치를 가리킨다. 알다시피, 센서는 공지의 표준물질에 대해 조정된다. 따라서, 센서는 표적 실체에 대한 압타머의 친화성을 이용하여 표적 실체를 포획하는데 사용될 수 있고, 본 명세서를 읽은 당업자라면 파악할 수 있는 기술을 사용하여 검출할 수 있다.
본원에 사용된 "검출하다" 또는 "검출"이란 용어는 샘플, 반응 혼합물, 분자 복합체 및 플랫폼과 어레이 같은 기재를 비롯해서, 이에 국한되지 않는 제한된 공간 부위에서의 표적 또는 시그널의 현존, 존재 또는 실제의 측정을 가리킨다. 검출은, 이것이 표적 또는 시그널의 양 또는 비율을 측정하도록 설계된 임의의 분석을 포함하나, 이에 국한되지 않는 표적 또는 시그널의 정량 또는 양의 측정(정량분석이라고도 불림)을 의미하거나, 이에 관한 것이거나 또는 이를 수반하는 경우, "정량적"이다. 검출은 이것이 정량하지 않고 다른 표적 또는 시그널에 비해 상대적 풍부함에 의거하여 표적 또는 시그널의 품질 또는 종류의 파악을 의미하거나, 파악에 관한 것이거나, 또는 파악을 수반하는 경우, "정성적"이다. "광학 검출"은 가시적으로 검출가능한 시그널을 통해 수행되는 검출, 즉 당해의 표적 유래, 또는 그 표적에 부착된 프로브 유래의 스펙트럼 또는 이미지를 가리킨다.
"라벨링제", "라벨" 또는 "검출가능한 모이어티" 또는 "검출가능한 요소" 또는 "검출가능한 성분"이란 용어는 표적 분자/압타머 복합제를 검출하는데 사용될 수 있는 1 이상의 시약을 의미한다. 검출가능한 모이어티 또는 라벨은 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있다.
"표적", "표적 실체" 및 "피분석물"이란 용어는 호환해서 사용할 수 있고, 일반적으로 샘플 내의 존재 또는 부재가 검출되어야 하는 물질, 화합물 또는 성분을 의미한다. 피분석물은 생체분자 및 특히 바이오마커를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 본원에 사용된 "생체분자"란 용어는 생물학적 환경과 관련된 물질, 화합물 또는 성분을 가리키는 것으로, 당, 아미노산, 펩타이드, 단백질, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 유기 분자, 합텐, 에피토프, 생물학적 세포, 생물학적 세포의 일부, 비타민, 호르몬 및 이의 유사물을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. "바이오마커"란 용어는 세포 주기, 건강 및 질환 상태의 단계를 비롯한 이에 국한되지 않는 생물학적 환경의 특정 상태와 관련이 있는 생체분자를 가리킨다. 바이오마커의 존재, 부재, 감소, 상승조절은 특정 상태와 관련이 있고 이 특정 상태를 나타낸다. "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 선형 또는 분지형에 상관없이, 자연적으로 또는 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 이황화 결합 형성, 접합 또는 다른 조작 또는 변형 등과 같은 개입(intervention)에 의해 변형될 수 있거나 변형되지 않을 수 있는 임의의 길이의 아미노산 중합체를 포함하려는 것이다.
"고체 지지체"란 용어는 분자가 공유 또는 비공유 결합을 통해 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있는 표면을 가진 임의의 기재를 의미한다. 기재 물질은 자연 발생 물질, 합성 물질 또는 자연 발생 물질의 변형일 수 있다. 고체 지지체 물질은 자성 비드, 또는 임의의 아미노, 카르복시, 티올 또는 하이드록시 작용 기와 같은 1 이상의 작용기가, 예컨대 표면에 포함되어 있을 수 있는 임의의 다른 물질을 포함할 수 있다. 고체 지지체는 단순한 것부터 복잡한 것까지 임의의 다양한 구성일 수 있고, 수많은 형태, 예컨대 비드, 디스크, 입자, 평판, 막대, 스트립, 튜브, 웰 및 이의 유사물 중 어느 하나일 수 있다. 표면은 비교적 평면형(예, 슬라이드), 구형(예, 비드), 원통형(예, 컬럼) 또는 홈이 진 형(grooved)일 수 있다.
"분리하는"이란 용어는 혼합물의 1 이상의 성분을 혼합물의 다른 성분과 분리하는 임의의 공정을 의미한다. 예를 들어, 표적 분자에 결합된 압타머는 표적 분자에 결합하지 않는 다른 핵산 및 비-표적 분자와 분리할 수 있다. 즉, 분리 공정 또는 단계는 표적 분자에 대한 상대적 친화성 및/또는 해리 속도를 기초로 하여, 후보 혼합물의 전체 핵산을 2 이상의 푸울로 분리시킨다. 따라서, 이 분리 공정은 다양한 방법으로 실행될 수 있다. 예를 들어, 표적 분자가 접합된 자성 비드도 혼합물에서 압타머를 분리하는데 사용할 수 있다. 다른 예로서, 표면플라스몬공명(SPR) 기술은 표적을 센서 칩 위에 고정시키고 이 칩 위로 혼합물을 유동시킴으로써, 표적에 친화성이 있는 핵산은 표적에 결합시키고, 나머지 핵산은 배출시킬 수 있어 혼합물 중의 핵산을 분리하는데 사용할 수 있다.
본원에 사용된 "샘플"이란 용어는 표적 또는 피분석물을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있는 혼합물, 기체 또는 물질을 의미한다. 샘플은 혈액, 가래, 호흡, 소변, 정액, 타액, 양수, 수막액, 샘액, 유관액, 림프액, 기관지흡입액, 관절 흡입액, 활액, 세포 추출물, 뇌척수액, 대변 또는 조직 샘플 유래의 균질화된 고체 물질, 세균 배양물, 바이러스 배양물 또는 이의 실험적으로 분리된 분획을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
"비-표적"이란 용어는 압타머와 비-특이적 복합체를 형성하는 샘플 내의 분자를 의미한다. 제1 압타머에 비-표적인 분자는 제2 압타머에 대해 표적일 수 있음을 충분히 인식할 것이다. 이와 마찬가지로, 제1 압타머에 표적인 분자는 제2 압타머에 비-표적일 수 있다.
개론
기술된 방법 및 장치는 바람직한 검사 환경에서 감지 농도의 당화된 단백질을 검출할 수 있을 정도로 바람직한 높은 감도와 특이성이 모두 있는 시스템을 제공한다.
특별한 관점에 따르면, 이 방법은 총 혈청 단백질 수준으로부터 특정한 당화된 단백질의 분획을 측정하는 것을 포함한다. 이러한 단백질의 비제한적 예로는 사람 헤모글로빈, 알부민(예, 사람 혈청 알부민(HSA)), 및 IgM 단백질을 포함한다.
체내에서 발견되는 2가지 흔한 당화된 단백질은 헤모글로빈 A1c(HbA1c) 및 면역글로불린 M(IgM)(B 세포에 존재하는 염기성 항체)이다. HbA1c 및 IgM은 둘 다 체내에서 반감기가 다르며, 예컨대 HbA1c는 약 6 내지 8주이고, IgM은 약 1주이다. 따라서, 이러한 당화된 단백질의 혈청에서의 정량은 단기간은 물론 장기간 동안에도 혈당 조절에 관한 후향적 판단을 제공한다. 본 발명의 방법은 단지 1종의 당화된 혈청 단백질을 검출할 수 있고, 결과적으로 당 조절에 관한 모든 순응도 평가가 일정한 한 기간에만 제한적인 다른 검사들의 주요 단점들 중 하나를 해소한다. 또한, 본 발명의 방법은 혈색소병증, 용혈 및/또는 빈혈로 인한 간섭과 같이 분석 결과를 제한하는 여타 단점들도 해소한다는 점도 주목할 필요가 있다.
본원에 기술된 방법/장치의 다른 특정 양태에 따르면, 여타 당화된 단백질과 같은 1 이상의 여타 분자 또는 이의 단편이 정확하게 검사될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 방법은 헤모글로빈 또는 부위-특이적 HbA1c 외에 다른 당화된 혈액 단백질의 검출 및 측정을 용이하게 하는 바, 이 방법은 혈당 조절을 평가하기 위한 다른 기술에도 유용하다.
특정 양태에 따르면, 다른 당화된 단백질은 혈중 반감기가 다르기 때문에 평가된 특정 당화된 단백질에 따라 약 수 일 내지 약 6주 이하의 기간 동안 당화된 단백질의 표적이 된 역사적 시간 기록이 달성될 수 있다. 이에 반해, 종래의 시험들은 고정된 한 시험 기간만을 평가하는 것에 제한된다.
이 방법 및 이러한 방법을 사용하는 플랫폼은 고도로 소형화되어 실시간 검출 및 분석을 할 수 있는 휴대용 장치에 유용하다.
이 방법은 피분석물의 의료 검사에 유용해지기 위해 필요불가결한 감도가 있는 것이다.
이 방법은 또한 여러 종류의 단백질, 예컨대 당화된 헤모글로빈과 다른 혈액 단백질의 당화된 형태를 평가할 수 있도록 한다.
본원에 기술된 한 방법에 따르면, 표면 플라스몬 공명이 고도로 작용기화된 압타머 감지 표면에 사용되어 혈액 혈청 내의 특정 혈당 단백질의 수준을 측정함으로써 혈당 순응도를 평가하는 정확하고 빠르며 비교적 저렴한 방법을 제공한다.
압타머의 측정
본원에 기술된 방법은 여러 종류의 압타머를 검출하는데 유용하다. 한 양태에 따르면, 헤모글로빈, 알부민 및 IgM 당화된/비당화된 단백질에 특이적인 올리고뉴클레오타이드(압타머)를 분리 및 동정하기 위해, SELEX 프로토콜을 사용할 수 있다.
표준 SELEX 프로토콜은 주어진 당해의 단백질에 특별한 리간드를 선별할 수 있게 하지만, 본원에 기술된 개량된 SELEX 법은 본원에 더 상세히 설명된 것처럼 두 단백질 형태(즉, 당화 및 비-당화된 형태)를 검출하고 포획할 수 있는 제2 압타머를 동정한다.
본원에 기술된 한 양태에 따르면, 제2 압타머의 동정은 주어진 시간 틀 동안 평균 글루코오스 수준과 상관관계를 입증할 수 있는 당화%를 측정하는데 사용된다.
검출 플랫폼: 단백질 감지 및 표면플라스몬공명 ( SPR ) 분광분석법
단백질을 검출하기 위해, 자가-조립 단층(SAM)은 특정 압타머를 금 SPR 감지 표면에 부착시키는데 사용된다. SPR 분광분석법 자체는 전도체와 유전체 사이의 계면에서 일어나는 현상과 관련이 있다. 이 계면에서, 전자 구조에 전하 밀도 진동이 있는 표면 플라스몬이 존재할 수 있다. 이 표면 플라스몬은 가장 일반적으로 가시광선 내지 근적외선 스펙트럼 내의 광에 의해 여기된다. 이러한 여기는 연속적인 금속 표면에 표면 플라스몬을 자유롭게 전파시킴으로써 나타날 수 있거나, 또는 금속 기반의 나노입자 구조의 사용을 통해 국소적 효과처럼 나타날 수 있다. 본원에 기술된 한 양태에 따르면, 자유 전파성 표면 플라스몬 접근법이 사용된다.
간략히 설명하면, 원자가 전자는 원자 코어로부터 해리되어, 본질적으로 외부 전기장의 존재 하에 전자 기체처럼 작용하며; 표면 플라스몬은 대응하는 파동 벡터가 다음과 같은 결합 파(bound wave)인 것으로 나타낼 수 있다:
Figure pct00001
여기서, λ는 광 파장이고, ε금속 및 ε샘플은 각각 매질의 상대적인 유전율 상수이다. 따라서, 표면 플라스몬으로의 에너지 전달은 입사광이 횡 모드의 편광 성분의 에너지가 k sp 에 가까운 전기장 벡터를 갖는 경우에 일어날 것이다(즉, 여기될 것이다).
