JP2011515680A - 糖尿病のためのバイオマーカーおよびアッセイ - Google Patents

Abstract

本発明は、新規のバイオマーカーおよびその組合せを目的とする。本発明は、疾患、とりわけ糖尿病の検出およびモニタリングに関するアッセイおよびデータ評価法も提供する。とりわけ、本発明によるバイオメーカーとしては、Ｇｃ−グロブリンまたはＧｃＧ（ビタミンＤ結合タンパク質としても公知である）、β−２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）、シスタチンＣ（ｃｙｓＣ）、アルブミンならびにＨｅｍＡおよびＢなど、名目上は野生型の修飾型タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法により企図される特定の形態の糖尿病としては、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、前Ｔ１Ｄおよび前Ｔ２ＤＭが挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、単一アッセイにおいて複数のバイオマーカーを検出し、糖尿病などの疾患の判定およびモニタリングにおいてこれらのデータを正確に使用できるデータ評価法を採用する方法も提供する。

Description

糖尿病（１型糖尿病と２型糖尿病との合計）は、ほぼ２４００万人のアメリカ人を苦しめており、こうした個人のほぼ３分の１が、自分がこの疾患に罹患しているとは気づいていないと推定される。糖尿病は、控え目に見て、米国において６番目の主死因であると推定されており、少数民族集団において過度に（高率（％）で）生じることが見出されている。糖尿病の有病率は、１９９０〜２０００年の１０年間にわたりおよそ５０％ずつ増加してきたが、この先４０年の間に２倍になると推定され、多くの報告書から、国内では死亡率増加、生活の質の低下および健康管理費用の上昇に関わる流行病的な脅威であると考えられる。２００７年においては、糖尿病管理の総費用は１７４０億ドルであり、その額の大部分は専ら医療費に費やされたものと推定される。糖尿病は、毎年１２，０００〜２４，０００件の失明の新規症例の原因であり、腎不全の主因であり、透析処置のみのために１年当たり７５億ドルを超える費用のかかるおよそ１５０，０００名の末期腎疾患患者を生じさせる原因である。さらに、糖尿病は、非外傷性の下肢切断の６０％の原因でもあり（２００２年においては、８２，０００件は糖尿病によるものであった）、これは、原価計算という恐ろしい見方をすれば、肢を切除するために国家が毎年およそ８０億ドルを費やすのと同じことである。こうした深刻な結果（死亡または障害）に関わる糖尿病の影響は、早期の検出および治療により防止する（または、少なくとも遅らせる）ことができる。非薬物治療療法は、食事改善、減量および運動療法の形態の生活習慣介入が中心である。侵攻性の糖尿病の古典的な薬物治療は、スルホニル尿素またはメトホルミン、ならびに、短時間作用型および長時間作用型のインスリン製剤により行われる。より最近では、ジペプチジル・ペプチダーゼＩＶ阻害薬（例えば、ＪａｎｕｖｉａおよびＧａｌｖｕｓ）と類型化されるような新薬が、血糖値制御において大きな有望性を示している。さらに、現在、３５０を超える開発中の薬物候補（例えば、ＧＬＰ−１類似体、ＤＰＰ−ＩＶ阻害薬およびＳＧＬＴ２阻害薬）があり、このことから、糖尿病は、健康関連の研究開発の焦点という意味では唯一、癌に次ぐ第２の存在となっている。すべての治療の適時施用に重要なのは、初期段階における、好ましくは、容易に到達できる生体液中のバイオマーカーの高感度検出による診断である。同様に重要なのは（特に、開発中の多くの新薬を考慮すると）、当該治療の有効性をモニターするためのマーカーの使用である。

現在、糖尿病の検出においては、２つのバイオマーカー、すなわち、血中グルコースおよび糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）が通常使用されている。この２つのマーカーは、本質的には、血流中のグルコースの上昇の直接的（グルコース）および間接的（ＨｂＡ１Ｃ）なモニターである。各マーカーは、糖尿病を検出およびモニターするうえで有用である。グルコースは、血中グルコースの上昇の即時的な測定値であり、糖尿病の診断の補助および治療のモニタリングのいずれにおいても用いられる。ＨｂＡ１Ｃは、血中グルコースの上昇をより長期に経験していることの測定値であり、その時間尺度は、ヘモグロビン（６０〜９０日）のｉｎ ｖｉｖｏ半減期に一般に匹敵し、糖尿病の管理の進行をモニターするうえで典型的に用いられる。いずれのマーカーも単一の臨床検査室用プラットフォーム（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＳＹＮＣＨＲＯＮ）を用いて測定できるが、それぞれが異なるアッセイ・シナリオを必要とする。グルコースは、分光光度的な読み取りを行う酵素アッセイ（ヘキソキナーゼ）を用いて典型的に測定され、一方、ＨｂＡ１Ｃは、糖化ヘモグロビンの測定用の比濁免疫阻害法と組み合わせて、総ヘモグロビンの直接的な分光光度測定法を用いて測定される。加えて、いずれのマーカーについても、例えば、Ｔｈｅｒａｓｅｎｓｅ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（グルコース）およびＢｉｏ−Ｒａｄ ｉｎ２ｉｔ（ＨｂＡ１ｃ）など、いくつかのポイント・オブ・ケア装置が利用できるようになってきており、このことから、バイオマーカーおよびアッセイを、患者により身近なものに変えていく重要性が示される。

いずれのアッセイも、標的バイオマーカーにおける比較的小量の変化の正確な測定に依存している。空腹時血糖検査の間は、１００ｍｇ／ｄＬ未満の血糖値が正常とみなされ、１２６ｍｇ／ｄＬを超えるレベルは糖尿病と一致する、すなわち、およそ２５％の濃度変化である。同様の増加は経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）でも見られるが、この場合、１４０ｍｇ／ｄＬ未満が正常とみなされ、２００ｍｇ／ｄＬ超は糖尿病の指標である（およそ４０％の変化）。絶対濃度を測定する代わりに、総ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビンを測定する。６％未満のＨｂＡ１Ｃ値は、正常な個体または治療を受けている糖尿病罹患者の標的値であり、これに対し、７％超の値は、管理不足の指標であり、治療の変更を正当化する可能性がある（すなわち、相対存在量のわずか１６％の変化が重大とみなされる）。複雑な問題としては、これらの値（すなわち、空腹時グルコースが１００〜１２５ｍｇ／ｄＬ、ＯＧＴＴ＝１４０〜２００ｍｇ／ｄＬ、ＨｂＡ１ｃ＝６〜７％）にはグレー領域があり、これは「前糖尿病」状態に起因することが多い。

したがって、健康な状態を前糖尿病状態と区別する、または前糖尿病状態を糖尿病状態と区別するには、現在利用可能な単一のマーカーにより得ることができるものよりさらに正確な測定値が必要である。

したがって、適切なデータ評価法と共に用いれば糖尿病を正確に検出でき、同時に治療効果をモニターできる複数の新規のマーカーおよびアッセイを開発する必要がある。

本発明は、新規のバイオマーカーおよびその組合せを同定する。さらに、本発明は、糖尿病の検出およびモニタリングに関するアッセイおよびデータ評価法も提供する。とりわけ、本発明によるバイオマーカーとしては、名目上は野生型の修飾型タンパク質が挙げられるが、これに限定されない。遺伝子修飾体（ＧＭ、ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、翻訳後修飾体（ＰＴＭ、ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）および／または代謝改変体（ＭＡ、ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）を非限定的に含む本発明により企図されるタンパク質修飾体は、当技術分野で周知の方法により実施できる。本発明の方法により企図される特定の形態の糖尿病としては、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、前Ｔ１Ｄおよび前Ｔ２ＤＭが挙げられるが、これらに限定されない。このバイオマーカー、アッセイおよびデータ評価法は、結果として似たように修飾された形態のタンパク質がもたらされる他の障害においても意味がある。決定的に重要なのは、野生型の形態のタンパク質が存在していてもＧＭ型、ＰＴＭ型およびＭＡ型のタンパク質を明確に検出するアッセイの能力である。加えて重要なのは、単一アッセイにおいて複数のバイオマーカーを検出することができること、ならびに、糖尿病の判定およびモニタリングにおいてこれらのデータを正確に使用できるデータ評価法を採用できることである。

したがって、本発明の一態様は、Ｇｃ−グロブリンまたはＧｃＧ（ビタミンＤ結合タンパク質としても公知である）、β−２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）、シスタチンＣ（ｃｙｓＣ）、アルブミンならびにＨｅｍＡおよびＢを非限定的に含む新規のバイオマーカーを目的とする。

本発明の別の態様は、ＧＭ型、ＰＴＭ型およびＭＡ型のヒト血漿および尿タンパク質を非限定的に含むバイオマーカーを検出および／またはアッセイすることによる、疾患または障害、好ましくは糖尿病の検出およびモニタリングの方法を目的とする。

さらに別の態様では、本発明は、複数のアッセイを用いて、糖尿病に関連するＧＭ、ＰＴＭおよび／またはＭＡの組合せを定量することによる、疾患または障害、好ましくは糖尿病の検出およびモニタリングの方法を目的とする。

また別の態様では、本発明は、単一アッセイを用いて、糖尿病に関連するＧＭ、ＰＴＭおよび／またはＭＡの組合せを同時に定量することによる、疾患または障害、好ましくは糖尿病の検出およびモニタリングの方法を目的とする。

本発明の特定の態様では、ＧＭ、ＰＴＭおよびＭＡは、同じ遺伝子産物上にすべて存在し、タンパク質ベースの単一分析においてすべて検出される。

さらなるまた別の態様では、本発明の方法による複数のマーカーから得られる複数のデータを、分類アルゴリズムを用いてさらに評価して、健康状態および糖尿病状態を確定させる。

さらなる態様では、本発明の方法によるバイオマーカーをｉｎ ｖｉｖｏでの存続期間と相関させて、糖尿病状態および前糖尿病状態に関連する長期的な記録を構築する。

別の特定の態様では、本発明の方法によるバイオマーカーをｉｎ ｖｉｖｏでの存続期間と相関させて、糖尿病の管理および治療に関連する長期的な記録を構築する。

本発明のこのような、またさらなる目的は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すればより明らかとなろう。この目的のために、背景技術の項および詳細な説明にわたり多様な参考文献を引用するが、そのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。

