CN103376326A - 维生素d结合蛋白作为肥胖型糖尿病标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及维生素D结合蛋白作为肥胖型糖尿病标志物的应用。本发明提供了一种对于指示肥胖型糖尿病的发生或发展有用的标志物—维生素D结合蛋白，其在肥胖型糖尿病患者血浆中的含量显著低于正常人群，因此可用于开发诊断肥胖型糖尿病或肥胖型糖尿病患病风险的诊断试剂或试剂盒。

Description

维生素D结合蛋白作为肥胖型糖尿病标志物的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种维生素D结合蛋白(Vitamin D-binding protein：VDBP)用作检测肥胖型糖尿病的蛋白质分子标记物的应用。

背景技术

糖尿病是一种严重威胁人类健康的疾病，世界发病率高达2％，在发展中国家糖尿病的发病率和死亡率均呈现快速上升趋势。在我国，随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，糖尿病患病率日渐增高，目前我国糖尿病总人数超过4000万，已经成为糖尿病的重灾区，每年用于糖尿病治疗的医疗支出大为增加，这表明糖尿病已经成为严重危害我国人民生命财产安全的敌人，并且是影响社会经济发展的一个重要因素，因此加大力度进行我国糖尿病的基础研究具有战略意义。

糖尿病患者处于临床糖尿病诊断前期可长达12年，大部分患者是在出现糖尿病急性或慢性并发症后才得到诊断和治疗的，而事实上早期发现、早期确诊和早期治疗才是让他们恢复健康的关键，因而我们需要寻找到合适的标志物以实现糖尿病的早期发现，从而进一步实现糖尿病的早期确诊和早期治疗；所以，以早期诊断和治疗为目的去研究和寻找能够用作预测和诊断糖尿病的蛋白质分子标记物具有十分重要的意义。

随着人们生活水平的不断提高，肥胖人群在不断增加。2002年的全国范围的营养与健康调查显示，在中国大陆大于18岁的成人人群中大约有22.8％超重，7.1％达到肥胖程度；与1992的调查结果相比，这两项数据在十年间，分别增长了40.7％和97.2％(Chen 2008)。有研究表明肥胖可能直接引起多种疾病，或大大增加某些疾病的患病风险。并且，随着体重指数(BMI)的上升，风险也逐步加大。体重指数上升是诸如心血管系统疾病、二型糖尿病、呼吸系统疾病等慢性病的一个重要高危因素(Must，Spadano et al.1999；Kopelman2000；Kushner and Roth 2003；Kushner and Blatner 2005)。在长期肥胖的人群当中，糖尿病的患病率是普通人群的5倍以上。

因此，本领域非常有必要通过各种途径找到早期诊断肥胖型糖尿病或预测肥胖型糖尿病患病风险的标志物，以期为临床诊断提供依据。

发明内容

本发明的目的在于提供维生素D结合蛋白(Vitamin D-binding protein：VDBP)用作检测肥胖型糖尿病的蛋白质分子标记物的应用。

在本发明的第一方面，提供一种维生素D结合蛋白作为肥胖型糖尿病标志物的用途。

在另一优选例中，所述的维生素D结合蛋白用作检测肥胖型糖尿病或预测肥胖型糖尿病发生的蛋白质分子标记物。

在另一优选例中，所述的标志物是体液的标志物。

在另一优选例中，所述的体液为血浆或血清。

在另一优选例中，所述的维生素D结合蛋白还包括其蛋白片段，该蛋白片段的氨基酸序列为维生素D结合蛋白所特有。

在另一优选例中，所述的维生素D结合蛋白的蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或其中第2-15位氨基酸所示。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1或其中第2-15位氨基酸所示。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种维生素D结合蛋白的用途，用于制备检测肥胖型糖尿病的试剂。