도 7에 도시된 바와 같이, 입사광 벡터는 하기 수학식 2로 나타낼 수 있는 성분 k x 를 보유한다:
Figure pct00002
여기서, n i 는 입사 매질의 굴절률이고, θ i 는 금속 표면에 접촉하는 입사광의 입사각이다. 표면 플라스몬 공명은 입사광의 파장 λ에 대한 ε금속 및 ε샘플의 의존성으로 인하여 샘플 굴절률의 국소 변동에 매우 민감하다. 굴절률의 변화는 반사율 기반 접근법을 사용하여 측정할 수 있다. 도 7에 도시된 바와 같이 두 유전 매질의 계면에서 반사된 광은 자유 전자(즉, 표면 플라스몬)와 공명할 표면에서 최대 강도를 가진 소산장(evanescent field)을 발생시킨다. 이는 반사 광의 정도에 대응하는 감소를 나타내는 표면 플라스몬으로 전달되는 광에너지를 초래한다. 이러한 감소가 일어나는 각도는 통상 공명각이라 불린다.
공명각을 측정하는데 사용되는 크레취만 기구 구성은 도 8a에 도시되어 있다. 이 구성에서, 광은 프리즘을 통해 통과해 유리-금속 계면에서 반사한다. 금속-광 계면에서 나타나는 상호작용의 확대도는 도 7에 제시했다. 금속/샘플 계면에서 굴절률의 임의의 변화는 도 8b에 예시된 바와 같이 공명각의 대응하는 변화 또는 이동을 초래할 것이다.
본 발명의 방법은 종종 특이성 부족의 문제로 인해 불리하게 작용하는 SPR 자체의 사용 시의 단점을 해소한 것이다. 또한, SPR 자체의 사용 시에, 감지성 피분석물이 굴절률의 최소한 중간 정도의 변화를 유도해내지 못한다면, 이 SPR도 역시 감도 부족 문제로 불리하게 작용한다.
본 발명의 방법은 본원에 기술된 선택적인 압타머를 사용하고, SPR과 함께 자가-조립 단층(SAM)을 사용하여 상기 불리한 문제들을 극복한다. 본 발명의 방법은 높은 감도 및 선택성, 비용 효율성, 화학적 및 열적 안정성, 합성 및 저장 용이성과 같은 장점을 제공한다.
본원에 기술된 압타머 기반의 감지 방법은 특히 바이오센서 이용분야에서 감지 요소(sensing element)로서 유용하다. 또한, 압타머의 핵산 본성은 고정 및 재생이 더 쉬워지게 한다. SPR 이용분야의 한 양태에 따르면, 수용체(즉, 압타머)는 표적 피분석물 또는 분자를 포획하기 위한 다양한 종류의 고체 기재 위에 고정된다(도 9 참조).
또한, 현재 기술된 방법 및 장치는 SAM과 결합되어 있는 단백질의 비특이적 흡착이 있고, 이러한 비특이적 흡착이 센서 활성에 유해한 과거의 문제점을 해소한다. 특히, 복합 샘플 매트릭스, 예컨대 혈액, 소변 또는 다른 임상 샘플 유래의 비특이적 흡착은 감도를 제한시키는 주요 인자이다.
다른 제한 인자는 흡착된 표면 자체의 생물리학적 및 화학적 성질이었다. 이러한 SAM에서, 이러한 성질은 당해의 피분석물과 특이적 친화성 상호작용을 도모할 정도로 억제되어야 할 필요가 있었다. 또한, SAM 표면에 흡착된 단백질은 2차 구조의 입체형태학적 변화 및/또는 표면 상의 비-최적 배향 및 분포로 인하여 자신의 생체활성을 부분적으로 상실한다. 또한, 표면을 제조하는 프로토콜 및 대량 수송 조건도 단백질 흡착 반응에 유의적으로 영향을 미친다. 따라서, 다른 실험실로부터 수득한 데이터를 정량 비교하는 것은 곤란했고, 종종 정확하지 않았다.
실시예
본 발명은 이하 실시예에서 더 상세히 정의되며, 여기서 다른 언급이 없는 한, 모든 부 및 %는 중량 기준이고 °는 ℃이다. 이러한 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 나타내는 한편, 단지 예시용으로만 제공한 것이다. 상기 논의와 이러한 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 필수적인 특성을 확인할 수 있고, 본 발명의 취지 및 영역을 벗어남이 없이 다양한 용법과 조건에 맞도록 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 만들 수 있다. 본 명세서에 언급된 모든 공보, 예컨대 특허 및 비-특허 문헌은 명백히 참고 인용된 것이다. 이하 실시예는 본 발명의 특정한 바람직한 양태를 예시하려는 것으로, 이와 같이 특정되지 않는 한 특허청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 영역을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1
재료
동정된 압타머는 통합 DNA 기술(Coralville, IA)로 합성했다: 15bp 압타머(APT1): 5'-NH2-(CH2)6-GGTTGGTGTGGTTGG-3'(서열번호 1) 및 34bp 압타머(APT2): 5'-NH2-(CH2)6-CTATCAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3'(서열번호 2).
토실활성화된 자성 비드(MB)는 인비트로겐(Carlsbad, CA)에서 구입했다. 다른 모든 화학약품은 시그마 알드리치(Carlsbad, CA)에서 입수가능한 최고의 순도로 구입했다. 압타머 용액은 1M 인산염 완충액(pH 8)으로 제조했다. 3-머캅토프로피온산(MPA) 용액은 에탄올에 제조했다. 단백질 샘플 용액은 5mM KCl 및 1mM MgCl2를 함유한 0.1M pH 7.2 PBS 완충액을 사용하여 제조했다. 사용된 인산(PPA)은 100mM이었다. 다른 모든 용액은 탈이온(DI)수에 제조했다.
기구
SPR 측정은 시판급 SensiQ Discovery 시스템(ICx Technologies, Arlington, VA)을 25℃에서 사용하여 수행했다. 이 센서는 크레취만 구성을 기반으로 하여, 프리즘이 통합된 발광 다이오드(LED)로부터의 광을 먼저 편광시키고 그 다음 금 표면으로부터 내부적으로 반사시킨다. 광 반사각 및 상대적 세기는 광다이오드 어레이로 측정했다. 샘플 용액이 감지 표면에 적용되었을 때, SPR 프로필 최소값(SPR profile minimun)(SPR 각이라고도 알려짐)은 부하된 샘플의 굴절률의 함수로서 이동했고, 실시간 굴절률 판독값(스스로 센서가 주어진 임의의 표적에 특이적/선택적이지는 않지만)을 제공했다. SPR 반응 프로필은 SensiQ 소프트웨어로 기록한 뒤, MATLAB® 내에서 처리했다.
전기화학적 임피던스 분광분석법(EIS) 측정은 지지 전해질로서 KCl을 보유한 5mM Fe(CN)6 3-/Fe(CN)6 4- 용액에서 Gamry Reference 600 정전위장치(potentiostat)(Warminster, PA)를 사용하여 수행했다. 모든 실험은 실온에서 15분 동안 질소 기체로 퍼징한 용액으로 수행하고, 실험 동안 질소 블랭킷을 유지했다. 실험은 25℃에서 수행했다. 임피던스 스펙트럼은 10 포인트/decade로, 5mVrm의 전위 진폭 하에 0.1Hz 내지 100kHz의 주파수 범위에서 수집했다. EIS 결과는 실험적 임피던스 데이터를 전기적 등가 회로 모델에 부합(fitting)시켜 분석했다. 전기적 등가 회로의 파라미터는 Gamry EIS 300 전기화학 임피던스 분광분석기로 만든 복합 비선형 최소제곱(CNLS) 프로그램을 가지고 측정된 Bode 및 Nyquist 플롯에 임피던스 함수를 부합시켜 수득했다.
압타머 결합 능력은 다음과 같이 측정했다: 10nmol의 아민 변형 압타머를 37℃, 진탕 배양기에서 10mg 세척된 자성 비드(MBs)에 18시간 동안 커플링시켰다. 비-점유 결합 부위는 소혈청알부민(BSA)로 차단했다. 압타머-커플링된 MB는 철저히 세척한 뒤, 트롬빈 10nmol을 상기 압타머-커플링된 MB와 진탕기에서 실온 하에 2시간 동안 혼합했다. 대조군은 압타머 없이 정확하게 동일한 방법으로 준비했다. 총 단백질 및 미결합 단백질은 SensiQ로 제공되는 카르복시 작용기화된 SPR 센서로 측정했다.
혈액 단백질을 검출하는데 있어서 압타머계 SPR 센서의 사용을 입증하기 위해, 트롬빈 및 항트롬빈 압타머를 선택했다. 금 슬라이드는 사전세정된 현미경 커버 슬라이드 위에 금 50nm 층과 티탄 1nm 층을 형성시키는 물리적 증착(PVD)으로 제조했다. 그 다음, 다량의 DI수와 에탄올로 세척했다. 이 슬라이드는 사용 전에 질소 기체로 건조했다.
금 슬라이드를 작용기화하기 위해, 슬라이드를 10mM MPA 용액에 30분 동안 침지시킨 후, 에탄올 및 DI수로 세척했다. 슬라이드를 건조한 후, N-하이드록시석신이미드(NHS)와 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 염산염(EDC)(NHS 0.2M, EDC 0.05M)의 용액에 30분 동안 침지시켰다. 그 후, 슬라이드를 DI수로 세척한 다음, 5μM 압타머 용액에 침지시켰다. 마지막으로, 슬라이드는 PBS 완충액으로 세정하여 비특이적으로 흡착된 단백질을 씻어냈다. 그 후,슬라이드는 측정할 준비가 되었다. 특정 양태에 따르면, 이러한 2단계 표면 작용기화 공정은 SPR 뿐만 아니라 라만 및 형광 분광분석법에도 적용할 수 있다. 표면 작용기화 공정은 도 1에 개략적으로 도시했다.
코팅되지 않은(즉, 금 미처리) SensiQ 베이스 센서는 개발된 금 기반의 SPR 감지 표면으로 맞춤(custom) 변형시켰다. 구체적으로, 갓 제조한 압타머-고정된 금 기재는 굴절률 정합 광학 오일을 이용하여 탈피된 센서에 커플링시켰다. 그 다음, 1M 에탄올아민(EA) 100㎕를 20㎕/min의 유속으로 부하하여 EDC/NHS에 의해 활성화된 비-점유 MPA 부위를 차단시킨 후, 100mM 인산(PPA) 100㎕를 50㎕/min의 속도로 주입하여 비-특이적 결합을 제거했다. 런닝 완충액은 0.1M pH 7.2 PBS였다. 센서는 먼저 이 완충액으로 10분 동안 정규화시키고, 그 다음 트롬빈 샘플(25㎕)을 5nM, 25nM, 50nM, 250nM, 500nM, 1000nM, 2000nM의 농도로 5㎕/min씩 부하했다. BSA를 보유한 샘플은 모두 400nM BSA로 제조했다. 모든 데이터는 샘플 주입 후 290s, 300s 및 310s에 기록하고 평균을 냈다. 센서 재생은 100㎕ PPA를 50㎕/min의 속도로 주입한 뒤 런닝 완충액으로 세척하여 수행했다.
실시예 1의 결과
EIS 측정
작용기화된 각 층의 성공적인 고정화는 EIS 측정을 통해 확인했다. 도 2는 여러 전극들에서 임피던스 스펙트럼의 Nyquist 플롯을 도시한 것이다. 기본(bare) 금 전극은 높은 주파수에서 아주 작은 원을 나타냈고, 이는 전해질 용액에 용해된 산화환원 프로브에 대한 매우 낮은 전자 전이 저항을 나타내는 것이다(곡선 A). MPA가 전극에 고정되고 EA와 PPA로 처리되었을 때, 전자 전이 저항(Ret)은 125Ω으로 증가했다(곡선 B). 그 다음, APT1 압타머 5μM이 첨가되고 SAM과 결합되었을 때, Ret는 600Ω으로 증가했다(곡선 C). 이 양태에서, 금 전극 상의 반응성 부위는 EA(에탄올아민)으로 차단하여 금 표면 위에 압타머의 비특이적 흡착을 방지하고, 이로써 압타머가 SAM에만 부착되어 있도록 했다. Ret 증가는 고정된 압타머와 산화환원 프로브 간의 정전기적 척력에 의해 유발되어 계면의 전자 전이에 대한 장벽을 유발한다. 이 결과는 금 표면 위에 SAM 층의 성공적인 고정화 및 SAM에 대한 압타머의 안정한 결합을 보여준다.