本特許のファイルには、彩色された少なくとも１つの図面が含まれる。（１つまたは複数の）カラー図面付きの本発明のコピーは、申請のうえ必要な料金を支払えば、特許商標庁により提供されるであろう。

４名の個体由来のＧｃＧの分析の結果得られたデコンボリューション後のＥＳＩ質量スペクトルのオーバーレイを示す図である。このスペクトルは、試験中、調査した１００名超の個体の分析の結果得られたデータの代表的なものである。示してあるのは、３つの主要な対立遺伝子産物（Ｇｃ−１Ｆ、Ｇｃ−１ＳおよびＧｃ−２）、ならびに、低頻度の変異対立遺伝子（「変異体」）由来のシグナルである。これらの個体の各対立遺伝子産物（Ｇｃ−２を除く）に由来するΔｍ＝＋６５６Ｄａでの天然グリコシル化も観察される。データは、集団に適用した場合のＧｃＧの標的化「トップダウン」分析の結果得られる情報の程度を示すために載せてある。 健康者（左側のカラム、ｎ＝５０個体）およびＴ２ＤＭ（右側のカラム、ｎ＝５２個体）におけるＧｃＧの対立遺伝子の出現頻度を示す図である。Ｇｃ−１ｓ対立遺伝子は、Ｔ２ＤＭ対象においてはおよそ５倍高い出現率で観察される。 ３名の個体（遺伝子型は全員Ｇｃ−１ｆ／１ｆ）：健康者（赤）、Ｔ２ＤＭ（緑）およびｉｄ−Ｔ２ＤＭ（青）由来のＧｃＧの質量スペクトルのオーバーレイを示す図であり、Ｔ２ＤＭに関しては糖化ＧｃＧが上昇していることが示されている。挿入図：健康者（赤、ｎ＝５０）、Ｔ２ＤＭ（緑、ｎ＝３７）およびｉｄ−Ｔ２ＤＭ（青、ｎ＝１５）について総ＧｃＧ（積分値）に正規化された糖化ＧｃＧの分布の箱ひげ図であり、点は、対象の平均値を表す。平均すると、糖尿病個体は、相対的な糖化において４〜５倍の増加を呈した。 ３名の個体：健康者（赤）、Ｔ２ＤＭ（緑）およびｉｄ−Ｔ２ＤＭ（青）由来のｂ２ｍの質量スペクトルのオーバーレイを示す図であり、Ｔ２ＤＭに関しては糖化レベルが上昇していることが示されている。挿入図：健康者（赤、ｎ＝５０）、Ｔ２ＤＭ（緑、ｎ＝３７）およびｉｄ−Ｔ２ＤＭ（青、ｎ＝１５）について総ｂ２ｍ（積分シグナル）に正規化された糖化ｂ２ｍの分布の箱ひげ図である。平均すると、糖尿病個体は、糖化による相対シグナルにおいて２〜５倍の増加を呈した。 図３および４を得るために用いたのと同じ試料に由来するｃｙｓＣの質量スペクトルのオーバーレイを示す図である。健康者（赤）と比較して、Ｔ２ＤＭ（緑）およびｉｄ−Ｔ２ＤＭ（青）において糖化の上昇が示されている。挿入図：健康者（赤、ｎ＝５０）、Ｔ２ＤＭ（緑、ｎ＝３７）およびｉｄ−Ｔ２ＤＭ（青、ｎ＝１５）について総ｃｙｓＣ（積分シグナル）に正規化された糖化ｃｙｓＣの分布の箱ひげ図である。平均すると、糖尿病個体は、糖化による相対シグナルにおいて３〜４倍の増加を呈した。 ２名の個体：健康者（赤）およびＴ２ＤＭ（緑）由来のＣ−ペプチドの質量スペクトルのオーバーレイを示す図である。ｄｅｓ（ＧｌｕＡｌａ）変異体の相対存在率は、健康個体（１．７％、分子量＝２８１９）のものと比較して、Ｔ２ＤＭ個体（８．１％、分子量＝２８１９）において有意に高いことが観察される。挿入図：試料中に存在するすべてのアイソフォームに対するｄｅｓ（ＧｌｕＡｌａ）Ｃ−ペプチドの量の比率（％）を表す箱ひげ図である。健康者の平均は４．８％であり、Ｔ２ＤＭについては９．３％であった。 図５を得るために用いたのと同じ試料に由来するＴＴＲの質量スペクトルのオーバーレイを示す図である。ＴＴＲスルホン化の上昇（天然型のＴＴＲに対し）を、健康者（赤）との比較で、Ｔ２ＤＭ（緑）およびｉｄ−Ｔ２ＤＭ（青）において示すものである。挿入図：健康者（赤、ｎ＝５０）、Ｔ２ＤＭ（緑、ｎ＝３７）およびｉｄ−Ｔ２ＤＭ（青、ｎ＝１５）について、スルホン化ＴＴＲ対天然ＴＴＲの比率の分布の箱ひげ図である。平均すると、糖尿病個体は、健康個体と比較して、スルホン酸化ＴＴＲ対天然ＴＴＲの比率においておよそ１０倍の増加を呈した。 １０２名分の試料中のｂ２ｍ、ｃｙｓＣおよびＧｃＧの相対的な糖化を示す図。５０名分の健康者試料（赤）が、１５名分のｉｄ−Ｔ２ＤＭ試料（青）および３７名分の非ＩＤ−Ｔ２ＤＭ試料（緑）と空間分離されていることから、組み合わせて使用されるタンパク質糖化バイオマーカーは、健康患者をＴ２ＤＭ患者と区別するのに役立つ可能性があることが示唆される。ＧｃＧ値は遺伝子型とは無関係であることに注意。 図９に示す１０２個のデータ点の主成分分析から得られる評点プロットを示す図であり、赤の点は健康者試料を示し、青の点はＩＤ−Ｔ２ＤＭ試料を示し、緑の点は非ＩＤ−Ｔ２ＤＭ試料を示す。主成分１および２（この図にプロットしてある）は、生データ・セット中で観察される分散の９４％を説明し、ＳＩＭＣＡベースの分類のためのモデルを得るのに役立つ。 ＧｃＧ遺伝子型、および、健康（赤）個体、Ｔ２ＤＭ（緑）個体およびｉｄ−Ｔ２ＤＭ（青）個体におけるＧｃＧの単一分析の結果得られる各データ点を付したＧｃＧ糖化の概要を示す図。影付きの破線は、Ｔ２ＤＭの指標としての、遺伝子型に依存する糖化についての予言的な参考レベルを表す（注意：健康対照群は１Ｓ／１Ｓ遺伝子型を呈さなかったので、値は示していない）。数字（１〜４）は、本文中に記載した個体についての値を示すものである。 複数のＭＡを用いた時間的モニタリング。３つのマーカーのそれぞれの相対的な糖化（Ｉ糖化／Ｉ全体×１００）についての値を、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期に対して（過去にさかのぼり）プロットしてある図である。破線で結んだ値は、健康（四角（訳注：逆三角形の誤りと思われる））対象、Ｔ２ＤＭ（逆三角形（訳注：四角の誤りと思われる））対象およびｉｄ−Ｔ２ＤＭ（丸）対象について得られた平均値である。個体１（×印）および２（スラッシュ）は、特に採血の数日前は比較的良好な維持を示している。個体３（逆スラッシュ）および４（丸）は、個体のそれぞれのカテゴリーの内外で変動することが観察され、このことから、より積極的または厳格な療法の必要性が示唆される。個体５（三角）は、数カ月にわたり比較的良好な維持を示す。 健康者およびＴ２ＤＭ患者（スラッシュ）から得られた（示したとおりの）Ａｌｂ、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＣ１およびＴＴＲの質量スペクトルのオーバーレイを示す図である。挿入図：酸化率（％）（すべての種の積分値に正規化された糖化イオン・シグナルの積分値として１タンパク質当たりで測定）を示す分布の箱ひげ図であり、健康者（ｎ＝５０）およびＴ２ＤＭ（スラッシュ、ｎ＝５２）。 健康者およびＴ２ＤＭ患者（スラッシュ）から得られた（示したとおりの）Ａｌｂ、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＣ１およびＴＴＲの質量スペクトルのオーバーレイを示す図である。挿入図：酸化率（％）（すべての種の積分値に正規化された糖化イオン・シグナルの積分値として１タンパク質当たりで測定）を示す分布の箱ひげ図であり、健康者（ｎ＝５０）およびＴ２ＤＭ（スラッシュ、ｎ＝５２）。 健康者およびＴ２ＤＭ患者（スラッシュ）から得られた（示したとおりの）Ａｌｂ、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＣ１およびＴＴＲの質量スペクトルのオーバーレイを示す図である。挿入図：酸化率（％）（すべての種の積分値に正規化された糖化イオン・シグナルの積分値として１タンパク質当たりで測定）を示す分布の箱ひげ図であり、健康者（ｎ＝５０）およびＴ２ＤＭ（スラッシュ、ｎ＝５２）。 健康者およびＴ２ＤＭ患者（スラッシュ）から得られた（示したとおりの）Ａｌｂ、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＣ１およびＴＴＲの質量スペクトルのオーバーレイを示す図である。挿入図：酸化率（％）（すべての種の積分値に正規化された糖化イオン・シグナルの積分値として１タンパク質当たりで測定）を示す分布の箱ひげ図であり、健康者（ｎ＝５０）およびＴ２ＤＭ（スラッシュ、ｎ＝５２）。 健康者およびＴ２ＤＭ（スラッシュ）由来のＣ−ペプチドのＭＳＩＡスペクトルを示す図である。 健康個体およびＴ２ＤＭ（スラッシュ）個体由来のインスリンの陽イオンＭＳＩＡスペクトルを示す図である。 表１に掲載のマーカーのうち８つ（訳注：９つの誤りと思われる）についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す図であり、内訳は、Ｓ−スルホン化ＴＴＲ（Ｓ−スルホン化ＴＴＲ（訳注：スラッシュの誤りと思われる））、酸化ＡＰＯ Ｃ１（逆スラッシュ）、糖化ＧｃＧ（三角）、酸化アルブミン（逆三角）、糖化アルブミン（四角）、糖化ＣｙｓＣ（×印）、糖化ヘモグロビン（丸）、糖化Ｂ２ｍ（正弦波線）および酸化ＡｐｏＡｉ（尖った波線）である。 糖化のＰＣ１（４つのタンパク質の特質的な糖化値を用いたＰＣＡから）および酸化のＰＣ１（３つのタンパク質において観察された特質的な酸化のＰＣＡから得られる）から得られた糖化対酸化のプロットを示す図である。Ｔ２ＤＭ個体は、×を用いて示す。