在另一优选例中，所述的试剂选自：抗体、配体。

在另一优选例中，所述的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。

在本发明的另一方面，提供一种特异性识别维生素D结合蛋白或其蛋白片段的试剂的用途，用于制备检测肥胖型糖尿病或区分肥胖型糖尿病高危人群的试剂盒。

在另一优选例中，所述的特异性识别维生素D结合蛋白或其蛋白片段的试剂是抗体。

在本发明的另一方面，提供一种特异性识别维生素D结合蛋白或其蛋白片段的试剂，所述试剂是多克隆抗体。

在本发明的另一方面，提供一种检测肥胖型糖尿病的试剂盒，所述试剂盒包含容器，以及置于所述容器中的所述的试剂。

在本发明的另一方面，提供一种测试条(如试纸或试纸条)，其包括固相载体，以及附着于所述固相载体上的所述的试剂。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、质谱多反应监测技术中用于检测血浆中VDBP浓度的肽段FPSGTFEQVSQLVK的MS/MS谱图。

图2、145个样品中783.9_710.4(y13)该母离子-子离子对的R²的分布情况。横坐标表示R²值，纵坐标表示不同R²值出现的次数。

图3、对维生素D结合蛋白(VDBP)母离子-子离子对(783.9_710.4)的质谱多反应监测技术的结果。纵坐标为轻肽除以重肽的比值(L/H)，即该段肽FPSGTFEQVSQLVK在血中含量比上标准肽的比值。两组做t-test检验，p值为0.0014＜0.01，**表示p＜0.01。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究和筛选，最终获得一种对于指示肥胖型糖尿病的发生或发展有用的标志物。所述的标志物是维生素D结合蛋白(VDBP)或其蛋白片段，其在肥胖型糖尿病患者体液中的含量显著低于正常人群，因此可用于确定肥胖型糖尿病或肥胖型糖尿病患病风险。

维生素D结合蛋白

VDBP的Genebank登录号为GI：32483410，NCBI的登录号码为：NP_000574，Swissprot登录号为：P02774，IPI号为：IPI00555812.4。VDBP是一个存在于体液中以及很多细胞表面的多功能蛋白质，在血浆中，VDBP可以结合维生素D甾醇，可以通过结合肌动蛋白单体来阻止肌动蛋白的聚合。VDBP还与B淋巴细胞表面的免疫球蛋白结合，以及T细胞表面的IgG Fc受体相结合，提示其在免疫性疾病中起作用。有报道称VDBP还与肥胖型糖尿病疾病中的葡萄糖耐受，低胰岛素血症/高胰岛素血症，胰岛素抵抗，妊娠性肥胖型糖尿病相关(PATURI V.RAO，GUDIGE GIRISESH，GUNDUPALLENEELIMA，et al.Journal of DIABETES CARE，30，629-637，2007)。

维生素D家族最重要的成员是麦角钙化醇(维生素D2)和胆钙化醇(维生素D3)，后者可以在皮肤光合合成或者小肠中吸收，但是不管哪种形式获得的维生素D3都需要通过VDBP运送到肝中，并在肝中由一种混合功能氧化酶羟基化生成生成25-羟维生素D3。在体内，25-羟维生素D3是主要的循环形式，它与VDBP结合后，运输到肾中，由一种线粒体混合功能氧化酶细胞色素p450羟基化生成1，25-二羟维生素D3，这是维生素D的主要活性形式，而体内有99％以上的25-羟维生素D3都与VDBP结合。但是，目前没有将VDBP作为肥胖型糖尿病分子标记的报道。

基于本发明的新发现，提供了来源于维生素D结合蛋白的肽段(多肽)，所述的肽段是VDBP蛋白所特有的，可良好地应用于作为肥胖型糖尿病的分子标记物。较佳地，所述的肽段具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或具有SEQID NO：1中第2-15位所示的氨基酸序列。本发明人分析了大量来源于VDBP的肽段，经鉴定这条肽段强度最好。检测这条肽段的含量就可以直接地反映VDBP蛋白的含量，方便、快捷且准确性高。