자성 비드 ( MB ) 기반의 최대 결합 능력
압타머-커플링된 MB를 철저히 세척한 후, 트롬빈을 첨가하고 카르복시 변형 SPR 센서를 사용하여 농도 변화를 측정했다. 굴절 지수는 첨가된 트롬빈의 농도 변화로만 조절했다. 다른 실험 변수, 예컨대 단백질 변성 및 온도는 SPR 결과에 소소한 영향을 미쳤고, 따라서 결과에 영향을 미치지 않는 것으로 간주했다.
도 3에 도시한 바와 같이, 트롬빈의 농도 변화는 압타머에 의해 작용기화되지 않은 대조군(3% 미만)에 비해 크지 않았다. 이는 두 실험 그룹에서의 농도 변화가 주로 압타머와 트롬빈 간의 결합에 의한 것이라는 것을 보여준다. APT1 그룹과 ATP2 그룹에서, 압타머 작용기화된 MB와 트롬빈 용액의 혼합물은 18시간 동안 반응시켰고, 이 반응은 MB 제조업자의 지침에 기초해 볼 때 종결된 것으로 간주했다. 따라서, 최종 농도는 트롬빈에 대한 압타머의 최대 mol/mol 결합 능력을 반영했다.
결과는 APT1의 결합 비(57.1%)가 APT2(55.2%)보다 능력이 낫다는 것을 보여주었다. 두 압타머는 트롬빈에 대한 50% mol/mol이 넘는 결합비를 나타냈고, 이는 이들이 트롬빈 감지 이용분야에 양호한 수용체 후보들임을 시사하는 것이다. 특정 양태에서, 모든 압타머가 MB에 결합할 수는 없으며, 이에 따라 표적 화합물에 대한 결합성 압타머의 실제 결합 능력은 약간 더 클 수 있다는 것을 인식하고 있어야 한다.
대조군은 압타머 작용기화 없이 MB로 구성되었고, 모든 결합 부위는 BSA로 차단되었다. 압타머-함유 그룹은 각각의 압타머로 작용기화된 ATP1- 및 APT-2 MB였고, 비-점유 결합 부위는 BSA로 차단되었다. 오차 막대는 3개의 샘플에서 측정된 값의 표준 편차를 나타낸다.
SPR 결과
2가지 다른 압타머를 금 표면 위에 고정시키고, 각각의 결합 성능을 비교했다. 참조용으로, 다른 트롬빈 농도(5nM, 25nM, 50nM, 250nM, 1000nM, 2000nM)의 샘플을 각각 기본 Au 센서, APT1 센서 및 APT2 센서에 각각 부하했다. 그 다음 동일한 트롬빈 농도를 사용하되, 각 트롬빈 샘플에 비교를 위해 400nM BSA 혼재성 성분을 첨가한 2차 실험을 수행했다. 도 4에서 "트롬빈" 실험에 표시된 바와 같이, SPR 이동은 트롬빈 농도가 비교적 높은 경우에도 불구하고 기본 Au 센서 표면에서 매우 낮았다.
이에 반해, 압타머-변형된 센서의 경우, SPR 이동은 유의적으로 증가했고, 최적 검출 범위는 5nM 내지 1000nM(선형 범위)였다. "트롬빈+400nM BSA" 데이터(도 4)는 큰 400nM BSA 혼재성 농도 성분이 각 트롬빈 샘플 농도에 첨가된 경우를 보여준다. 트롬빈 그룹과 비교했을 때, 반응은 거의 동일한데, 이는 압타머-변형 APT1 및 APT2 센서가 오로지 트롬빈에 매우 특이적이라는 것을 나타내는 것이다.
이는 400nM의 BSA 존재 및 부재 하에 500nM 트롬빈 농도에 대한 SPR 이동을 보여주는 도 5에 상세히 예시했다. 샘플에 BSA를 첨가한 경우, 압타머 변형 센서의 SPR 반응에는 거의 영향을 미치지 않았는데, 이는 트롬빈에 대한 센서의 양호한 선택성을 나타내는 것이다. 이는 BSA 존재 및 부재 하에 트롬빈 샘플 간의 유의적인 변화를 겪는 기본 Au 센서와 대조적인 것이었다. APT1 변형 센서는 모든 트롬빈 농도에서 APT2 센서보다 약간 더 높은 이동을 나타냈다. 또한, APT1의 부합 선의 기울기는 선형 반응 범위에서 APT2보다 약간 컸고(도 6), 이는 더 양호한 감도를 입증한다. 이러한 두 압타머들은 트롬빈의 다른 부위에 결합하여, 표적에 대한 친화성은 계면 결합 환경 및 용액마다 상이하다.
항체 감지
MB 결합 검사에서, APT1은 APT2보다 약간 높은 결합 능력을 가졌으며, 이는 작용기화된 센서의 감도에 의거한 SPR 결과에 상응하는 것이다. 이론적으로 국한하려는 것은 아니지만, 이 양태에서, 이것은 표적 단백질의 결합 부위에 접근 가능성이 더 큰, 더 작은 압타머 때문일 것으로 생각된다. 또한, 특정 양태에 따르면 더욱 복잡한 2차 구조를 가진 더 큰 압타머는 표적 화합물과 결합을 형성하기 위해 초과 공간 유연성(extra spatial flexibility)을 필요로 할 수 있다.
본원의 실시예 1이 보여주는 바와 같이, MPA 층은 금 위에 우수한 도포율을 나타내고, 생물감지 목적의 항체 면역화에 유용하다. 또한, 이러한 결과는 아민-변형 압타머가 MPA 층 위에 쉽게 고정되며 센서 성능은 항체-기반 센서와 비슷하였음을 보여준다.
각 압타머 및 추가로 대조군에 대해 3개의 감지용 슬라이드를 제조했다. 센서간 성능은 갓 제조된 샘플을 사용할 때에는 일정하여. 각 측정마다 오차가 비교적 적었고, 총 시그널의 표준 편차는 평균 2% 미만이었다(도 5의 오차 막대).
BSA 첨가는 약간 큰 오차를 유도했고, 유속을 저하시키고 샘플 부하시간을 증가시킴으로써, 오차는 간주되기에는 크게 충분한 것으로 여겨지지 않지만 감소할 수 있다. 오차의 대부분은 온도 가변성에 의해 유발되는 것으로 생각되고; 이러한 경우, 일부 양태에 따르면 온도 조절 환경에 센서를 배치하여 정확성을 증가시킬 수 있다.
본원에 기술된 감지 표면은 5nM 내지 1000nM의 최적 동력 범위(dynamic range)를 나타냈으며, 이는 트롬빈 압타머-기반의 감지 기술에서 보고된 최대 동력 범위와 비슷하거나 더 큰 것이다. 사람 혈액에서 트롬빈 농도 범위는 저(low) 나노몰 내지 저 마이크로몰 범위 내인 것으로 보고되어 있으므로, 당해의 방법은 생체내 트롬빈 정량 검출에 매우 적합하다.
센서의 가역성
센서의 가역성을 시험하기 위해, 고정된 샘플 농도를 센서에 반복해서 10회 부하했다. 센서 재생은 PPA로 수행했다. 트롬빈 농도 50nM, 250nM 및 500nM을 사용하여 평균 SPR 반응과 표준편차에 대한 오차 막대를 함께 도 6에 도시했다. 모든 데이터는 갓 제조한 감지 슬라이드로부터 수득했다. SPR 반응은 동일 샘플 농도에서 각 부하 시마다 일반적으로 약 0.5% 감소했다. 모든 감지 슬라이드는 10번째 부하 후 초기 SPR 이동(shift) 반응을 95% 넘게 유지했다. 또한, 2번째 샘플 부하는 일반적으로 이후 부하량들과 비교했을 때 가장 큰 반응 변화를 나타냈다. PPA 주입 시간이 길어질수록 센서 회복률은 실험 조건에 따라 증가할 수 있다. BSA의 출현은 센서의 감도를 저하시켰고(예컨대, 도 6에서 BSA의 출현은 반응 곡선의 기울기를 약간 감소시켰다), 하지만, 이는 센서의 가역성에 영향을 미치지 못했다. 또한, 도 6은 50nM 내지 500nM 샘플 범위에서 BSA의 출현 하에 및 출현 없이 센서가 선형 반응을 유지했음을 입증한다.
실시예 2
센서의 다른 양태들
다른 양태에 따르면, 센서는 혼합된 길이의 스페이서 층을 포함할 수 있다. 비제한적 한 예에 따르면, 혼합된 길이 층은 특정 양태에서 감도와 특이성을 증가시키는데 사용될 수 있는 MPA와 혼합된 11-머캅토운데칸산(MUA)일 수 있다.
다른 양태에 따르면, 혼합된 길이 스페이서는 고정된 압타머의 특정 형태를 형성 및 유지하는 것을 돕기 위해 첨가될 수 있다.
다른 양태에 따르면, 에틸렌 옥사이드와 같은 친수성 기는 비특이적 단백질 결합을 저하시키기 위해 압타머의 5c-말단 위에 삽입될 수 있다.
본원에 기술된 2단계 고정화 방법의 특정 양태에 따르면, 압타머의 간격 조정은 또한 MPA SAM 밀도를 조정하거나, 또는 에탄올아민과 압타머를 다양한 몰 비로 하여 동시항온처리하여 수행할 수 있다.
혈액 단백질의 검출
여러 혈액 단백질을 검출하기 위해, 당해의 표적 단백질에 특이적이고 직접적으로 결합하는 압타머를 찾고자 SELEX 절차를 사용할 수 있다. 그 후, 개발된 압타머는 아민 말단화하고, 여기에 기술된 방법 중 하나를 사용하여 금 표면 위에 고정시켜 거의 모든 단백질의 표적 특이적 센서를 형성할 수 있다. 이것으로, 압타머는 SELEX를 통해 생성되어 항체보다 뛰어난 이점을 갖고 특정 화합물을 표적화할 수 있다.
본원에 기술된 2단계 고정화 방법은 금 SPR 감지 표면 위에 SAM과 아민-말단화된 압타머를 고정화하는데 특히 유용하다. 현재 기술된 SPR 센서는 낮은 샘플 소비량, 표지화 필요성의 결여, 높은 감도 및 빠른 반응 시간과 같은 장점을 제공한다. 2단계 고정화 방법의 추가 장점은 입증할 수 있는 비용 효율, 양호한 가역성, 균일한 밀도 및 확실하고 특이적인 혈액 단백질 검출 플랫폼으로서의 사용을 포함한다.
실시예 3
SPR 압타머 기반의 당화된 알부민 단백질 감지
당화된 사람 혈청 알부민(HSA)은 검출 및 정량되었다. 개발되고 사용된 압타머(티올화됨, 비환원됨)는 5'-SH-(CH2)6-CCGAAACCAGACCACCCCACCAAGGCCACTCGGTCGAACCGCCAACACTCACCCCA-3' (서열번호 3)이었다.
금 슬라이드는 예비세정된 현미경 커버 슬라이드 위에 1nm 티탄 층과 50nm 금 층을 형성시키는 물리적 증착(PVD)으로 제조했다. 그 다음, 금 슬라이드는 다량의 DI수와 에탄올로 세척했다. 금 슬라이드는 사용 전에 질소 기체로 건조했다.
티올화된 압타머는 1M 인산염 완충액 pH 8로 희석하고, 진탕기에서 Cleland's REDUCTACRYL™ 시약과 2시간 동안 혼합하여 압타머 서열 내의 이중 티올 결합을 환원시켰다. 시스테인은 수용성 티올-함유 아미노산으로, 금 표면에 직접 결합하여 자가-조립 단층(SAM)을 형성할 수 있고, 이는 그 다음 압타머 용액에 첨가되어 압타머의 이격(space out)을 돕고 압타머 사이의 갭을 채우고, 비특이적 표면 흡광도를 줄일 수 있다. 이러한 예비 실험에서 압타머의 최종 농도는 1μM로 설정했고, 압타머:시스테인 몰비는 1:10이었다. 금 슬라이드는 37℃의 압타머/시스테인 혼합 용액에 침지시켰다.