本発明の一実施形態は、Ｇｃ−グロブリンまたはＧｃＧ（ビタミンＤ結合タンパク質としても公知である）、β−２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）、シスタチンＣ（ｃｙｓＣ）、アルブミンならびにＨｅｍＡおよびＢを非限定的に含む新規のバイオマーカーを目的とする。

「バイオマーカー」とは、生物学的状態の指標として用いられる物質を意味する。本出願中で使用する場合、バイオマーカーは、正常な生物学的過程、病因となる過程、または治療的介入への薬理学的応答の指標として客観的に測定および評価できる特徴である。本発明により企図されるとりわけ好ましいバイオマーカーは、その検出が特定の疾患または障害の状態を示す物質であり、そのような疾患または障害としては、糖尿病、心血管疾患、冠動脈疾患および末梢動脈疾患、慢性の閉塞性肺疾患、脳卒中、癌、アルツハイマー病、ニューロパチー、網膜症および栄養欠乏症が挙げられるがこれらに限定されず、単独であっても、または糖尿病と関連のある併存疾患としてのものであってもいずれでもよい。さらに、本発明は、疾患のリスクもしくは進行と、または、受ける治療に対する疾患の感受性と相関するタンパク質の発現または状態の変化を示すバイオマーカーを企図する。

本発明によれば、バイオマーカーは、遺伝的に修飾（ＧＭ）されていても、翻訳後修飾（ＰＴＭ）されていても、または代謝的に改変（ＭＡ）されていてもよい。企図されるバイオマーカーは、一般的な生物学的環境（例えば、血漿、血清、尿、唾液、涙、汗または組織抽出物）から検出される遺伝子産物中で見出される。遺伝子修飾体としては、ヌクレオチド多型、点突然変異体、ハプロタイプ、対立遺伝子変異体およびスプライス変異体を挙げることができるが、これらに限定されない。翻訳後修飾体としては、一般的または特定の生理に関連する遺伝子産物の酵素的および非酵素的な修飾体が挙げられるが、これらに限定されない。代謝改変体としては、疾患の病態生理に関連する遺伝子産物の酵素的および非酵素的修飾体が挙げられるが、これらに限定されない。

さらに、本発明は、疾患または障害の検出およびモニタリングにおいて使用するためのデータ評価のアッセイおよび／または方法も企図しており、そのような疾患または障害としては、糖尿病、心血管疾患、冠動脈疾患および末梢動脈疾患、慢性の閉塞性肺疾患、脳卒中、癌、アルツハイマー病、ニューロパチー、網膜症および栄養欠乏症が挙げられるがこれらに限定されず、単独であっても、または糖尿病と関連のある併存疾患としてのものであってもいずれでもよい。好ましくは、本発明は、糖尿病の検出およびモニタリングに使用するためのデータ評価のアッセイおよび／または方法を目的とする。

したがって、本発明の別の実施形態は、ＧＭ型、ＰＴＭ型およびＭＡ型のヒト血漿および尿タンパク質を非限定的に含むバイオマーカーを検出および／またはアッセイすることによる、疾患または障害の検出およびモニタリングの方法を目的とする。本発明により検出および／またはモニターされることになる疾患または障害としては、糖尿病、心血管疾患、冠動脈疾患および末梢動脈疾患、慢性の閉塞性肺疾患、脳卒中、癌、アルツハイマー病、ニューロパチー、網膜症および栄養欠乏症が挙げられるがこれらに限定されず、単独であっても、または糖尿病と関連のある併存疾患としてのものであってもいずれでもよい。好ましくは、本発明は、ＧＭ型、ＰＴＭ型およびＭＡ型のヒト血漿および尿バイオマーカー・タンパク質を検出および／またはアッセイすることによる糖尿病の検出およびモニタリングの方法を目的とする。

本発明によるアッセイは、従来の形態、または従来にない形態の遺伝子産物分析を両方とも含むことができ、このような分析としては、免疫測定（例えば、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ））、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）、二次元ゲル電気泳動（２Ｄ−ＧＥ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および質量分析（ＭＳ）またはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明によるデータ評価の方法としては、線形回帰、遺伝子型および表現型の値の加重および非加重による評価、主成分分析（ＰＣＡ）、ＳＩＭＣＡ法（ｓｏｆｔ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｃｌａｓｓ ａｎａｌｏｇｉｅｓ）、ならびに遺伝子型および表現型の値対疾患状態対時間（またはタンパク質の半減期）などの時間依存性評価法が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明による糖尿病の検出および診断としては、リスク因子および発症マーカーの定量ならびにその組合せが挙げられるが、これらに限定されない。本発明により企図される検出および診断には、健康状態、前糖尿病状態および糖尿病状態の間を正確に区別し、同時に、健康状態、前糖尿病状態または糖尿病状態を他の疾患と区別するための複数のマーカーの組合せ使用も含まれる。

本発明による「モニターすること」とは、糖尿病の状態または進行、ならびに、治療に対する応答を確認するための１つまたは複数のマーカーの使用を包含する。

さらに別の実施形態では、本発明は、糖尿病に関連するＧＭ、ＰＴＭおよび／またはＭＡの組合せを定量するために複数のアッセイを用いることによる、疾患または障害、好ましくは糖尿病の検出およびモニタリングの方法を目的とする。

また別の実施形態では、本発明は、糖尿病に関連するＧＭ、ＰＴＭおよび／またはＭＡの組合せを同時に定量するための単一アッセイを用いることによる、疾患または障害、好ましくは糖尿病の検出およびモニタリングの方法を目的とする。

本発明の特定の実施形態では、ＧＭ、ＰＴＭおよびＭＡは、同じ遺伝子産物上にすべて存在し、タンパク質ベースの単一分析においてすべて検出される。

さらにまた別の実施形態では、本発明の方法による複数のマーカーから得られた複数のデータを、分類アルゴリズムを用いてさらに評価して、健康状態および糖尿病状態を確定させる。

さらなる実施形態では、本発明の方法によるバイオマーカーをｉｎ ｖｉｖｏでの存続期間と相関させて、糖尿病状態および前糖尿病状態に関連する長期的な記録を構築する。

本発明によれば、以下の方法によりＴ２ＤＭを検出およびモニターする。この方法には、結果として対象の体液中の特定のタンパク質を検出する以下のステップが含まれる。血漿、血清、尿、唾液、涙、汗または組織抽出物は、すべて、適当な体液の例である。まず、対象から体液試料を採取する。一実施形態では、採取する体液試料は血液である。採取後、エレクトロスプレー・イオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を用いた質量分析免疫測定法（ＭＳＩＡ）を実施するために、体液を調製する。ＥＳＩ−ＭＳを用いたＭＳＩＡによる特定の調製およびテストについては、下記の実施例２でさらに詳しく説明する。

別の実施形態では、採取後、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化による飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）を用いたＭＳＩＡを実施するために体液を調製する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いたＭＳＩＡによる特定の調製およびテストについては、下記の実施例２でさらに詳しく説明する。

特定の質量分析計により得られる結果をいくつかの糖化マーカー（ＧｃＧ、ｂ２ｍ、ｃｙｓＣ、ＡｌｂならびにＨｅｍＡおよびＢなど）用に収集した。さらに、特定の質量分析計により得られる結果をいくつかの酸化ストレス・マーカー、（アルブミン（Ａｌｂ）、アポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）、アポリポタンパク質Ｃ１（ＡｐｏＣ１）およびトランスチレチン（ＴＴＲ）など）用に収集した。さらに、特定の質量分析計により得られる結果を２つの酵素シグナル・マーカー（Ｃ−ペプチド（Ｃ−ｐｅｐ）およびインスリンなど）用に収集した。

Ｔ２ＤＭ対象における糖化マーカーは、健康対象の標的タンパク質に対するＭＳ結果における正の質量変化として出現する。これについては、下記の実施例４でさらに説明する。具体的には、糖化の比率の上昇をｂ２ｍ、ｃｙｓＣ、ＧｃＧ、ＡｌｂならびにヘモグロビンＡ鎖およびＢ鎖（（ＨｅｍＡおよびＢ）、その成分はＨｂＡ１Ｃである）において観察した。

Ｔ２ＤＭ対象における酸化ストレス・マーカーは、健康対象の標的タンパク質に対するＭＳ結果における正の質量変化として出現する。これについては、下記の実施例８でさらに説明する。具体的には、特質的な酸化は、選抜された高密度リポタンパク質成分であるＡｐｏＡ１、ＡｐｏＣ１だけでなくＴＴＲおよびＡｌｂにおいても観察された。

Ｔ２ＤＭ対象における酵素マーカー、具体的にはＣ−ペプチドおよびインスリンは、一定のタンパク質が切断された負の質量変化の形で出現する。これについては、下記の実施例７でさらに説明する。具体的には、Ｃ−ｐｅｐおよびインスリンの切断型変異体は、Ｔ２ＤＭ対象におけるほうが、高頻度でより多量に観察された。

受信者動作特性法（ＲＯＣ）を用いた最初の一変量評価、ならびに、主成分分析（ＰＣＡ）およびＳＩＭＣＡ法（ｓｏｆｔ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｃｌａｓｓ ａｎａｌｏｇｉｅｓ）を用いた全データの多変量評価の結果、健康対象とＴ２ＤＭを有する対象との間が良好に分離された。このデータは、特定の対象における健康対Ｔ２ＤＭの軌跡をモニターするために使用できる。さらに、このデータは、過去数日にわたる対象の糖化レベルを後ろ向き分析するために使用できる。