고정화 공정 후, 금 슬라이드는 0.01M PBS 완충액(pH 7.4)으로 세척했다. 그 다음, 작용기화된 표면은 대응하는 SPR 센서에 커플링시키고, 1㎍/ml 총 단백질 HSA 샘플(즉, 총 = 당화형 + 비당화형)을 주어진 당화형 퍼센트(%) 비(당화형/총 단백질): 2, 6, 10, 14 및 18%로 제조했다.
SPR 반응은 각 샘플마다 기록했다. 기본-Au 표면과 함께 작용기화된 표면에 대한 결과는 도 10에 요약했다. 압타머 작용기화된 SPR 표면은 당화된 단백질의 함량 변화에 직접적으로 반응한다. 총 단백질 농도는 샘플마다 1㎍/ml로 일정하다는 것을 유념한다.
비-작용기화된 표면(즉, 기본 금)은 무시할 정도의 반응을 나타내는 바, 작용기화된 표면의 증진된 감도를 더욱 명확히 예시한다. 특정 양태에 따르면, 압타머 서열은 길이가 작지만(40 내지 60nt), 크기와 전하를 기반으로 하여 표적을 분간할 수 있고, 친화도에 영향을 미칠 수 있다. 이론적으로 국한하려는 것은 아니지만, 본 발명자들은 이제 압타머의 3D 구조가 또한 어떤 역할을 할 수 있을 것으로 생각한다: 1가지 비제한적 예로는 시스테인 풍부 돌출-고리(bulge-loop) 구조 및 ACC(C) 또는 (C)CCA 모티프를 포함한다.
HbA1c , 알부민 및 IgM 에 대한 비- 당화 및 당화 단백질 결합 부위를 위한 압타머
압타머는 자가-조립 단층(SAM)에 부착하도록 개발했다. 특정 양태에 있어서, 단백질 헤모글로빈, 알부민 및 IgM은 각각의 반감기가 혈당 조절의 짧은, 중간 및 긴 기간의 역사적 기록을 채우는 정보를 제공하기 때문에 유용하다. 몇몇 일반적인 혈액 단백질들의 성질들은 이하 표 1에 요약했다.
관련된 혈액 단백질들의 성질
표적 단백질 반감기(주) 평균 농도(mg/ml) 당화 퍼센트(%)
헤모글로빈 6-8 325 6-15
IgG 3-4 12 20
알부민 3 33 16
IgM 1 1.4 15-35
피브리노겐 0.5 2.5 6
각 단백질의 당화는 각 단백질을 1M 글루코오스와 DTPA를 함유하는 pH 7.4 PBS에서 2일 동안 항온처리(37℃)함으로써 수행할 수 있다. 당화된 단백질은 그 다음 투석 과정으로 처리한 뒤, 친화성 크로마토그래피로 더 농축시킬 수 있다. 이 단계에서, 당화된 단백질은 지지체 컬럼 중의 폴리아크릴아미드 비드 상에 고정된 보론산을 사용하여 각각 비당화된 형태로부터 분리될 수 있다. 이 과정을 통해, 비결합 분획 및 결합 분획을 수집할 수 있고, 다시 여과 방법을 사용하여 농축할 수 있다.
단백질의 당화 및 비당화된 형태 모두에서 헤모글로빈, 알부민 및 IgM에 특이적인 핵심 올리고뉴클레오타이드(압타머)를 분리 및 동정하기 위해, 개량된 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential) 농축 방법을 사용할 수 있고, 이는 이하에 더 상세히 설명되고 도 12에 개략적으로 예시된 바와 같다.
개량된 SELEX 방법은 당해의 단백질에 특별한 리간드를 선별할 수 있도록 한다. 개량된 SELEX 방법은 무작위 RNA 서열의 대형 라이브러리를 만들어 수행할 수 있다. 이 라이브러리는 보통 특정 서열에 따라 다른 구조로 폴딩하는 1014 내지 1015개의 다른 RNA 종을 함유한다. 이 라이브러리를 그 다음 당해의 표적 단백질과 항온처리하고, 이 라이브러리에 함유된, 단백질에 결합하는 RNA를 결합하지 않는 RNA와 분리한다. 결합한 RNA를 RT-PCR로 증폭시키고, 시험관내 전사시켜 당해의 표적에 결합하는 RNA가 농축된 RNA 푸울을 생성시킨다. 이러한 선택 및 증폭 과정은 표적 단백질에 대한 친화도가 가장 높은 RNA 리간드가 분리될 때까지 8 내지 12회 사이로 반복할 수 있다. 그 후, 이러한 압타머는 클로닝하고 서열분석한다.
총 단백질에 대한 당화된 단백질의 비 측정
총 단백질에 대한 당화된 단백질의 퍼센트 비 측정은 주어진 시간 창 동안 평균 혈당과 관련된 것이었다.
표적 단백질의 당화 부위에 특이적인 압타머는 생성될 수 있다. 또한, 각 단백질의 당화된 형태와 비-당화된 형태 모두에 결합할 압타머도 생성되었다. 한 양태에 따르면, 헤모글로빈, 알부민 및 IgM 단백질의 당화된 형태는 SELEX 프로토콜에서 표적으로 사용했다. 최종 환원된 압타머 푸울은 비-당화 부위 특이적 압타머 및 당화-부위 특이적 압타머를 모두 함유한다. 이 시점과 이후 회차(들)에서, 비-당화된 단백질(즉, 정상 단백질)이 도입될 수 있고, 당화 부위를 인식하는 현재의 압타머들은 결합하지 않아서, 특성화하기 위해 회수할 수 있다. 이 방법은 단백질의 당화/비당화된 형태 모두에 결합할 수 있는 별도의 압타머들 뿐만 아니라 당화된 형태에만 특이적인 압타머들도 제공한다.
표면플라스몬공명 자가 조립된 단층 압타머 -기반의 작용기화된 표면의 최적화
동정된 압타머는 먼저 결합 성질, 감도, 특이성 및 선택성을 비롯한 일반적 성능에 대해 특성화할 수 있다. 이하 표 2에는 성능 수준을 기반으로 한 표적 세부사항의 예를 제시했다.
파라미터 세부사항
검출 한계
헤모글로빈 10-7 mol
알부민 10-6 내지 10-5 mol
IgM 10-8 내지 10-7 mol
교차반응성 <6%
분석 시간 <15min
특히, 결합 친화성을 특성화하기 위한 1가지 방법은 SPR 방법의 사용이다. 동정된 압타머 후보들을 기반으로 하여, SPR은 각각의 결합 반응 곡선을 작도하는데 유용하다. 예를 들어, 특정 장치(예, SensiQ, iCx Nomatics)는 이중 마이크로플루이딕 채널이 장착되어 있고 유속이 조절가능하다. 검사는 도 1에 기술된 것과 유사한 고정화 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
고정화를 용이하게 하는 변형
또한, 특정 양태에 따르면, 당화 및 비-당화된 특이적인 압타머 후보들은 -COOH 변형 금 SPR 표면 위에 고정화를 용이하게 하기 위해 5'-NH2-C6 부착을 통해 변형시킬 수 있다. 그 다음, SPR 측정은 압타머 후보들의 각각의 친화도 상수를 특정규명하기 위해 사용한다.
친화도 검사 외에, SPR 칩 고정화된 압타머를 사용하여 특이성과 선택성을 모두 평가할 수 있다. 이러한 양태들에 따르면, 각각의 압타머 칩은 각각 표적 단백질의 당화된 형태 및 비-당화된 형태 모두에 노출되었다. 이에 따라 주어진 단백질, 뿐만 아니라 다른 단백질들(예, HbA1c 압타머 칩의 경우 알부민)에 대한 두 형태 간의 교차반응성이 측정되었다. 바람직한 특정 양태에 따르면, 표적 교차반응성은 약 6% 이하인 것이 바람직하다. 이러한 기준에 부합하지 않는 것으로 측정되면, SELEX 프로토콜은 교차반응성 성능을 더욱 향상시키기 위해 개량된 선택 조건(즉, 배제 라운드의 빈도 증가)으로 반복할 수 있다.
또한, 양호한 표적 인식은 고정화에 사용된 압타머 결합 과정에 의해서도 영향을 받을 수 있는 것으로 생각된다. 특정 양태에 따르면, 이 방법은 압타머의 1 이상의 대체 결합 방법의 사용을 포함할 수 있다. 특정 양태에 따르면, 결합은 3'-아미노 결합, 티올 결합 또는 다른 잠재적 결합을 통한 것일 수 있다.
또한, 이러한 결합이 예컨대 밀도 및 길이와 같은 특정 파라미터의 조절을 통해 변형될 수 있다는 것도 본 발명의 범위에 포함되어야 한다. 따라서, 압타머 및 결합 방법은 원하는 최대 성능을 제공하도록 최적화될 수 있다. 또한, 본원에 기술된 작용기화된 표면을 생성하는 방법은 표면에 바람직한 수준의 균일성을 제공하기 위해 최적화될 수 있을 뿐만 아니라 압타머 센서 반응을 최적화시킬 수 있다.
자가-조립 단층( SAM ) 결합
전술한 결합 방법 외에도, 사용할 수 있는 다른 방법으로는 이원성 자가조립 단층(SAM) 및 환원적 탈착 과정을 통한 결합을 포함한다. SAM의 패킹 밀도와 SAM의 길이는 SPR 시그널에 영향을 미치는 바, 이원성 SAM의 밀도와 길이는 환원적 탈착 과정을 사용하여 조절할 수 있다.
특정 양태에 따르면, 합성된 디티오비스-N-석신이미딜 프로피오네이트(DTSP)는 혼합 SAM을 개조(tailoring)하기 위해 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)과 함께 사용할 수 있다. 단백질 흡착에 저항성인 PEG3은 단백질의 비-특이적 흡착을 방지하는데 이용할 수 있다. 또한, DTSP의 카르복시 기는 압타머와 안정한 결합을 형성할 것이다.
특정 양태에 따르면, 디티오비스-N-석신이미딜 프로피오네이트(DTSP)를 이용한 티올 SAM 고정화 방법은 인산염 완충 용액에서 사용했다. DTSP는 적어도 부분적으로 이의 독특한 표면 성질, 예컨대 친수성, 습윤성, 화학적 반응성 및 헤모글로빈과 사이토크롬 c와 같은 단백질에 대한 친화성으로 인해 SAM에 유용하다.
이원성 SAM 고정화를 위해, 3-머캅토프로피온산(MPA)과 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)을 사용할 수 있다. 특정 양태에 따르면, MPA는 PEG보다 산화환원 전위가 낮기 때문에, 즉 PEG3은 그대로 두고 MPA는 환원적 탈착에 의해 쉽게 제거될 수 있기 때문에 선택된다. DTSP는 압타머의 아미노 기와 공유 결합을 형성할 수 있는 반면, PEG3은 그렇지 못하여, 압타머는 DTSP에만 부착할 것이다.
2성분 티올 용액은 이원성 SAM의 총 농도를 1mM로 유지시키면서 MPA와 PEG3의 1mM 에탄올 용액을 다양한 비로 혼합하여 제조할 수 있다. 비가 20:80, 50:50 및 80:20인 MPA와 PEG3의 이원성 SAM은 혼합된 티올 용액에 전극을 1시간 동안 침지시켜 금 전극 위에 형성시킬 수 있다.
이제 도 11a 내지 11e의 개략도를 살펴보면, 이원성 SAM 형성 및 환원적 탈착 절차가 도시되어 있다. 먼저, 3-머캅토프로피온산(MPA)과 PEG3의 이원성 성분들은 에탄올 용액에서 금 표면 위에 흡착시킨다(도 11a). 금 전극으로부터 MPA의 환원적 탈착은 0.5M KOH 용액에서 수행한다. MPA와 PEG3의 상분리된 이원성 SAM에서 흡착된 MPA는 -1.2V의 전위를 30분 동안 적용함으로써 선택적으로 환원된다(도 11b).
MPA의 환원적 탈착 후, PEG3 층을 가진 샘플은 1mM DTSP 용액에 침지시켜 DTSP 층을 형성시킨다(도 11c). 도 11d는 압타머 고정화를 도시한 것이고, 도 11e는 PEG3으로부터 압타머의 제거를 도시한 것이다.