以下の非限定的な実施例により本発明をさらに例証する。

疾患対象：健康者、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）およびインスリン依存性２型糖尿病（ｉｄ Ｔ２ＤＭ）
以下に示すのは、健康個体（病気を有さないと思われる、ｎ＝５０）、Ｔ２ＤＭ個体（Ｔ２ＤＭと診断され食事、運動および非インスリン薬により治療、ｎ＝３７）およびｉｄ−Ｔ２ＤＭ個体（インスリン依存性、Ｔ２ＤＭと診断され、インスリン投与により治療、ｎ＝１５）から成る対象の集団スクリーニングにより得られる遺伝子、翻訳後および代謝改変体の例である。８時間の絶食後、これらの個体からＥＤＴＡ血漿試料を採取（インフォームド・コンセントおよびＩＲＢ認可の下で）し、以下に記載の方法を用いて分析するまで−７０℃で保管した。各糖尿病個体について、性別、人種、ＢＭＩ、病歴および現行の治療の記録も入手した。

集団プロテオミクスおよびＴ２ＤＭ
表１は、１５種の血液由来マーカー（タンパク質およびタンパク質変異体）の例示的な一覧を示すものであり、それぞれが、対象を、健康者とＴ２ＤＭとの間で区別できる。このマーカーのすべてが、Ｔ２ＤＭの診断または治療において影響を及ぼすことが公知の生理学的経路と関連のあるＰＴＭ型の相対的な調節によるものであることに注意することが重要である。

ヘモグロビンＭＳＩＡは、ＨｂＡ１Ｃと同時に、ヘモグロビンＢ鎖の第２のＰＴＭ（＋１２０Ｄａで）およびＡ鎖の糖化（＋１６２Ｄａ）を検出する。特質的な酸化を、すべての修飾型（例えば、＋１１９Ｄａでのシステイン化）に対する天然型の枯渇としてモニターする。このアッセイを用いて、特質的な糖化も（同時に）モニターする。特質的な酸化は、ｃｙｓ１０で生じるスルホン化の増加（＋８０Ｄａ）である。酸化は、メチオニン（＋１６〜＋４８Ｄａ）で生じる。比率（％）は総酸化能力を反映する。ＡｐｏＣ１は、完全なものと、Ｎ末端のＴｈｒＰｒｏで切断されているものとの２つの形態を有する。Ｃ−ｐｅｐは、Ｎ末端のＧｌｕＡｌａで切断されており、Ｃ−ペプチド（３−３１）と呼ばれる。インスリンは、Ｃ末端のＴｈｒ（ｂ鎖）で切断される。このアッセイは、質量が変化しているインスリン製剤、例えば、ＬａｎｔｕｓおよびＮｏｖｏｌｏｇも容易に検出する。

表１の「観察」カラム中では、記載されている比率（％）は、各タンパク質についての特定の種の測定値である。β−２ミクログロブリンは、相対的な糖化の１形態を測定する。シスタチンＣは、相対的な糖化の１形態を測定する。ＧｃＧは、相対的な糖化の１形態、および、Ｔ２ＤＭと相関のあった、遺伝子型データの３つのハプロタイプを測定する。アルブミンは、相対的な糖化の２形態および酸化の１形態（システイン化）を測定する。ヘモグロビンＡおよびＢは、ヘモグロビンＡの相対的な糖化の１形態、および、ヘモグロビンＢ鎖の２形態を測定する。ＴＴＲは、相対的な酸化の２形態、すなわちシステイン化およびスルホン化を測定する。ＡｐｏＡ１は、相対的な酸化の３形態を測定する。ＡｐｏＣ１は、相対的な酸化の２形態を測定する。Ｃ−ペプチドは、相対的な切断体の２形態、すなわちｄｅｓ（Ｅ）およびｄｅｓ（ＥＡ）を測定する。インスリンは、内因性インスリンの相対的な切断体の１形態、ｂ鎖ｄｅｓ（３０）、および、投与された形態のＮｏｖｏｌｏｇおよびＬａｎｔｕｓならびにそれらの切断型の相対的な寄与を測定する。

この調査は、５０名の健康個体（すなわち、病気を有さないと思われる個体）および５２名のＴ２ＤＭ患者（Ｔ２ＤＭと診断され食事、運動および非インスリン薬により治療された３７名の個体と、Ｔ２ＤＭと診断され、インスリン投与により治療された１５名のインスリン依存性個体とから成る）から成る対象を用いて実施した。８時間の絶食後、これらの個体からＥＤＴＡ血漿試料を採取し、以下に記載の方法を用いて分析するまで−７０℃で保管した。各糖尿病個体について、性別、人種、ＢＭＩ、病歴および現在の治療の記録も入手した。

以下の要領でエレクトロスプレー・イオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を用いてＭＳＩＡを実施した。ヒト血漿試料（１２５μＬ）は、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）中で２倍に希釈し、９６ウェルの滴定プレート中に載せた。最適なタンパク質に対するウサギ抗ヒト・ポリクローナルＩｇＧを用いて調製した抽出ピペットの先端を取り付けたロボット・システムを用いて、タンパク質（および変異体）を抽出した。抽出後、ＨＢＳ、水、２Ｍ酢酸アンモニウム／アセトニトリル（３：１ ｖ／ｖ）、次いで再度水を用いてすすぐことにより、非特異的に結合したタンパク質を除去した。次に、５μＬのギ酸／アセトニトリル／水（９／５／１ ｖ／ｖ／ｖ）を先端（固体支持体を覆う）中に吸引することにより、保持されたタンパク質を溶出させ、短時間（およそ３０秒）の後、溶出されたタンパク質を清潔な滴定プレートのウェル中に排出させた。次に、ＥＳＩ−ＭＳに備えて溶出剤を水で２倍に希釈した。典型的には、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳの１日の処理量に合うように、２４個の試料を並行して加工した（９６個すべてではなく）。Ｅｋｓｉｇｅｎｔ ｎａｎｏＬＣ^＊１Ｄ低流量ＨＰＬＣと連動して作動するＢｒｕｋｅｒ ｍｉｃｒｏＴＯＦｑを用いて質量分析を実施した。この分析には、伝統的なＬＣではなく、捕捉・溶出型の試料濃度／溶媒交換を使用した。マイクロリットル・ピックアップ・モードで試料５マイクロリットルを、Ｓｐａｒｋ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｅｎｄｕｒａｎｃｅオートサンプラーにより注入し、６ポートの迂回弁上に一方向で流れるように構成されたタンパク質キャップトラップ（Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）上に、Ｅｋｓｉｇｅｎｔ ｎａｎｏＬＣ^＊１Ｄにより１０μＬ／分（０．１％ギ酸を含有する９０／１０ 水／アセトニトリル、溶媒Ａ）で載せた。２分後、迂回弁の位置が自動的に切り替えられ、キャップトラップ・カートリッジを越える流れを１μＬ／分の溶媒Ａ（ＥＳＩの入り口に直接流れる）に変え、これを、０．１％ギ酸を含有する１０／９０ 水／アセトニトリルに８分にわたり即時に傾斜させた。１０．２分までに運転を完了させ、流れを１００％溶媒Ａに戻した。すべてのイオンを質量分析計の４段階に通し（事前選択なし）、５００〜３０００ｍ／ｚの範囲において飛行時間イオンをモニターする（５ｋＨｚでサンプリング）ことにより、ＴＯＦ単独モードでデータを入手した。およそ１．５分のスペクトル記録を、タンパク質溶出のクロマトグラフィーのピーク頂点を挟んで平均した。デコンボリューションされたピークがあれば、そのいずれかの側について、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ’ ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ ｖ３．４ソフトウェアを用いてＥＳＩ帯電状態のエンベロープを１０００Ｄａの質量範囲にデコンボリューションした。デコンボリューション後のスペクトルからベースラインを減算し、すべてのピークを積分した。

マトリックス支援レーザー／脱離イオン化による飛行時間質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）を用いてＭＳＩＡを実施した。手短に言えば、所望のタンパク質に対するウサギ抗ヒト・ポリクローナルＩｇＧを用いて誘導体化した抽出ピペットの先端を取り付けたロボット・システムを用いて、タンパク質および変異体を血漿から抽出した。抽出後、ＨＢＳ、水、２Ｍ酢酸アンモニウム／アセトニトリル（３：１ ｖ／ｖ）、次いで再度水を用いてすすぐことにより、非特異的に結合したタンパク質を除去した。次に、５μＬのマトリックス溶液（２：１ ｖ／ｖ、Ｈ_２Ｏ：ＡＣＮ、シナピン酸で飽和、ＴＦＡを０．４％加えたもの）を先端（固体支持体を覆う）中に吸引し、９６ウェルのフォーマット済みＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ標的の表面上にマトリックス／タンパク質混合物を堆積させることにより、保持されたタンパク質を溶出させた。遅延抽出線形モードおよびレーザー（Ｎｄ：ＹＡＧ）繰返し率２００Ｈｚで作動するＢｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩＩを用いて質量分析を実施した。試料調製物内の異なる部位から取得した２５×１００レーザーショット・スペクトル［それぞれがＳ／Ｎ＞１０、分解能（ＦＷＨＭ）＞１，０００の基準を満たす］を合計することにより、スペクトル（２，５００レーザーショット）を得た。ベースライン減算に次いで、所望の各シグナルのシグナル積分（ベースラインに）によりスペクトルを加工した。変異体形態のタンパク質の積分値を、観察される全形態のタンパク質の積分値に正規化することにより、各個体について変異体の相対値（イオン・シグナル）を定量した。

Ｇｃ−グロブリン（ａｋａビタミンＤ結合タンパク質）：遺伝子修飾体および翻訳後修飾体
Ｇｃ−グロブリンまたはＧｃＧ（ビタミンＤ結合タンパク質としても公知である）は、名目分子量がおよそ５１ｋＤａ、血漿中の推定濃度が２００〜６００ｍｇ／Ｌの血漿タンパク質である。ＧｃＧは、３つの高頻度の対立遺伝子変異体（Ｇｃ−１Ｆ、Ｇｃ−１ＳおよびＧｃ−２）、ならびに、他の低頻度の変異体として、ヒト集団において存在することが公知である。ＧｃＧの主な生物学的役割としては、ビタミンＤ代謝産物輸送、脂肪酸輸送、アクチン隔離およびマクロファージ活性化が挙げられる。したがって、このタンパク質の修飾体は、広範囲に及ぶ結果の生物学的事象を構成できる。

調査過程にわたり、免疫親和性抽出に次いでエレクトロスプレー・イオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を用いて、血漿から、ＧｃＧの遺伝子型および表現型の変異体を分析した。ヒト血漿試料（１２５μＬ）は、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）中で２倍に希釈し、９６ウェルの滴定プレート中に載せた。ウサギ抗ヒトＧｃＧポリクローナルＩｇＧを用いて調製した抽出ピペットの先端を取り付けたロボット・システムを用いて、ＧｃＧ（および変異体）を抽出した。抽出後、ＨＢＳ、水、２Ｍ酢酸アンモニウム／アセトニトリル（３：１ ｖ／ｖ）、次いで再度水を用いてすすぐことにより、非特異的に結合したタンパク質を除去した。次に、５μＬのギ酸／アセトニトリル／水（９／５／１ ｖ／ｖ／ｖ）を先端（固体支持体を覆う）中に吸引することにより、保持されたタンパク質を溶出させ、短時間（およそ３０秒）の後、溶出されたタンパク質を清潔な滴定プレートのウェル中に排出させた。次に、ＥＳＩ−ＭＳに備えて、溶出剤を水で２倍に希釈した。典型的には、ＥＳＩ−ＭＳの１日の処理量に合うように、２４個の試料を並行して加工した（９６個すべてではなく）。Ｅｋｓｉｇｅｎｔ ｎａｎｏＬＣ^＊１Ｄ低流量ＨＰＬＣと連動して作動するＢｒｕｋｅｒ ｍｉｃｒｏＴＯＦｑを用いて質量分析を実施した。この分析には、伝統的なＬＣではなく、捕捉・溶出型の試料濃度／溶媒交換を使用した。マイクロリットル・ピックアップ・モードで試料５マイクロリットルを、Ｓｐａｒｋ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｅｎｄｕｒａｎｃｅオートサンプラーにより注入し、６ポートの迂回弁上に一方向で流れるように構成されたタンパク質キャップトラップ（Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）上に、Ｅｋｓｉｇｅｎｔ ｎａｎｏＬＣ^＊１Ｄにより１０μＬ／分（０．１％ギ酸を含有する９０／１０ 水／アセトニトリル、溶媒Ａ）で載せた。２分後、迂回弁の位置が自動的に切り替えられ、キャップトラップ・カートリッジを越える流れを１μＬ／分の溶媒Ａ（ＥＳＩの入り口に直接流れる）に変え、これを、０．１％ギ酸を含有する１０／９０ 水／アセトニトリルに８分にわたり即時に傾斜させた。１０．２分までに運転を完了させ、流れを１００％溶媒Ａに戻した。すべてのイオンを質量分析計の４段階に通し（事前選択なし）、５００〜３０００ｍ／ｚの範囲において飛行時間イオンをモニターする（５ｋＨｚでサンプリング）ことにより、ＴＯＦ単独モードでデータを入手した。およそ１．５分のスペクトル記録を、ＧｃＧ溶出のクロマトグラフィーのピーク頂点を挟んで平均した。デコンボリューションされたピークがあれば、そのいずれかの側について、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ’ ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ ｖ３．４ソフトウェアを用いてＥＳＩ帯電状態のエンベロープを１０００Ｄａの質量範囲にデコンボリューションした。デコンボリューション後のスペクトルからベースラインを減算し、すべてのピークを積分した。相対ピーク量をさらに計算および定量するために、表にした質量スペクトルのピーク面積をスプレッドシートにエクスポートした。

図１は、４名の個体由来のＧｃＧの分析の結果得られたデコンボリューション後のＥＳＩ質量スペクトルのオーバーレイを示すものであり、このスペクトルは、単一アッセイの結果得られる情報の程度を示すために載せてある。シグナルは、試験過程の間共通して観察された３つのホモ接合遺伝子型について観察される。示してあるのは、Ｇｃ−１Ｆ（分子量_計算＝５１１８８．２）、Ｇｃ−１Ｓ（分子量_計算＝５１２０２．２）およびＧｃ−２（分子量計算＝５１２１５．３Ｄａ）である。定量された質量（この様式で分析されたすべての試料について）は、２Ｄａの計算値以内であった。試験中に高頻度で観察された３つの他の遺伝子型は、この３つの遺伝子型、すなわち、Ｇｃ−１Ｆ／１Ｓ、Ｇｃ−１Ｆ／２およびＧｃ−１Ｓ／２のヘテロ接合の組合せであった。時には、他の遺伝子型の変異体が試験を通して観察された（変異体により示された）が、調査中の集団内では低頻度であった。翻訳後修飾体、すなわちＯ連結グリコシル化［（ＮｅｕＡｃ）_１（Ｇａｌ）１（ＧａｌＮＡｃ）_１三糖］も示される。注目すべきは、Ｇｃ−１ＦおよびＧｃ−１Ｓ遺伝子型に対しては一貫した質量変化（ｄｍ＝＋６５６Ｄａ）でグリコシル化シグナルが観察されたが、Ｇｃ−２遺伝子型に対しては観察されなかったことである。この観察は、好ましい部位のＯ連結グリコシル化（Ｔｈｒ^４２０がＬｙｓ^４２０に変化）が欠けているＧｃＧ−２遺伝子型に由来するタンパク質と一致する。全対象（ｎ＝１０２個体）の遺伝子型同定データのみを評価すると、Ｔ２ＤＭ対象においては、Ｇｃ−１Ｓ対立遺伝子（遺伝子型Ｇｃ−１Ｓ／１Ｓ、Ｇｃ−１Ｆ／１ＳおよびＧｃ−１Ｓ／２）が主に見出された。図２において示されるように、対立遺伝子出現頻度は、健康対象と比較してＴ２ＤＭ対象においておよそ５００％増加した［カイ二乗検定：（２つの試料ドナー型×３つの主要なＧｃＧ対立遺伝子、α＝０．０１、自由度２、Χ^２＝４９．６、ｐ＜０．０００１、Ｃｒａｍｅｒ’ｓ Ｖ＝０．４７４）］。

この実施例により、遺伝子修飾体（ＧＭ）および翻訳後修飾体（ＰＴＭ）は両方とも、単一の遺伝子に由来する産物中に存在し、そのような修飾体は、単一分析を用いて（すなわち、単一の分析様式において）同時に定量できることが実証される。

Ｇｃ−グロブリン（ａｋａビタミンＤ結合タンパク質）：代謝改変体
タンパク質ベースの分析が特に有利な点は、核酸ベースのアッセイによっては得ることのできない追加的なデータをマッピングできることである。図１に示すように、標的化ＥＳＩ−ＭＳアッセイを用いて、翻訳後修飾体に関してＧｃＧをさらに特徴付けることが可能である。注目すべきことに、天然グリコシル化など、多様なタンパク質表現型（翻訳後修飾体）は、個体に依存する特質的な相対強度（修飾体の相対量を反映する）で観察された。この同じ方法論は、Ｔ２ＤＭ、すなわち、ＧｃＧの糖化変異体の病態生理に関連する翻訳後修飾体および代謝改変体についてスクリーニングするために用いることができる。図３は、３名の個体（遺伝子型はすべてＧｃ−１ｆ／１ｆ）：健康者（赤）、Ｔ２ＤＭ（緑）およびｉｄ−Ｔ２ＤＭ（青）由来のＧｃＧのスペクトルのオーバーレイを示すものである。Ｔ２ＤＭを有する個体に由来するスペクトルにおいて観察されるのは、天然ＧｃＧのものより質量の大きい１６２Ｄａでのシグナルのレベルの増加である。分子量のこうした変化は、１−デオキシフルクトシル付加体の（非酵素的）付加の結果もたらされると考えられるものに相当し、このことは、Ｔ２ＤＭに伴う血糖値上昇と一致する。群として見た場合、Ｔ２ＤＭ対象における糖化ＧｃＧの平均レベル（積分されたイオン・シグナル）は、健康個体において見出されるレベルより４〜５倍高い（図３の挿入図を参照）。

この実施例により、遺伝子修飾体（ＧＭ）および代謝改変体（ＭＡ）は両方とも、単一の遺伝子に由来する産物中に存在し、それらは単一分析を用いて（すなわち、単一の分析様式で）同時に分析できることが実証される。

β−２−ミクログロブリンおよびシスタチンＣ：代謝改変体
連続した集団ベースのスクリーニングにおいては、２つの他の血漿タンパク質の糖化変異体、すなわちβ−２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）（クラスＩの主要組織適合複合体の軽鎖、血漿中におよそ１ｍｇ／Ｌで通常存在する）およびシスタチンＣ（ｃｙｓＣ）（システイン・プロテアーゼ阻害物質、血漿中におよそ０．１ｍｇ／Ｌで通常存在する）が、Ｔ２ＤＭ対象において上昇したレベルで見出された。ウサギ抗ヒトｂ２ｍおよびｃｙｓＣポリクローナルＩｇＧを用いて誘導体化された抽出ピペットの先端を用いるＧｃＧアッセイにおいて使用される同じ試料調製物からｂ２ｍおよびｃｙｓＣを同時に抽出することにより、アッセイを実施した。抽出後、ＨＢＳ、水、２Ｍ酢酸アンモニウム／アセトニトリル（３：１ ｖ／ｖ）に次いで再度水を用いてすすぐことにより、非特異的に結合したタンパク質を除去した。次に、５μＬのマトリックス溶液（２：１ ｖ／ｖ、Ｈ_２Ｏ：ＡＣＮ、シナピン酸で飽和、ＴＦＡを０．４％加えたもの）を先端（固体支持体を覆う）中に吸引することにより、保持されたタンパク質を溶出させ、マトリックス／タンパク質混合物を９６ウェルのフォーマット済みＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ標的の表面上に堆積させた。遅延抽出線形モードおよびレーザー（Ｎｄ：ＹＡＧ）繰返し率２００Ｈｚで作動するＢｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩＩを用いて質量分析を実施した。試料調製物内の異なる部位から取得した２５×１００レーザーショット・スペクトル［それぞれがＳ／Ｎ＞１０、分解能（ＦＷＨＭ）＞１，０００の基準を満たす］を合計することにより、スペクトル（２，５００レーザーショット）を得た。ベースライン減算に次いで、所望の各シグナルのシグナル積分（ベースラインに）によりスペクトルを加工した。糖化形態のタンパク質（ｂ２ｍまたはｃｙｓＣのいずれか）の積分値を、観察される全形態のタンパク質の積分値に正規化することにより、各個体について、相対的な糖化値（イオン・シグナル）を定量した。