압타머는 -COOH 말단 기를 노출시킨 DTSP의 SAM에 공유 커플링한다. 공유 결합 형성을 위해, PBS 중의 압타머(50㎍/ml)는 갓 제조된 NHS 및 EDC와 함께 주입한다. N-말단에 아미노 기를 가진 압타머는 CO-NH 아미드 결합 형성을 통해 DTSP SAM 위에 고정될 수 있다. DTSP와 PEG3의 비는 SAM의 패킹을 조절하기 위해 변화시킬 수 있고, 결과적으로, 최적의 SPR 시그널을 제공하는 단백질의 결합이 수득될 수 있다.
표면 도포력 측정
순환 전압전류법(CV) 및 전기화학적 임피던스 분광분석(EIS)은 고정된 SAM의 표면 도포력(coverage) 및 샘플의 산화환원 반응을 측정하는데 사용할 수 있다. 표면 조성은 흡착된 티올의 순환 전압전류곡선의 피크 면적으로부터 추정할 수 있다. 변형 전극 위에 침착된 이원성 SAM의 반응은 미변형 전극의 반응과 비교할 수 있다.
환원적 탈착의 순환 전압전류 곡선은 참조 전극으로서 Ag-AgCl-포화 KCl 전극과 대향 전극으로서 백금 와이어를 사용하여 0.5mol dm-3 인산염 완충 용액에서 기록할 수 있다. 이에 따라, SAM+압타머 코팅된 금 전극(Au+SAM+압타머) 및 금 전극 위의 환원적 제거된 SAM과 압타머(Au+RD SAM+압타머)의 CV 곡선을 비교할 수 있다. CV 곡선은 환원적 제거를 위해 100mV/s의 스캔 속도로 기록할 수 있다. 각 전압전류 곡선마다 SAM의 환원적 탈착의 다운 피크(down peak)는 약 50mV에서 나타날 것으로 예상된다.
SAM의 길이와 밀도는 모두 최적 SPR 반응을 수득하기 위해 조절할 수 있다. 링커 길이가 길 때에는 더 많은 압타머를 고정시킬 수 있으나, 이 압타머가 표면으로부터 멀어질수록 SPR 딥(dip)이 더 넓어질 수 있다. 이와 마찬가지로, 링커 밀도가 높을 때에는 더 많은 압타머가 SAM에 부착할 수 있으나, 그 후 SPR 딥이 더 좁아져서 검출하기가 더 어려워질 수 있다. 이러한 압타머 변형 표면은 5'-NH2-C6/-COOH 방법에 사용된 방법으로 특성규명할 수 있다.
개발된 작용기화된 SPR 감지 표면의 미세조정 및 확인
HbA1c, 알부민 및 IgM 당화/비-당화된 단백질 검출을 위한 SPR 감지 플랫폼은 먼저 공지된 표적 단백질 비를 가진 식염수 완충액을 사용하는 검사에서 미세조정될 수 있다. 각각의 샘플 용액은 고정된 총 단백질 수준에 대해 혈액에서 관찰되는 것과 비교했을 때 적당한 수준의 비로 제조할 수 있다(표 1 참조).
각 샘플마다, 단백질 총량에 대한 당화된 단백질의 비는 바람직한 범위 상에서 변동될 수 있다(예컨대, 6 내지 15% 사이의 HbA1c% 수준은 각각 평균 혈당 수준 60 내지 360mg/dL에 해당한다). 이러한 양태에서, 1 내지 25v/v%의 범위가 적당할 것이다. 그 다음, 각 샘플에서 SPR 반응이 평가될 수 있고, 미세조정 모델이 당화%와 관련하여 측정될 수 있으며, 미세조정의 표준 오차가 계산될 수 있다. 개발된 SPR 분석의 정확성을 추가로 평가하기 위해, 각각의 샘플(즉, 미세조정에 사용되지 않은 샘플)을 각각의 미세조정 모델(들)을 기반으로 한 분석 성능을 평가하는데 사용할 수 있다. 상대 오차 및 절대 오차를 모두 측정할 수 있고 유용한 진단 목적에 필요할 범위와 비교할 수 있다.
혈청 혈액 검사
실제 혈액 혈청에서 성능을 평가하기 위해, 비-당뇨성 급원의 혈액 혈청을 사용할 수 있다. 혈청 샘플은 표준 임상 검사를 통해 당화된 단백질 vs 총 단백질의 각각의 분획을 측정하기 위해 분석할 수 있다.
이러한 값을 참고값으로 사용하여, 개별 샘플에 특정한 양의 각 당화된 단백질(들)을 혼입 첨가할 수 있다. 식염수 검사에서 사용된 것과 유사한 검사 평가를 반복할 수 있다. 혈청 내 특정 표적 단백질의 높은 농도로 인해(예컨대, 표 1에 제시된 바와 같은 헤모글로빈), 검사를 진행하기 전에 샘플은 희석하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 혈청의 복잡한 화학적 조성으로 인하여 문제가 생길 수 있기 때문에, 당화된 단백질 외에 샘플 조성의 변화 도입과 같은 다른 잠재적 혼재성 효과도 검사할 수 있다.
실시예 4
당화된 단백질 및/또는 비- 당화된 단백질 부위에 표적화된 압타머를 동정하기 위한 개량된 SELEX 방법
SELEX 프로토콜은 당화된 단백질 부위에 대한 친화성이 있는 압타머를 동정할 수 있도록 개량했다. 이와 같이 개량된 SELEX 프로토콜은 총 단백질에 대한 당화된 단백질의 퍼센트 비를 측정할 수 있게끔 했다.
표적 단백질(들)의 당화 부위에 특이적인 압타머, 뿐만 아니라 각 단백질의 당화된 형태 및 비-당화된 형태 모두에 결합할 압타머를 제작했다. 각 단백질(예, 헤모글로빈, 알부민, IgM 등)에 대한 이러한 압타머를 제작하기 위해, 증폭 제1 라운드에서는 각 단백질의 당화된 형태에 SELEX 프로토콜을 적용했다. 이러한 SELEX 프로토콜의 제1 라운드는 "비-당화 부위 특이적" 압타머 및 "당화 부위 특이적" 압타머 모두를 함유하는 환원된 압타머 푸울을 산출했다.
비-당화된 단백질(즉, 정상 단백질)은 제1 라운드 SELEX 증폭 과정에서 수득한 푸울에 첨가한다. 적어도 제2 라운드의 증폭에서는 비-당화된 단백질에 결합하는 푸울 내의 압타머는 이 특이적 SELEX 라운드에서는 용출되지 않으며, 이에 따라 푸울로부터 제거된다. 이와 같이 개량된 SELEX 프로토콜은 당화 부위에 특이적인 압타머가 향후 푸울에 남아 있을 기회를 향상시킨다. 이렇게 남은 압타머는 그 다음 표준 SELEX 과정의 일부로서 후속 SELEX 라운드에서 특성화하기 위해 회수할 수 있다. 다른 양태에 따르면, "당화된" 단백질 및 "비-당화된" 단백질의 사용은 가역적일 수 있으며, 예컨대 제1 라운드의 SELEX 증폭 과정에서 수득된 푸울에 "당화된" 단백질이 도입된다.
고 친화성 당화된 및/또는 비- 당화된 단백질 압타머의 결정
단백질 분자(예, 알부민)는 당화에 유용한 다수의 부위가 있다. 당화 수준은 일반적으로 총 단백질 수준에 대한 당화된 제시 단백질 농도의 퍼센트를 의미하는 반면, 당화율은 단일 단백질 분자 내에서 글루코오스 또는 글루코오스 유도체가 결합된 부위가 어느 정도인지를 의미한다. 3D 형태 및 전하 분포는 고도로 당화된 단백질 분자와 비-당화된 단백질 분자 간에 매우 다르지만, 약간 당화된 단백질 분자(즉, 단일 당화 점)와 비-당화된 단백질 분자 간에는 매우 유사하다. 따라서, 비-당화된 형태에 낮은 친화성을 가진 고 친화성 단일 부위 특이적 당화된 단백질 결합성 압타머의 개발은 매우 간단하지 않은 과제이다.
개량된 SELEX 시험관내 선택 프로토콜의 한 예는 도 12에 도시했고, 여기서 큰 랜덤 DNA 푸울은 먼저 자성 비드(MB) 위에 고정된 당화된 단백질 표적, 즉 1차 또는 "당화된 단백질 표적-MB" 복합체와 혼합된다.
당화된 단백질 표적에 높은 친화성이 있는 압타머는 결합하여 "압타머-당화된 단백질 표적-MB 복합체"를 형성할 것이다.
"압타머-당화된 단백질-표적-MB" 복합체는 초기 DNA 푸울로부터 분리된다.
후속 단계에서, 결합된 압타머는 "당화된 단백질-표적-MB" 복합체(즉, 단백질의 단일 당화된 또는 약간 당화된 형태)로부터 용출된다.
이 시점에서 제2 세트의 MB(제2 또는 "비-당화된 단백질-표적 MB" 복합체)에 커플링된 대조용 단백질(즉, 단백질의 비-당화된 형태)이 제1 용출액에 첨가된다.
"비-당화된 단백질-표적-MB" 복합체는 비-당화된 단백질 형태에도 친화성이 있는 제1 용출액 중의 "선택적" 압타머를 제거하는데 사용된다.
후속 단계에서, "선택적" 압타머는 "비-당화된 단백질-표적-MB" 복합체로부터 용출된다.
"비-당화된 단백질-표적-MB" 복합체의 제거 후, 남아 있는 "선택적" 압타머는 단일 또는 표적 당화 부위에 대해 높은 친화성이 있는 압타머이다.
이때, 이러한 남아 있는 "선택적" 압타머가 원하는 당화된 단백질 부위에 매우 높은 친화성이 있는 경우 이를 증폭시키기 위해 표준 SELEX 방법을 사용할 수 있다.
구체적으로, 이러한 개량된 SELEX 방법은 단백질의 비-당화된 형태에 대한 친화성은 낮고 단일 당화 부위에 대한 친화성은 높은 압타머가 개발되게 한다. 이러한 개량된 SELEX 방법은 또한 화학적 구조가 매우 유사한 피분석물/분자를 구별하는 능력이 있는 압타머를 생성하는 데에도 유용하다.
당화된 압타머 및 비- 당화된 압타머의 예
유용한 압타머의 예는 이하에 제시했으며, 여기서 XXX 및 YYY는 주어진 자가조립 단층(SAM)의 용이한 개발에 사용될 수 있는 추가 결합 기, 예컨대 비오틴, 티올, 아민 등 중의 하나 이상을 의미한다.
당화된 헤모글로빈 압타머
5' -XXX-ATCCTTCATCCCATGGTTGCATATTGATTGCCGGTTCCTTAAAT-YYY-3' (서열번호 4) 및
5' -XXX-AGGGAAAGGTGTGGGTTAGGAGCTTGAAATCGAAAAGAGGGGCG-YYY-3' (서열번호 5).
비- 당화된 헤모글로빈 압타머
5' -XXX-TTAGCGAGCTGCACACACAATGGACTCGTCATACCGTGCTGTTT-YYY-3' (서열번호 6) 및
5' -XXX-ATCTGCAGAATTCGCCCTTGCTGGTGCAGTACACACCCGGCGGG-YYY-3' (서열번호 7)
당화형 : 사람 혈청 알부민( HSA ) 압타머
5' -XXX-CTCACTCCATACTCACTTGCTGATTCGCCAACAACACACCCTTAAACAGTC-YYY-3' (서열번호 8) 및
5'-XXX-CCGAAACCAGACCACCCCACCAAGGCCACTCGGTCGAACCGCCAACACTCAC-YYY-3' (서열번호 9).
비당화형 : 사람 혈청 알부민( HSA ) 압타머
5' -XXX-CTCTCCGGCCGCTGACCCAGTTTGGAGGGGGGAGGAGGCCGGGC-YYY-3' (서열번호 10);
5' -XXX-ACGGGCACTGGTTCCATCCGCATGAGATTGATGTGTCAACTTAT-YYY-3' (서열번호 11);
5' -XXX-CAATACCGATTGTTCTAAGGGAAAACGTGTAACTTTGGATCCTT-YYY-3' (서열번호 12);
5' -XXX-TAGCGACACACGTGGCCGCTGGTTGCCGGGCGCCACGGATCCTT-YYY-3' (서열번호 13);
5 ' -XXX-CCAGCTCGTAGTGGCGTCTTTTTTTCATTTGGTACTTATCGCAA-YYY-3' (서열번호 14); 및
5' -XXX-AAATTTCATGTTCCCACACGTTCCATGCGCCCTCCTTCGAGTGC-YYY-3' (서열번호 15).