図４は、３名の個体：健康者（赤）、Ｔ２ＤＭ（緑）およびｉｄ−Ｔ２ＤＭ（青）のｂ２ｍのＭＳＩＡの結果得られたスペクトルのオーバーレイを示すものである。すべてのスペクトルに共通するのは、野生型ｂ２ｍ（ｍ／ｚ＝１１，７３０Ｄａ）、およびマトリックス付加体（シナピン酸、ｍ／ｚ＝１１，９３６Ｄａおよび１１，９５４Ｄａで）によるシグナルである。ＧｃＧ分析と同様、Ｔ２ＤＭを有する個体に由来するスペクトルにおいては、糖化レベルの増加（ｂ２ｍより分子量が大きい１６２Ｄａのシグナルにより示される）が観察される。群として見た場合、Ｔ２ＤＭ対象における糖化ｂ２ｍのレベル（相対的なイオン・シグナル）は、健康個体において見出されるレベルより２〜５倍高かった（図４の挿入図）。

ｃｙｓＣスクリーニングにわたっても、同様の結果が得られた。図５は、ＧｃＧおよびｂ２ｍの分析において用いた同じ試料から得られたｃｙｓＣおよび変異体のスペクトルのオーバーレイを示すものである。すべてのプロファイルに共通するのは、ｃｙｓＣの４つの形態のシグナル、すなわち、Ｎ末端ｄｅｓＳＳＰ（ｍ／ｚ＝１３，０７３）、Ｎ末端ｄｅｓＳ（それぞれ、ｍ／ｚ＝１３２５７（ヒドロキシプロリンなし）または１３２７３（ヒドロキシプロリンあり））、天然ｃｙｓＣ（ｍ／ｚ＝１３，３４４）およびヒドロキシプロリンｃｙｓＣ（ｍ／ｚ＝１３３６０）、ならびに野生型およびヒドロキシプロリンｃｙｓＣのマトリックス付加体（ｍ／ｚ＝１３５５０〜１３５８４）である。加えて、糖尿病個体においては、糖化ｃｙｓＣ（ｍ／ｚ＝１３５０９および１３５２５）についてのシグナルが観察される。ＧｃＧおよびｂ２ｍと同様、３つの対象について定量された平均値は、Ｔ２ＤＭ対象由来の糖化シグナルにおいておよそ３〜４倍の相対的な増加を示す（図５の挿入図）。

この実施例により、複数の遺伝子に由来する複数の形態の産物（疾患に関連する代謝改変体（ＭＡ）を含む）を同時に定量するために単一分析を用いることができることが実証される。この実施例により、ＭＡ関連の１つを超える疾患を同時に分析することができる多重化アッセイも実証される。

Ｃ−ペプチド：翻訳後修飾体
この試験では、実施例１の血漿を、実施例２〜４において使用したものと同様の方法論を用いて、Ｃ−ペプチドについて質的および半定量的に分析した。図６は、健康個体およびＴ２ＤＭに罹患している個体について得たスペクトルを示すものである。最も興味深いのは、これまでに報告されていないＣ−ペプチドの変異体（ｄｅｓ（Ｇｌｕ−Ａｌａ）アイソフォームと同定される）が、健康集団と比較して上昇したレベルでＴ２ＤＭ集団において存在し、そのことから、Ｔ２ＤＭにとっての新しい候補バイオマーカー（ＰＴＭの形態での）が確立されたことである（挿入図）。いかなる特定の機序によっても限定されることを意図するものではないが、ジペプチジル・ペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ、ＣＤ２６、ＥＣ３．４．１４．５）はこの特定の切断産物に関与していると考えられ、このことは、Ｔ２ＤＭの病態生理の進行中の研究と一致する。この多機能の膜貫通型セリン・プロテアーゼは、ペプチド・ホルモンのアミノ末端からＸａａ−ＰｒｏまたはＸａａ−Ａｌａを切断する酵素の特異性により、この試験において広く見られるＧｌｕ−Ａｌａの切断されたバージョンのＣ−ペプチドに関与している可能性がある。これを考慮に入れると、健康個体に対しＴ２ＤＭ個体においては相対的なｄｅｓ（Ｇｌｕ−Ａｌａ）Ｃ−ペプチドが実質的に増加していることから、この特異的な翻訳後修飾型のＣ−ペプチドはＴ２ＤＭの臨床診断において有効なバイオマーカーであり、ＤＰＰ−ＩＶの生物活性を示すことが確認される。

この実施例により、疾患に関連する酵素活性を有する直接的なマーカーとしてのＰＴＭ型およびＭＡ型のタンパク質または遺伝子産物の使用が実証される。

酵素的シグナリング
糖化および酸化ストレスは、両方とも、標的タンパク質に対する正の質量変化として出現する。本発明によれば、一定のタンパク質における負の質量変化（すなわち切断）は、Ｔ２ＤＭと相関する。手短に言えば、本明細書中に記載の試験において使用するために、Ｃ−ペプチド（Ｃ−ｐｅｐ）およびインスリン（Ｉｎｓ）についての（リフレクトロン）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ ＭＳＩＡアッセイを開発した。集団における最初のスクリーニング時に、切断型変異体のＣ−ｐｅｐ、インスリンおよびインスリン類似体を同定し、Ｔ２ＤＭ対象と相関することを観察した。図１３は、この試験において調査された個体について得られたものを質的に表す陰イオンＭＳＩＡスペクトルを示すものである。このスペクトルにおいて観察されるのは、モノアイソトピックｍ／ｚ＝３０１７．５０Ｄａの完全なＣ−ペプチド、ならびに、ｍ／ｚ＝２８８８．４９Ｄａおよび２８１７．４５Ｄａで記録される２つの他のシグナルである。１０ｐｐｍの質量精度で、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦＭＳを用いた部分配列決定も行い、これらのシグナルをそれぞれＣ−ペプチド、Ｃ−ｐｅｐ（２−３１）およびＣ−ｐｅｐ（３−３１）と同定した。この３つのシグナルは、健康対象およびＴ２ＤＭ対象の両方を通じ全般的に観察された。ヘテロ接合点突然変異Ｃ−ｐｅｐ Ａｌａ１８Ｇｌｕが、対象（健康な女性）において一度観察された。それぞれ質的に異なる種のイオン・シグナルを全種からの総シグナルに正規化することにより、各個体由来のスペクトルのデータを、相対定量分析に供した。次に、個体由来のデータをそのそれぞれの対象に群化することにより、Ｔ２ＤＭの存在に関して各種についての相対的なイオン・シグナルを評価した。Ｃ−ｐｅｐ（２−３１）は、健康対象とＴ２ＤＭ対象との間でほとんど差を示さなかった。しかし、Ｃ−ｐｅｐ（３−３１）の相対的な寄与は、その２つの対象間で相当異なることが見出された。図１３の挿入図は、Ｃ−ｐｅｐ（３−３１）の相対的なイオン・シグナルについて、その２つの対象間での発生頻度を比較するヒストグラムを示すものである。Ｔ２ＤＭ対象については平均およそ９．０％（対象における全個体の平均）の広い分布が観察されたが、これに対し、健康対象については平均およそ４．８％の狭い分布が観察された。健康者およびＴ２ＤＭ（スラッシュ）由来のＣ−ペプチドのＭＳＩＡスペクトル。図１３においては、両方の対象において２つのＮ末端切断型変異体、すなわちＣ−ｐｅｐ（２−３１）およびＣ−ｐｅｐ（３−３１）が一貫して観察されたことがわかる。Ｔ２ＤＭ対象においては、より高頻度、より高い相対存在量でＣ−ｐｅｐ（３−３１）が観察された（図１３の挿入図を参照）。

対象に対し、インスリンＭＳＩＡも実施した。図１４に示すのは、健康者およびインスリン依存性Ｔ２ＤＭ患者（スラッシュ）から得た２つの例示的なスペクトルである。完全な内因性インスリンが両個体において、ｍ／ｚ_平均＝５，８０８．４Ｄａで現れることが観察される。加えて、Ｔ２ＤＭ個体における別々のシグナルとして、インスリン相同体であるＬａｎｔｕｓ（インスリン・グラルギン、分子量＝６，０６３．７）およびＮｏｖｏｌｏｇ（インスリン・アスパルト、分子量＝５８３１．６）が観察される（個体の病歴により）。公知の生理学的処理によれば、Ｌａｎｔｕｓは、２つのＣ末端のアルギニン残基、次いで次のＴｈｒ残基（ｂ鎖のＣ末端から）を取り除くことにより最初に分解することが観察される。Ｎｏｖｏｌｏｇ配列とアラインする注目すべき分解産物は観察されなかったが、ｂ鎖Ｃ末端の残基（Ｄｅｓ（Ｂ３０）ＨＩ）の切断体として、内因性インスリン変異体が同定された（対象にわたり）。Ｃ−ｐｅｐ（３−３１）と同様、この切断型変異体は、Ｔ２ＤＭ対象においてより高い相対的な寄与および頻度で存在した（図１４の挿入図）。