실시예 5
표적 특성을 기반으로 하여 감도 및 선택성을 최적화하기 위한 SAM 을 이용한 표면 작용기화 방법
압타머 고정화를 위한 이원성 SAM 형성의 감도 및 선택성은 더욱 증진시킬 수 있다. 예를 들어, 압타머와 SPR 표면 사이의 거리 및 결합 간격을 조절하기 위해, 2가지 다른 종류의 자가 조립형 티올 분자를 표면에 침착시킨다. 11-머캅토운데칸산(SH-(CH2)5-COOH, MUA) 및 머캅토프로판올(SH-(CH2)2-OH, MPL)의 1mM 에탄올 용액은 각각 제조한다. 각 용액은 두 성분의 총 농도를 1mM로 유지하면서 1:1 부피비로 혼합한다. MUA와 MPL의 이원성 SAM은 금 표면을 혼합 티올 용액에 1시간 동안 침지시켜 금 표면에 형성시킨다. 그 다음, 금 표면은 에탄올 및 DI수로 연속해서 세정한다.
MPL 밀도는 최적의 시그널 전달을 위해 0.5M KOH 용액(pH 13)에서 금 표면에 전기적 전위를 가하여 조절할 수 있다. 30분 동안 -0.5 내지 -1.0V의 인가된 전위는 MPL의 일부를 탈착시켜, 시그널 전달을 증진시키는 덜 밀집된 MPL 층을 초래한다. 그 후, 표면은 DI수로 즉시 세정한다.
표면을 건조한 후, N-하이드록시석신이미드(NHS)와 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 염산염(EDC)(NHS 0.2M, EDC 0.05M)의 용액으로 30분 동안 처리하여 MUA의 카르복시 기를 활성화시킨다. 그 다음, 표면을 DI수로 세척한 뒤, 5μM 압타머 용액에 침지시킨다. 압타머는 활성화된 MUA에 공유 부착된다. 마지막에, 표면은 PBS 완충액으로 세정한다.
이 표면 작용기화 방법은 SPR뿐만 아니라, 라만 및 형광 분광분석법과 같은 다른 감지 방식의 감도 및 선택성을 최적화하는 데에도 적용가능하다. 이 방법은 기존에 있는 모니터링 기술의 성능을 향상시키는 데에도 사용할 수 있다.
실시예 6
샘플에 존재하는 혼재성 물질의 영향을 감소시키는 방법
작용기화 과정의 일부로서, MPL 층은 본래 친수성이다. 이 성질은 표면에 단백질의 비특이적 흡착을 방지할 수 있다. 다른 양태에 따르면, 압타머 인식 인자는 연장 결합 접근법(extended linkage approach)을 통해 일반 SPR 감지 범위 이상으로 연장될 수 있다(여전히 바람직한 감도를 유지하면서). 이 양태에 따르면, 티올 등과 같은 종결부를 통해 다수의 결합이 수득될 수 있다. 종결부 사이에는 금 나노입자 계면을, 표면을 금 나노입자 용액에 노출시킴으로써 제조할 수 있다. 이러한 나노입자 커플링은 일반적인 SPR 검출 한계 이상의 이격 거리에서 SPR 센서에 의해 압타머 결합 반응이 검출될 수 있게 할 수 있다.
비-압타머 위치에서처럼, SPR 범위 외 길이의 치밀하게 패킹된 결합은 금속 입자 커플링이 없게 제조될 수 있다는 것도 주목해야 한다. 따라서, 이 위치에서 비-특이적 단백질 흡착 또는 다른 혼재성 성분을 만나면, 대응하는 SPR 반응이 일어나지 않을 것이고, 이로써 센서의 선택성 성능이 향상된다.
다른 양태에 따르면, 후속 MPA 층 위에는 2차 물리적 증착(PVD)이 형성될 수 있고, 이어서 열처리 됨으로써, 금속 커플링 결합을 통해 감도를 유지하면서 SPR 기초 표면으로부터 떨어져 있는 압타머를 연장시키는 유사 구조를 수득할 수 있다.
실시예 7
바이오마커 검출
본원에 기술된 방법 및 플랫폼은 또한 질병 진단 및 평가를 위한 바이오마커 검출 분야에도 유용하다.
예를 들어, 본원에 기술된 단백질(예, 당화된 단백질)에 대한 정확한 검출은 당뇨병 치료를 용이하게 하고 이와 관련된 수많은 건강관리 상태, 예컨대 심혈관 질환, 맹인, 신부전 등의 위험 증가 등을 최소화하는데 도움을 줄 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 플랫폼은 휴대용 장치에 쉽게 통합될 수 있도록 소형화할 수 있고, 이로써 이 방법 및/또는 플랫폼은 진료실이나, 가정 또는 야외에서도 직접 사용할 수 있게 된다.
당화된 단백질(혈당 준수의 척도임)의 측정은 때아닌 원격 분석을 통한 의료진의 검사 동안에만 입수용이한 것이 아니고, 환자 또는 건강간병인도 더욱 쉬운 평가방식으로 쉽게 이용가능하다. 이러한 더욱 넓게 접근가능한 측정은 결국 자가-모니터링 혈당 측정자에게 무료 정보를 제공하여, 당뇨병환자가 자신의 상태를 더욱 잘 관리하고 잠재적으로 장기간 건강 합병증을 완화시킬 수 있게 도와준다.
또한, 이러한 정보가 더욱 빈번한 기준 하에 확장된 기록 시간 창 동안 입수가능하다면, 당뇨병 집단 내 및 외에서 당 조절의 이해에 큰 영향을 미칠 수 있고, 이는 당뇨병에 대한 새롭고 및/또는 최적화된 치료 접근법들의 개발, 교육 및 훈련을 통해 혈당 조절의 더 깊은 이해를 낳을 수 있었다.
실시예 8
키트
본원에 기술된 센서는 키트 부품 형태로 제공될 수 있다. 이러한 키트로는 진단 키트, 바이오마커 발견 키트, 환경 검사 키트, 생물위험 또는 생물무기 검출 키트, 및 의학 또는 분석 화학 분야에서 표적을 검출하기 위한 키트를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 비제한적 예로, 아민-말단화된 압타머는 분자 자체로서 또는 기질에 이미 부착되어 제공될 수 있다. 추가 성분들도 포함될 수 있고, 마이크로플루이딕 칩, 참조 표준물질, 및 본 명세서를 읽은 후 숙련자가 파악할 수 있는 추가 성분을 함유할 수 있다. 또한, 본원에 개시된 방법을 수행하기 위해 키트의 성분들이 적당한 침지서 및 다른 필요 시약과 함께 제공될 수 있다. 일부 양태에 따르면, 키트는 별도의 용기들에 조성물을 함유할 수 있다. 또한, 분석 수행에 대한 지침서, 예컨대 지면 또는 전자 지원체, 예컨대 테이프 또는 CD-ROM 상의 지필 또는 청각 지침서도 키트에 포함될 수도 있다. 또한, 키트는 사용된 특정 방법에 따라 다른 포장 시약 및 물질(예, 세척 완충액 및 이의 유사물)을 함유할 수도 있다.
이상, 본 발명은 다양하고 바람직한 양태들을 참조로 하여 설명되었지만, 당업자라면 다양한 변화가 이루어질 수 있고 등가물이 본 발명의 본질적 범위에서 벗어나지 않는 구성요소로 치환될 수 있다는 것을 잘 알고 있을 것이다. 또한, 많은 변형은 본질적 범위를 벗어남이 없이 본 발명의 교시에 맞게 특정한 상황 또는 물질로 개조될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명을 수행하고자 고찰된 본원에 개시된 특정 양태에에 제한되지 않고, 특허청구범위에 속하는 모든 양태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에 언급된 모든 문헌의 인용은 이 중 임의의 문헌이 적당한 선행 기술임을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 이 문헌의 내용에 관한 표시 또는 날짜에 대한 모든 진술은 본 출원인이 입수할 수 있는 정보에 바탕을 두고 있고 이 문헌들의 내용 또는 날짝의 정확도에 관해 어떠한 인정을 하는 것은 아니다.
<110> THE UNIVERSITY OF TOLEDO <120> METHODS AND DEVICES FOR DETECTION AND MEASUREMENT OF ANALYTES <130> 1-53354/UT-D2012-15 <150> US 61/593,054 <151> 2012-01-31 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> unsure <222> (1) <223> 5'-NH2-(CH2)6 <400> 1 ggttggtgtg gttgg 15 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> unsure <222> (1) <223> 5'-NH2-(CH2)6 <400> 2 ctatcagtcc gtggtagggc aggttggggt gact 34 <210> 3 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> unsure <222> (1) <223> 5'-SH-(CH2)6 <400> 3 ccgaaaccag accaccccac caaggccact cggtcgaacc gccaacactc acccca 56 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 atccttcatc ccatggttgc atattgattg ccggttcctt aaat 44 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 5 agggaaaggt gtgggttagg agcttgaaat cgaaaagagg ggcg 44 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 6 ttagcgagct gcacacacaa tggactcgtc ataccgtgct gttt 44 <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 7 atctgcagaa ttcgcccttg ctggtgcagt acacacccgg cggg 44 <210> 8 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 8 ctcactccat actcacttgc tgattcgcca acaacacacc cttaaacagt c 51 <210> 9 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 9 ccgaaaccag accaccccac caaggccact cggtcgaacc gccaacactc ac 52 <210> 10 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 10 ctctccggcc gctgacccag tttggagggg ggaggaggcc gggc 44 <210> 11 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 acgggcactg gttccatccg catgagattg atgtgtcaac ttat 44 <210> 12 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 12 caataccgat tgttctaagg gaaaacgtgt aactttggat cctt 44 <210> 13 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 13 tagcgacaca cgtggccgct ggttgccggg cgccacggat cctt 44 <210> 14 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 14 ccagctcgta gtggcgtctt tttttcattt ggtacttatc gcaa 44 <210> 15 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 15 aaatttcatg ttcccacacg ttccatgcgc cctccttcga gtgc 44

Claims (133)

1 이상의 피분석물에 대한 센서의 감도 및/또는 선택성을 최적화하는 방법으로서,
기재에 작용기화된 표면을 형성시키기 위해 바람직한 결합 간격 및/또는 길이를 가진 자가-조립 단층(self-assembled monolayer)(SAM) 결합을 이용하여 기재에 1종 이상의 압타머(aptamer)를 결합시키는 단계를 포함하고,
상기 바람직한 결합 간격 및/또는 길이는 피분석물 및/또는 압타머 특성에 기초하여 표면플라스몬공명(SPR), 라만분광분석법 또는 형광분광분석법의 감도 및 선택성 중 적어도 하나를 최적화하도록 선택되는 방법.
제1항에 있어서, SAM 결합의 적어도 하나의 패킹 밀도 및/또는 길이가 표면플라스몬공명(SPR) 시그널에 영향을 미치는 방법.
제1항에 있어서, 결합이 이원성(binary) SAM과 환원적 탈착 과정을 통해 이루어지는 방법.
제3항에 있어서, 탈착 과정이 기재의 작용기화된 표면을 단백질 흡착에 저항성인 물질에 노출시켜, 작용기화된 표면 위에 단백질의 비-특이적 흡착을 억제하는 것을 포함하는 방법.
제4항에 있어서, 단백질 흡착 저항성 물질이 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)을 함유하는 방법.
제1항에 있어서, SAM 결합이 압타머와 안정한 결합을 형성할 수 있는 카르복시 모이어티를 가진 티올 화합물을 함유하는 방법.
제6항에 있어서, 티올 화합물이 디티오비스-N-석신이미딜 프로피오네이트(DTSP)를 함유하는 방법.