トランスチレチン（ａ．ｋ．ａ．プレアルブミンまたはＴＴＲ）：翻訳後修飾体
健康対象、Ｔ２ＤＭ対象およびｉｄ−Ｔ２ＤＭ対象における完全なＴＴＲの標的化分析を、ｂ２ｍおよびｃｙｓＣについて前述したものと似た様式で実施した。図７は、健康者、Ｔ２ＤＭ患者およびｉｄ−Ｔ２ＤＭ患者に由来する、いくつかの特質的修飾型のＴＴＲ、主に、天然ＴＴＲ（ｍ／ｚ１３７６２）、スルホン化ＴＴＲ（ｍ／ｚ１３８４２）、システイン化ＴＴＲ（ｍ／ｚ１３８８１）およびシステイニルグリシルＴＴＲ（ｍ／ｚ１３９３８）の質量スペクトルを示すものである。挿入図に示すように、所見から、糖尿病患者由来の血漿試料中では、スルホン化ＴＴＲ対天然ＴＴＲの比率が劇的に増加していることが明らかになった。このことから、スルホン化ＴＴＲは、過去数日にわたり個体が経験した炎症および／または酸化ストレスの総合的な程度を示すことにより、Ｔ２ＤＭの補助的なマーカーとして役立つ。

タンパク質糖化と似た様式で、いくつかのタンパク質において特質的な酸化が観察された。図１２Ａ〜１２Ｄは、酸化率（％）（全種の積分値に正規化された糖化イオン・シグナルの積分値として、１タンパク質当たりで測定）を示すものであり、健康者（ｎ＝５０）およびＴ２ＤＭ（スラッシュ、ｎ＝５２）。図１２Ａは、健康個体およびＴ２ＤＭ（スラッシュ）個体から取得した、アルブミン（Ａｌｂ）の、図１２Ｂはアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）の、図１２Ｃはアポリポタンパク質Ｃ１（ＡｐｏＣ１）の、図１２Ｄはトランスチレチン（ＴＴＲ）の、オーバーレイを示すものである。アルブミンおよびＴＴＲは、それぞれ、システイン化（ｄｍ＝１１９Ｄａ）およびスルホン化（ｄｍ＝８０Ｄａ）の形態のそれらの遊離システインで特質的な酸化を呈する（アルブミンのスペクトルにおいても観察されるのは、特質的な糖化によるシグナルである）。アポリポタンパク質の酸化は、主に、遊離メチオニン（ＡｐｏＡ１においては３つ、ＡｐｏＣ１においては１つ）でスルホキシド形成の形態で生じた。さらに、ＡｐｏＣ１スペクトルにおいて観察されたのは、完全な種由来の２つのＮ末端のアミノ酸の切断によるシグナルである。この実施例により、Ｔ２ＤＭの補助的な（１つまたは複数の）バイオマーカーとしてのＰＴＭ型のタンパク質の使用が実証される。

代謝改変データ：健康者対Ｔ２ＤＭのクラス・モデリング
前述のアッセイを用いて、実施例１に記載の全個体を分析した。ＧｃＧ、ｂ２ｍおよびｃｙｓＣについてのＭＡの前駆図は、三次元空間において健康個体がＴ２ＤＭ個体から分離されることを示すものである（図８）。こうして分離されることから、適切に訓練すれば、管理された分類手法によりこれら３つのタンパク質（楕円により示す）についての正常な糖化「空間」を定義する有効な手段がもたらされる可能性があり、そうなれば、Ｔ２ＤＭに伴う異常な糖化を識別するためのベースラインとしてこれを用いることができることが示唆される。この目的のために、健康試料由来のデータ（図８中の赤い点）を、ＳＩＭＣＡ法（ｓｏｆｔ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｃｌａｓｓ ａｎａｌｏｇｉｅｓ）分類（市販のソフトウェア：Ｔｈｅ Ｕｎｓｃｒａｍｂｌｅｒ、Ｃａｍｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｂｒｉｄｇｅ、ＮＪを用いて）を構築する目的で、主成分分析（ＰＣＡ）に供した。

図９は、このＰＣＡの評点プロットを示すものである。手短に言えば、完全交差検証および標準化変量分散（すなわち、３つの糖化値に、モデルと同等の重みをつける）を用いて健康対象のデータ（ｎ＝５０個体、１個体当たり３データ値）を分析して、健康者データのモデルを構築した。次に、このモデルを全対象（ｎ＝１０２個体）のデータと対比させて、健康者をＴ２ＤＭと識別するうえでの有用性を構築した。ｐ＜０．００１の有意水準でモデルを用い、５０名分の健康者試料のうち３名分を健康者と分類せず、５２名分のＴ２ＤＭ試料のうち２名分を健康者と分類した（臨床的感度および特異性がそれぞれ９６％および９４％に匹敵する測定基準）。注目すべきは、３例の偽陽性についての分離の程度が相当有意であることが観察され、このことから、こうした個体は、自覚はなくても実際は糖尿病である可能性がある、すなわち、アメリカ人の１／３に当たる人は、自身が糖尿病に罹患していることに気づいていないことが示唆されることである。偽陰性に関しては、Ｔ２ＤＭは、典型的に前糖尿病領域と呼ばれる、健康者とＴ２ＤＭとの間の「グレー領域」を有する疾患であることが示された。一旦糖尿病と診断された場合には、この境界の糖尿病状態に到達することが、事実上、治療の目標である。したがって、２例の偽陰性は、Ｔ２ＤＭの良好な管理によるものである可能性がある。

要約すると、３つの糖化タンパク質のＳＩＭＣＡベースの分析は、Ｔ２ＤＭを判定およびモニターするうえで使用するための相当な有望性を示し、より大きい対象の対比に適した主要なアッセイを表す。さらに、この分析は、他のマーカー（一旦見出されれば）を追加することで改善できる技術的な基礎として役立つ。バイオマーカー開発へのこの種の追加的なアプローチを完全に理解するために、本発明が、確定値および不確定値を両方とも有する大量のスペクトルのデータを詳しく調べるための多変量解析を用いることにより開始していないことは注目に値する。むしろ、マーカー（この事例では、血漿タンパク質の相対的な糖化値）としての有望性を示す確定形態のタンパク質由来のデータのみを分析に加える。この様式で、個々の（独立した）マーカーの値を完全な分析の一部として評価できる。例えば、先に報告した偽陽性率および陰性率（それぞれ６％、４％）は、３つの確定因子すべてを用いて達成できた。これらの測定基準は、２つのみのタンパク質を用いることを上回る改良であり、例えば、ｂ２ｍおよびＧｃＧのデータのみを用いると、結果は最良のものに次ぐ偽陽性率および陰性率（それぞれ８％、１２％）となった。仮に逆の結果が観察されていれば、価値を持たないマーカーは分析から除外されたであろう。複数の確定因子のアッセイを「構築」するこのアプローチは、非標的化スペクトルのデータの量が考慮される臨床プロテオミクスの例とは対照的であり、その多くは、予測に対して有意ではなく、最悪の場合は、データ・セットにおける疑似的な見かけのためにエラーの原因となる（６４、６５）。したがって、重要でない（または誤った）値を測定から排除し、確定的なデータのみを加えることにより、本発明は、疾患を正確に分類するためのデータおよび評価法を最大限に活用することを企図するものである。

この実施例は、健康者を疾患から正確に検出および診断するための、ＭＡおよびＰＣＡまたはクラス・モデリングの複数の値の使用を実証するものである。

単一アッセイ：ＧｃＧ遺伝子型および糖化
ＭＳベースのＧｃＧアッセイを実施する利点は、単一分析において遺伝子型およびタンパク質表現型（糖化）のデータを両方とも得ることができることであり、各測定基準は独立に、Ｔ２ＤＭの検出およびモニタリングに対する値を有する。現在、等価値のデータを得ることが可能な単一分析アッセイは存在しない。現在の技術、例えばＧｃＧ遺伝子型同定の使用は、例えば、単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）分析または遺伝子配列決定法を用いて、核酸レベルで実施できる。したがって、ＧｃＧの３つの主要な対立遺伝子型の分析には、遺伝子型に関与する２つのＳＮＰ’ｓを見分けることが可能な少なくとも２つの遺伝子ベースのアッセイが必要となろう。そのような遺伝子型同定アッセイのデータは、糖化データと組み合わせることになると考えられ、遺伝子型同定のアッセイはあまり直接的なものではない。ＨｂＡ１Ｃと同様、糖化型のＧｃＧの相対存在量を測定することはまた、Ｔ２ＤＭの重要な検出およびモニタリングである。この測定には、少なくとも２つのさらなるアッセイ（例えば、タンパク質ベースの免疫測定的アプローチ）、すなわち、全形態のＧｃＧ（分母）用のアッセイと、糖化ＧｃＧ（分子）のみを見分けることが可能な第２のアッセイとが必要となろう。全部で少なくとも４つのアッセイを実施しなければならない。他の分析シナリオを提案してもよいが、いずれの場合においても、ＭＳベースのアッセイと等価値のデータを得るには、複数のアッセイを実施しなければならない。

本発明は、ＧｃＧ遺伝子型同定（ＧＭ）および糖化（ＭＡ）の両方を組み合わせて用いることを認める。図１０は、両方の測定基準を組み合わせて用いた結果を示すものである。各点は、所与の個体［健康者（赤）、Ｔ２ＤＭ（緑）およびｉｄ−Ｔ２ＤＭ（青）］について実施された単一分析で得られたものである。Ｘ軸上に明示してあるのは、ＧｃＧの６つの主要な遺伝子型である。Ｙ軸上に記載してあるのは、個体において見出される糖化ＧｃＧの相対存在量である。グレーの領域により強調されている破線は、糖化ＧｃＧの関数（対ＧｃＧ遺伝子型）として健康者をＴ２ＤＭから最もよく分離する基準レベルと、Ｔ２ＤＭ（または前Ｔ２ＤＭ）を適切に管理している個体を示す可能性のある範囲とを記すために付したものである。２〜３の外れ値を除けば、それを超える糖化ＧｃＧレベルはＴ２ＤＭを示す、遺伝子型依存性の閾値が存在する。

この種（単一分析）の遺伝子型−タンパク質表現型アッセイの展望は相当なものである。そうしたアッセイは、１）Ｔ２ＤＭの発症しやすさを示すこと、２）Ｔ２ＤＭを検出すること、および３）Ｔ２ＤＭの進行（および／または治療効果）を個人レベルについてモニターすること、により、価値が見出される。図２に示すデータを参照すれば、Ｘ軸そのものが、遺伝子型同定（すなわち、個体が自身の生涯でＴ２ＤＭを発症する可能性のある遺伝学的なリスク因子の測定）に基づくＴ２ＤＭの素因として解釈でき、Ｇｃ−１ｓ遺伝子型のほうがＴ２ＤＭにかかりやすい。糖化についての遺伝子型依存性の閾値（Ｔ２ＤＭの指標としての）により、最初のリスク因子ならびにＴ２ＤＭの病態生理学的マーカーの存在に基づいて一般集団内の個体を層化することが可能な、すなわち、個体がＴ２ＤＭを発症した時期および治療への応答の仕方をより正確に示すために２つの値を組み合わせて用いる、より個別性の高いアッセイが得られる。そのような層化は、個別化医療の必須構成要素である。

この実施例により、単一分析に由来する、疾患を層化するためのＧＭ型およびＭＡ型の組合せ使用が実証される。この単一アッセイおよびデータ評価法は、糖尿病の、素因、発症、進行および治療への応答を示すことが可能である。

複数マーカー：時間依存性評価
異なる糖化タンパク質（ＭＡ）のデータのとりわけ新規の使用は、個体の血糖値を（３つのタンパク質の糖化レベルにより）時間の関数として見るためのものであり、糖化における時間的な変動を、タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの存続期間との相関により見ることができる。明白なＴ２ＤＭのより正確な診断に加え、本明細書において関心のある他の話題は、前Ｔ２ＤＭの「グレーの影」をより正確に定義し、同時に、一旦診断された場合には個体のＴ２ＤＭ管理をモニターすることである。個体は、現在のマーカーを用いてモニターされる時点（即時および過去およそ９０日）内で前Ｔ２ＤＭ（または良好に維持された）状態の内外で変動することがあると考えられる。個体が元々Ｔ２ＤＭの診断、例えば、テストに先立ち長時間の絶食が義務づけられる低ＦＧＴ試験（ＯＧＴＴまたはＨｂＡ１Ｃを用いない）についてスクリーニングされる場合には、この効果は、誤った測定値につながる可能性がある。Ｔ２ＤＭを有すると既に診断されている個体、例えば、治療を周期的にさぼる個体、空腹時グルコース試験前に適切に絶食しない個体については、その逆が当てはまる場合が、すなわち、不要な治療変更につながる可能性がある。個体の過去における異なる時点を反映する多重化アッセイは、こうした問題に関しいくつかの利益をもたらすことができる。

図１１は、多様なタンパク質の糖化における時間的な変動の「半減期時計」を構築する可能性を示すものである。示してあるのは、相対的な糖化率対サンプリングに先立つ時間のプロットである。マーカーのｉｎ ｖｉｖｏでの存続期間は、ｂ２ｍ、ｃｙｓＣ、ＧｃＧ、ＡｌｂならびにＨｅｍ（ＡおよびＢ）についてそれぞれ、およそ０．５時間、２時間、８５時間、５５０時間および２０００時間である。着色された破線は、健康対象（逆三角形）およびＴ２ＤＭ対象（四角）の分析中、糖化タンパク質について見出された平均値を結ぶものである。さらに、図１６において示される５名の個体のデータも示す。個体５については、すべてのマーカーがそれぞれの対象の平均値より低く、このことから、適切で厳格に管理された非インスリンベースの治療を受けていることが示される。個体４は、直近の過去における糖化上昇を除いてほぼ同じプロファイルを呈している（また、図１６を参照すると、比較的高めの酸化ストレス値も呈している）。その一方、個体１は、治療を正しく施されていないか、または治療自体が適切でないかいずれかである。同様に、過去１〜２カ月、個体２は、（極端な）糖化上昇を呈するが、過去１週間以内に、比較的低めのレベルに糖化を低下させ始めた。Ｔ２ＤＭを有するとはそれまでに診断されていない個体３は、Ｔ２ＤＭレベルの内外を変動することが観察され、境界または「前Ｔ２ＤＭ」状態であることが示される。最後に、個体の３、４および５はすべて、糖化ヘモグロビンを用いて測定される場合とほぼ同じ糖化指標を呈するが、採血までの時間においては異なる軌跡をたどることに注目すべきである。

これらの時間依存性マーカーにより、単一の血漿試料の分析に基づく個体の糖化状態を詳細に見ることが可能になる。モニター手段として使用されると、複数点のある画像からは個体のＴ２ＤＭ維持の詳細な状況が得られ、このことは、個体が自身との比較で長期的にモニターされる個別化医療の一形態である。健康な糖化の複数点のある時間的な画像は、高リスクの個体（「前Ｔ２ＤＭ」）を回復させることが潜在的に必要な、個体がＴ２ＤＭ状態の内外を変動する可能性があると考えられるベースラインとして役立つ。最後に、短期および長期両方の糖化が同時にモニターされ、このことは、「グルコース・パラドックス」に関し、高血糖誘導性の酸化ストレスとの比較で相当興味深い。

この実施例により、疾患管理を時間の関数として見るための複数のＭＡ型の使用が実証される。

一変量検証および多次元分析
アッセイの、可能性のあるカットオフ値すべてにわたり健康者をＴ２ＤＭと区別するマーカーの能力を反映する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて、糖化および酸化ストレスのマーカーそれぞれを評価した。図１５は、表１に示すマーカーのうち８つについてのＲＯＣ曲線を示すものである。曲線下面積は０．８４〜０．９９の範囲であり、これにより、健康対象とＴ２ＤＭ対象との間が良好に分離されることが実証される。糖化および酸化ストレスは、曲線を作成するうえで用いたタンパク質変異体に関与している。

ＳＩＭＣＡ法（ｓｏｆｔ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｃｌａｓｓ ａｎａｌｏｇｉｅｓ）分類（市販のソフトウェア：Ｔｈｅ Ｕｎｓｃｒａｍｂｌｅｒ、Ｃａｍｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｂｒｉｄｇｅ、ＮＪを用いて）を構築する目的で、データを主成分分析（ＰＣＡ）に供した。図１６は、糖化データ由来のＰＣ１対酸化データ由来のＰＣ１をプロットした結果を示すものである。健康個体は、低糖化／低酸化象限、すなわち、「健康な」糖化および酸化の象限に集中しているが、この象限は、Ｔ２ＤＭ診断のための基準点として役立つと同時に、一旦診断されたＴ２ＤＭの治療についての標的でもある。Ｔ２ＤＭ対象における個体の大部分は、高糖化／高酸化象限に入る。Ｔ２ＤＭ個体（×印）のおよそ２０％は、糖化の比較的良好な制御を呈するが、酸化ストレスは上昇している。

参考文献

Claims (14)

1. 対象における疾患または障害を検出およびモニターする方法であって、前記対象の体液タンパク質中で遺伝子修飾型（ＧＭ）、翻訳後修飾型（ＰＴＭ）または代謝改変型（ＭＡ）のバイオマーカーを検出およびアッセイすることを含む方法。
2. 前記疾患または障害が糖尿病である、請求項１に記載の方法。
3. 前記体液タンパク質が血漿または尿タンパク質である、請求項１に記載の方法。
4. 前記複数のマーカーから得られるデータを、分類アルゴリズムを用いてさらに評価して、健康状態および糖尿病状態を確定させる、請求項１に記載の方法。
5. 前記バイオマーカーをｉｎ ｖｉｖｏでの存続期間と相関させて、糖尿病状態および前糖尿病状態に関連する長期的な記録を構築する、請求項１に記載の方法。
6. 前記バイオマーカーをｉｎ ｖｉｖｏでの存続期間と相関させて、糖尿病の管理および治療に関連する長期的な記録を構築する、請求項１に記載の方法。
7. 前記疾患または障害が、糖尿病、心血管疾患、冠動脈疾患および末梢動脈疾患、慢性の閉塞性肺疾患、脳卒中、癌、アルツハイマー病、ニューロパチー、網膜症および栄養欠乏症から成る群から選択され、単独であっても、または糖尿病と関連のある併存疾患としてのものであってもよい、請求項１に記載の方法。
8. 前記バイオマーカーが、Ｇｃ−グロブリン（ＧｃＧ）、β−２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）、シスタチンＣ（ｃｙｓＣ）、アルブミンならびにＨｅｍＡおよびＢから成る群から選択される糖化バイオマーカーである、請求項１に記載の方法。
9. 前記バイオマーカーが、アルブミン、ＴＴＲ、ＡｐｏＡ１およびＡｐｏＣ１から成る群から選択される酸化バイオマーカーである、請求項１に記載の方法。
10. 前記バイオマーカーが、Ｃ−ペプチド（Ｃ−Ｐｅｐ）およびインスリンから成る群から選択される酵素的バイオマーカーである、請求項１に記載の方法。
11. 対象における疾患または障害を検出およびモニターする方法であって、複数のアッセイにより、前記疾患または障害に関連するＧＭ、ＰＴＭおよび／またはＭＡのバイオマーカーの組合せを定量することを含む方法。
12. 対象における疾患または障害を検出およびモニターする方法であって、単一アッセイにより、前記疾患または障害に関連するＧＭ、ＰＴＭおよび／またはＭＡのバイオマーカーの組合せを定量することを含む方法。
13. 前記ＧＭ、ＰＴＭおよびＭＡのバイオマーカーが、同じ遺伝子産物上にすべて存在し、タンパク質ベースの単一分析においてすべて検出される、請求項１１に記載の方法。
14. 前記ＧＭ、ＰＴＭおよびＭＡのバイオマーカーが、同じ遺伝子産物上にすべて存在し、タンパク質ベースの単一分析においてすべて検出される、請求項１２に記載の方法。

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