제1항에 있어서, SAM 결합이 디티오비스-N-석신이미딜 프로피오네이트(DTSP)와 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)을 사용하여 형성되고,
PEG3이 단백질의 비특이적 흡착을 방지하며,
DTSP 상의 카르복시 모이어티(moiety)가 압타머와 안정한 결합을 형성하는 방법.
제1항에 있어서, 이원성 SAM 티올 용액이 SAM 결합에 사용되는 방법.
제9항에 있어서, 이원성 SAM 티올 용액이 이 이원성 SAM의 총 농도를 약 1mM로 유지시키면서, 3-머캅토프로피온산(MPA)과 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)의 1mM 에탄올 용액을 혼합하여 제조되는 방법.
제10항에 있어서, MPA와 PEG3이 약 20:80, 약 50:50 또는 약 80:20의 비로 존재하는 방법.
제10항에 있어서, 추가로
MPG는 환원적 탈착에 의해 제거하고 PEG3은 본래대로 잔류시키는 단계;
PEG3은 어떠한 결합도 형성하지 않게 하면서, 디티오비스-N-석신이미딜 프로피오네이트(DTSP)는 압타머 상의 아미노 기와 결합하게 하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머가 3-머캅토프로피온산(MPA) 위에 고정화될 수 있는 아민-변형 압타머를 함유하는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 표면이 약 5nM 내지 약 1000nM 범위에서 최적 동력(dynamic)을 나타내는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 센서가 혼합된 길이의 스페이서 층을 포함하는 방법.
제15항에 있어서, 혼합된 길이 층이 3-머캅토프로피온산(MPA)과 조합된 11-머캅토운데칸산(MUA)을 함유하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, SAM 결합이 기재의 표면에 직접 결합할 수 있는 수용성 티올-함유 아미노산에 의해 형성되는 방법.
제17항에 있어서, 아미노산이 시스테인을 함유하는 방법.
a) 기재 위에 3-머캅토프로피온산(MPA)과 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)로 구성된 이원성 성분을 흡착시키는 단계;
b) 단계 a)의 기재로부터 MPA를 환원적 탈착시키는 단계;
c) 단계 b)의 기재 위에 디티오비스-N-석신이미딜 프로피오네이트(DTSP)를 형성시키는 단계;
d) 단계 c)의 기재 위에 적어도 1종의 압타머를 고정시키는 단계; 및
e) 단계 d)의 기재 위의 PEG3으로부터 미결합된 압타머를 제거하고, 압타머는 기재의 DTSP 층에 부착시켜 두는 단계를 포함하여, 1 이상의 피분석물에 대한 센서를 형성시키는 방법.
a) 3-머캅토프로피온산(MPA)과 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)로 구성된 이원성 성분을 에탄올 용액에서 금 표면 기재에 흡착시키는 단계;
b) 단계 a)의 기재로부터 MPA를 0.5M KOH 용액에서 환원적으로 탈착시키고, 이때 MPA와 PEG3으로 구성된 상-분리된 이원성 자가 조립 단층(SAM)의 흡착된 MPA는 용액에 -1.2V의 전위를 30분 동안 가함으로써 선택적으로 환원되는 단계;
c) PEG3 층이 상부에 있는 단계 b)의 기재를 1mM DTSP 용액에 침지시켜 DTSP 층을 기재 위에 형성시키는 단계;
d) 단계 c)의 기재 위에 적어도 1종의 압타머를 고정시키는 단계; 및
e) 단계 d)의 기재 위에 있는 PEG3으로부터 압타머를 제거하고, 기재의 DTSP 층에 부착된 압타머는 그대로 두는 단계를 포함하여, 1 이상의 피분석물에 대한 센서를 형성시키는 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 기재가 금 표면을 가진 것인 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 피분석물이 혈액에 있는 단백질의 당화된 형태를 함유하는 방법.
제22항에 있어서, 총 혈청 단백질 수준으로부터 특정한 당화된 단백질의 분획을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 피분석물이 사람 헤모글로빈, 알부민, 예컨대 사람 혈청 알부민(HSA), 면역글로불린 G(IgG), 면역글로불린 M(IgM), 피브리노겐, 및/또는 이의 단편 중 하나 이상을 함유하고, 이 피분석물은 당화된 형태이거나 비-당화된 형태인 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 피분석물이 반감기가 적어도 제2 피분석물과 다른 제1 피분석물을 최소한 포함하고, 이 방법이 추가로 제1 피분석물과 제2 피분석물을 정량하여 1 이상의 시간 기간 동안 제1 피분석물과 제2 피분석물의 수준에 관한 후향적 판단을 제공하는 단계를 포함하는 방법.
제25항에 있어서, 제1 피분석물이 헤모글로빈으로 구성되고 제2 피분석물이 면역글로불린 M(IgM)으로 구성되며, 제1 피분석물 또는 제2 피분석물 중 어느 하나가 당화된 형태 또는 비-당화된 형태로 존재하는 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 피분석물이 적어도 제1 피분석물, 적어도 제2 피분석물 및 적어도 제3 피분석물을 함유하고, 이 제1, 제2 및 제3 피분석물은 각각 반감기가 다르며, 이 방법이 추가로 제1 피분석물, 제2 피분석물 및 제3 피분석물을 정량하여 1 이상의 시간 기간 동안 제1, 제2 및 제3 피분석물의 수준에 관한 후향적 판단을 제공하는 단계를 포함하는 방법.
제27항에 있어서, 제1 피분석물이 헤모글로빈을 포함하고, 제2 피분석물이 IgM을 포함하며, 제3 피분석물이 알부민을 포함하고; 이 제1, 제2 또는 제3 피분석물 중 하나 이상이 당화된 형태 또는 비-당화된 형태로 존재하는 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 과거 평균 혈액 피분석물 수준을 모니터링하는데 사용하기 위해, 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 형성된 센서를 혈액 샘플과 접촉시키는 단계; 이 혈액에 존재하는 피분석물의 당화된 형태의 양을 측정하는 단계; 및 이 혈액 샘플 피분석물에 존재하는 피분석물의 당화된 형태의 양을 주어진 시간 틀 동안 대조군의 수준과 상관관계를 입증하는 단계를 포함하는 방법.
제29항에 있어서, 단백질의 당화된 형태의 양이 표면플라스몬공명(SPR)에 의해 측정되는 방법.
기재 위에 작용기화된 표면을 형성시키기 위해 바람직한 결합 간격 및/또는 길이를 가진 자가조립 단층(SAM) 결합을 이용하여 기재에 결합시킨 1종 이상의 압타머를 함유하고, 상기 바람직한 결합 간격 및/또는 길이가 피분석물 및/또는 압타머 특성에 기초하여, 표면플라스몬공명(SPR), 라만분광분석법, 또는 형광 분광분석법의 감도 및 선택성 중 하나 이상을 최적화하도록 선택된 것인 센서.
제31항에 있어서, SAM 결합의 적어도 하나의 패킹 밀도 및/또는 길이가 표면플라스몬공명(SPR) 시그널에 영향을 미치는 센서.
제31항 또는 제32항에 있어서, 결합이 이원성 SAM과 환원적 탈착 과정을 통해 이루어지는 센서.
제33항에 있어서, 기재의 작용기화된 표면이 작용기화된 표면 위에 단백질의 비-특이적 흡착을 억제하기에 충분하게 단백질 흡착 저항성 물질에 노출된 것을 포함하는 센서.
제34항에 있어서, 단백질 흡착 저항성 물질이 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)을 함유하는 센서.
제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, SAM 결합이 압타머와 안정한 결합을 형성할 수 있는 카르복시 모이어티를 가진 티올 화합물을 함유하는 센서.
제36항에 있어서, 티올 화합물이 디티오비스-N-석신이미딜 프로피오네이트(DTSP)를 함유하는 센서.
제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, SAM 결합이 디티오비스-N-석신이미딜 프로피오네이트(DTSP)와 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)을 사용하여 형성되고,
PEG3이 단백질의 비특이적 흡착을 방지하며,
DTSP 상의 카르복시 모이어티가 압타머와 안정한 결합을 형성하는 센서.
제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 이원성 SAM 티올 용액이 SAM 결합에 사용되는 센서.
제39항에 있어서, 이원성 SAM 티올 용액이 이 이원성 SAM의 총 농도를 약 1mM로 유지시키면서, 3-머캅토프로피온산(MPA)과 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)의 1mM 에탄올 용액을 혼합하여 제조되는 센서.
제40항에 있어서, MPA와 PEG3이 약 20:80, 약 50:50 또는 약 80:20의 비로 존재하는 센서.
제31항 또는 제41항 중 어느 한 항에 있어서, MPG는 환원적 탈착에 의해 제거되었고 PEG3은 본래대로 잔류시키는 단계; 디티오비스-N-석신이미딜 프로피오네이트(DTSP)는 압타머 상의 아미노 기와 결합했고, PEG3은 어떠한 결합도 형성하지 않는 센서.
제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머가 3-머캅토프로피온산(MPA) 위에 고정화될 수 있는 아민-변형 압타머를 함유하는 센서.
제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 표면이 약 5nM 내지 약 1000nM 범위에서 최적 동력을 나타내는 센서.
제31항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 센서가 혼합된 길이의 스페이서 층을 포함하는 센서.
제45항에 있어서, 혼합된 길이 층이 3-머캅토프로피온산(MPA)과 조합된 11-머캅토운데칸산(MUA)을 함유하는 센서.
제31항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, SAM 결합이 기재의 표면에 직접 결합할 수 있는 수용성 티올-함유 아미노산을 함유하는 센서.
제47항에 있어서, 아미노산이 시스테인을 함유하는 센서.
제31항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 최소한 기재의 표면이 금인 센서.
제31항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 내 단백질의 당화된 형태를 함유하는 피분석물을 감지하도록 구성된 센서.
제50항에 있어서, 총 혈청 단백질 수준으로부터 특정한 당화된 단백질의 분율을 측정하도록 구성된 센서.
제31항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 피분석물이 사람 헤모글로빈, 알부민, 예컨대 사람 혈청 알부민(HSA), 면역글로불린 G(IgG), 면역글로불린 M(IgM), 피브리노겐, 및/또는 이의 단편 중 하나 이상을 함유하고, 이 피분석물은 당화된 형태이거나 비-당화된 형태인 센서.
제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 피분석물이 반감기가 적어도 제2 피분석물과 다른 제1 피분석물을 최소한 포함하는 센서.
제53항에 있어서, 제1 피분석물이 헤모글로빈을 함유하고 제2 피분석물이 면역글로불린 M(IgM)을 함유하며, 제1 피분석물 및 제2 피분석물 중 어느 하나가 당화된 형태 또는 비-당화된 형태로 존재하는 센서.
제31항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 피분석물이 적어도 제1 피분석물, 적어도 제2 피분석물 및 적어도 제3 피분석물을 함유하고, 이 제1, 제2 및 제3 피분석물은 각각 반감기가 다른 것인 센서.
제55항에 있어서, 제1 피분석물이 헤모글로빈을 함유하고, 제2 피분석물이 IgM을 함유하며, 제3 피분석물이 알부민을 함유하고; 이러한 제1 피분석물, 제2 피분석물 및 제3 피분석물 중 하나 이상은 당화된 형태 또는 비-당화된 형태로 존재하는 센서.
제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 형성된 센서를 혈액 샘플과 접촉시키고; 이 혈액에 존재하는 피분석물의 당화된 형태의 양을 측정하며; 이러한 당화된 형태로 혈액 샘플 피분석물에 존재하는 피분석물의 양을 주어진 시간 틀 동안 대조군 수준과 상관성을 입증함으로써, 과거 평균 혈액 피분석물 수준을 모니터링하는데 사용되는 제31항 내지 제56항 중 어느 한 항에 기재된 센서의 용도.
제57항에 있어서, 단백질의 당화된 형태의 양이 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 측정되는 용도.
제31항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머가 특정 피분석물과 상호작용할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 센서.
제31항 내지 제56항 및 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 센서가 큰 생체분자, 작은 생체분자, 유기 분자, 소분자, 핵산, 금속 이온, 단백질, 효소, 펩타이드, 약물, 염료, 암 세포, 바이러스, 호르몬 또는 미생물 중에서 선택되는 1 이상의 피분석물과 상호작용할 수 있는 센서.
제31항 내지 제56항, 제59항 및 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 피분석물이 생물학적 샘플, 환경적 샘플, 화학적 샘플, 약학적 샘플, 식품 샘플, 농업적 샘플 및 수의학적 샘플 중 하나 이상인 센서.
제31항 내지 제56항 및 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 피분석물이 혈액 단백질인 센서.
제31항 내지 제56항 및 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 센서가 링커 특성에 기초하여 pM 내지 nM을 검출할 수 있는 조율가능한 검출 범위를 나타내는 센서.
제31항 내지 제56항 및 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 시간이 1분 미만인 센서.
제31항 내지 제56항 및 제59항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 시간이 대략 상온에서 1분 미만인 센서.
제31항 내지 제56항 및 제59항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머가 서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15 중 어느 하나의 전체 서열과 적어도 70% 동일성이 있는 DNA 서열을 함유하는 센서.
제31항 내지 제56항 및 제59항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 압타머가 본원에서 청구된 압타머 중 어느 하나를 함유하는 센서.
제31항 내지 제56항 및 제59항 내지 제67항 중 어느 한 항에 기재된 센서; 및 이 센서를 포함하는 적어도 하나의 용기를 함유하고, 이 용기에 샘플이 첨가될 수 있는, 1 이상의 피분석물을 검출하기 위한 키트.
제68항에 있어서, 추가로 1 이상의 고체 지지체, 용출액으로부터 센서를 분리시키기 위한 1 이상의 분리제, 및 센서로부터 압타머를 분리시키기 위한 1 이상의 시약을 함유하는 키트.
단일 표적 부위 결합 압타머 및 비-표적 단백질-결합 압타머를 보유하는 핵산 푸울로부터 단일 표적 부위 결합 압타머를 동정하는 방법으로서,
a) 핵산 푸울(pool)에 단일부위-표적단백질-복합체를 첨가하여, 이 푸울에 존재하는 단일 표적 부위 결합 압타머와 비-표적 단백질 결합 압타머 모두를 단일 부위 표적 단백질 복합체에 결합시켜서, 단일 표적 부위 결합 압타머 + 비-표적단백질 결합 압타머 + 단일 부위 표적 단백질 복합체를 형성시키는 단계;
b) 이 단일 표적 부위 결합 압타머 + 비-표적단백질 결합 압타머 + 단일 부위 표적 단백질 복합체를 푸울로부터 분리시키는 단계;
c) 이 단일 부위 표적 단백질 복합체로부터 단일 표적 부위 결합 압타머와 비-표적단백질 결합 압타머를 용출시키는 단계;
d) 이전 단계의 용출액에 비-표적단백질 복합체를 첨가하여, 이 비-표적 단백질 복합체에 상기 단계 c)의 용출액에 존재하는 비-표적단백질 결합 압타머를 결합시키고, 비-표적 단백질 결합 압타머 + 비-표적 단백질 복합체를 형성시키는 단계;
e) 이전 단계의 용출액으로부터 비-표적 단백질 결합 압타머 + 비-표적단백질 복합체를 분리하여, 용출액에 단일 표적 부위 결합 압타머를 잔류시키는 단계; 및
f) 용출액으로부터 단일 표적 부위 결합 압타머를 분리하고; 경우에 따라 추가로 단일 표적 부위 결합 압타머를 증폭시키는 단계를 포함하는 방법.
제70항에 있어서, 단일 표적 부위 결합 압타머가 헤모글로빈, 면역글로불린 G(IgG), 면역글로불린 M(IgM) 및 알부민 중 하나를 선택하는데 사용되는 방법.
제70항에 있어서, 단일 표적 부위 결합 압타머가 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15 중에서 선택되는 방법.
제70항에 있어서, 단일 부위 표적 단백질이 고체 지지체 위에 고정화되어 있는 방법.
제70항에 있어서, 비-표적단백질 복합체가 고체 지지체 위에 고정화되어 있는 방법.
제70항에 있어서, 고체 지지체가 자성 비드, 크로마토그래피 매트릭스, 마이크로타이터 접시(microtiter dish) 또는 어레이(array)를 포함하는 방법.
당화된 헤모글로빈에 결합하는 압타머로서, 서열번호 4 및 5로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열을 함유하는 압타머.
제76항에 있어서, 당화된 헤모글로빈이 사람 헤모글로빈인 압타머.
제76항에 있어서, 압타머가 사람 헤모글로빈에 대한 해리 상수가 100nM 이하인 압타머.
제76항에 있어서, 압타머가 적어도 하나의 화학적 변형을 포함하는 압타머.
제79항에 있어서, 변형이 당 위치에서의 화학적 치환, 뉴클레오타이드간 결합에서의 화학적 치환 및 염기 위치에서의 화학적 치환으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 압타머.
제76항에 기재된 압타머 또는 이의 염의 유효량과 이에 대한 지지체를 함유하는 검사 시약.
제76항에 기재된 압타머를 함유하는 키트.
제76항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 4 및 5로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열, 및 5'-링커 및 3'-링커 중 하나 이상을 함유하는, 당화된 헤모글로빈에 결합하는 압타머.
제83항에 있어서, 링커가 자가 조립 단층(SAM)인 압타머.
서열번호 4 및 5 중 어느 하나의 전체 서열과 적어도 70%의 동일성이 있고 사람 당화된 헤모글로빈에 결합하는 압타머.
당화된 헤모글로빈의 영역에 특이적으로 결합할 수 있고 서열번호 4 및 5로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 핵산 압타머 분자와 이에 접합된 자가 조립 단층(SAM)을 함유하는 당해의 조성물.
제86항에 있어서, 압타머 분자가 PEG화된 것인 조성물.
제87항에 있어서, PEG화된 압타머 분자가 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)을 포함하는 조성물.
제86항에 있어서, SAM 결합이 디티오비스-N-석신이미딜 프로피오네이트(DTSP) 및 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)을 사용하여 형성되는 조성물.
비-당화된 헤모글로빈에 결합하고, 서열번호 6 및 7로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열을 함유하는 압타머.
제90항에 있어서, 비-당화된 헤모글로빈이 사람 헤모글로빈인 압타머.
제90항에 있어서, 사람 헤모글로빈에 대한 해리 상수가 100nM 이하인 압타머.
제90항에 있어서, 적어도 하나의 화학적 변형을 함유하는 압타머.
제93항에 있어서, 변형이 당 위치에서의 화학적 치환, 뉴클레오타이드간 결합에서의 화학적 치환 및 염기 위치에서의 화학적 치환으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 압타머.
제90항의 압타머 또는 이의 염의 유효량 및 이에 대한 지지체를 함유하는 검사 시약.
제90항의 압타머를 함유하는 키트.
제90항에 있어서, 비-당화된 헤모글로빈에 결합하고, 서열번호 6 및 7로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열, 및 5'-링커와 3'-링커 중 하나 이상을 함유하는 압타머.
제97항에 있어서, 링커가 자가 조립 단층(SAM)인 압타머.
서열번호 6 및 7 중 어느 하나의 전체 서열과 적어도 70%의 동일성이 있고 사람 비-당화된 헤모글로빈에 결합하는 압타머.
비-당화된 헤모글로빈의 영역에 특이적으로 결합할 수 있고 서열번호 6 및 7로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 핵산 압타머 분자와 이에 접합된 자가 조립 단층(SAM)을 함유하는 당해의 조성물.
제100항에 있어서, 압타머 분자가 PEG화된 것인 조성물.
제101항에 있어서, PEG화된 압타머 분자가 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)을 포함하는 조성물.
제100항에 있어서, SAM 결합이 디티오비스-N-석신이미딜 프로피오네이트(DTSP) 및 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)을 사용하여 형성되는 조성물.
당화된 혈청 알부민에 결합하고, 서열번호 3, 8 및 9로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열을 함유하는 압타머.
제104항에 있어서, 당화된 혈청 알부민이 사람 당화된 혈청 알부민인 압타머.
제104항에 있어서, 사람 당화된 혈청 알부민에 대한 해리 상수가 100nM 이하인 압타머.
제104항에 있어서, 적어도 하나의 화학적 변형을 함유하는 압타머.
제107항에 있어서, 변형이 당 위치에서의 화학적 치환, 뉴클레오타이드간 결합에서의 화학적 치환 및 염기 위치에서의 화학적 치환으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 압타머.
제104항의 압타머 또는 이의 염의 유효량 및 이에 대한 지지체를 함유하는 검사 시약.
제104항의 압타머를 함유하는 키트.
제104항에 있어서, 당화된 혈청 알부민에 결합하고, 서열번호 3, 8 및 9로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열, 및 5'-링커와 3'-링커 중 하나 이상을 함유하는 압타머.
제111항에 있어서, 링커가 자가 조립 단층(SAM)인 압타머.
서열번호 3, 8 및 9 중 어느 하나의 전체 서열과 적어도 70%의 동일성이 있고 사람 당화된 혈청 알부민에 결합하는 압타머.
당화된 혈청 알부민의 영역에 특이적으로 결합할 수 있고 서열번호 3, 8 및 9로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 핵산 압타머 분자와 이에 접합된 자가 조립 단층(SAM)을 함유하는 당해의 조성물.
제114항에 있어서, 압타머 분자가 PEG화된 것인 조성물.
제115항에 있어서, PEG화된 압타머 분자가 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)을 포함하는 조성물.
제114항에 있어서, SAM 결합이 디티오비스-N-석신이미딜 프로피오네이트(DTSP) 및 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)을 사용하여 형성되는 조성물.
비-당화된 혈청 알부민에 결합하고, 서열번호 10, 11, 12, 13, 14 및 15로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열을 함유하는 압타머.
제118항에 있어서, 비-당화된 혈청 알부민이 사람 당화된 혈청 알부민인 압타머.
제118항에 있어서, 사람 비-당화된 혈청 알부민에 대한 해리 상수가 100nM 이하인 압타머.
제118항에 있어서, 적어도 하나의 화학적 변형을 함유하는 압타머.
제121항에 있어서, 변형이 당 위치에서의 화학적 치환, 뉴클레오타이드간 결합에서의 화학적 치환 및 염기 위치에서의 화학적 치환으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 압타머.
제118항의 압타머 또는 이의 염의 유효량 및 이에 대한 지지체를 함유하는 검사 시약.
제118항의 압타머를 함유하는 키트.
제118항에 있어서, 비-당화된 혈청 알부민에 결합하고, 서열번호 10, 11, 12, 13, 14 및 15로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열, 및 5'-링커와 3'-링커 중 하나 이상을 함유하는 압타머.
제125항에 있어서, 링커가 자가 조립 단층(SAM)인 압타머.
서열번호 10, 11, 12, 13, 14 및 15 중 어느 하나의 전체 서열과 적어도 70%의 동일성이 있고 사람 비-당화된 혈청 알부민에 결합하는 압타머.
비-당화된 혈청 알부민의 영역에 특이적으로 결합할 수 있고 서열번호 10, 11, 12, 13, 14 및 15로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 핵산 압타머 분자와 이에 접합된 자가 조립 단층(SAM)을 함유하는 당해의 조성물.
제128항에 있어서, 압타머 분자가 PEG화된 것인 조성물.
제129항에 있어서, PEG화된 압타머 분자가 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)을 포함하는 조성물.
제130항에 있어서, SAM 결합이 디티오비스-N-석신이미딜 프로피오네이트(DTSP) 및 (1-머캅토-11-운데실)트리(에틸렌 글리콜)(PEG3)을 사용하여 형성되는 조성물.
서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 정제 및 분리된 비-자연 발생의 DNA 서열.
샘플에 존재할 수 있는 적어도 하나의 혼재성 물질의 영향을 감소시키는 방법으로서,
a) 이 혼재성 물질의 비-특이적 흡착을 실질적으로 감소/방지하기에 충분한 1 이상의 친수성 기를 기재 위의 비-결합 위치에 혼입시키는 단계,
b) 기재 위에 작용기화된 표면을 형성시키기에 위해 바람직한 결합 간격 및/또는 길이를 가진 자가 조립 단층(SAM) 결합을 이용하여 기재에 압타머를 결합시키는 단계, 및
c) 압타머 결합 반응을 정상 SPR 검출 한계를 벗어난 이격 거리에서 SPR 센서로 검출하는 단계를 포함하는 방법.
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