编码所述的VDBP的肽段的多核苷酸也包括在本发明内。由于所述的肽段是VDBP蛋白所特有的，其对应的多核苷酸序列也是特有的。可通过常规的检测核酸的方法来获知待测样品中所述的多核苷酸的含量。

检测多肽或核酸含量的方法是本领域人员所熟知的。例如，检测多肽可借助于质谱分析仪器等，或可通过Western Blot或ELISA等方法。检测核酸包括PCR扩增、Northern Blot等方法。

维生素D结合蛋白或其蛋白片段的用途

本发明人将正常健康对照组血浆和肥胖型糖尿病患者的血浆样品以乙醇沉淀法分级-阳离子交换色谱-反相色谱串联质谱分析策略对其中的蛋白质进行鉴定并比较了其中蛋白质的表达水平，发现维生素D结合蛋白在肥胖型糖尿病病人血浆中的表达水平显著低于正常健康对照血浆中的表达水平；通过质谱多反应监测技术，进一步证实并发现正常健康对照组与肥胖型糖尿病患者组血浆中维生素D结合蛋白的表达水平存在差异表达。

通过检测正常健康对照以及肥胖型糖尿病病人血浆中维生素D结合蛋白表达量，本发明人发现维生素D结合蛋白在正常健康对照以及和肥胖型糖尿病病人血浆中存在差异表达，维生素D结合蛋白在糖尿病病人血浆中的表达水平显著高低于正常健康对照血浆中的表达水平；通过MS/MS检测，搜库，查找蛋白质，buildsummary分析，MRM检测，定量维生素D结合蛋白，进一步证实并发现正常健康对照组、肥胖型糖尿病患者组的维生素D结合蛋白表达水平存在差异表达。

因此，本发明的第一个目的在于，提供一种维生素D结合蛋白或其蛋白片段作为检测肥胖型糖尿病发生或预测肥胖型糖尿病发生的蛋白质分子标记物的应用。

因此，本发明提供了一种维生素D结合蛋白或其蛋白片段作为糖尿病标志物的用途。本领域技术人员了解维生素D结合蛋白是一种分布于血液、腹水液、脑脊髓液和多种类型细胞表面的多功能蛋白，因此，在血浆、腹水液、脑脊髓液等体液中的维生素D结合蛋白可以作为分子标记物。作为本发明的优选方式，维生素D结合蛋白作为肥胖型糖尿病的血浆检测标志物。血浆检测取材方便、操作简单、便于复查，患者易于接受，评估预后，指导治疗。

基于本发明的新发现，可以利用维生素D结合蛋白蛋白：(i)进行肥胖型糖尿病的鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)评估相关人群的肥胖型糖尿病治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评估相关人群肥胖型糖尿病患病风险，早期监测早期预防。

其还可以用于制备特异性识别维生素D结合蛋白的试剂，从而用于检测维生素D结合蛋白的存在与否以及存在量，作为肥胖型糖尿病的判断依据。

识别维生素D结合蛋白的试剂和试剂盒

基于本发明的新发现，本发明还提供了特异性识别VDBP或其蛋白片段的试剂。任何可识别VDBP或其蛋白片段的试剂均包含在本发明中，用作检测肥胖型糖尿病的标志物。所述的特异性识别VDBP或其蛋白片段的试剂例如是特异性结合VDBP的抗体或配体。

本发明还提供了一种特异性识别VDBP或其蛋白片段的试剂的用途，用于检测肥胖型糖尿病或肥胖型糖尿病高危人群。

作为本发明的一种实施方式，所述的试剂是抗VDBP的抗体；更特别的例如是多克隆抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的抗原可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生，所述的动物如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，InMonoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。

所述的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本中的VDBP水平，从而用于诊断肥胖型糖尿病或判断患病风险(易感性)。

利用所述的抗体，可以检测体液中VDBP的水平，因而可用于检测肥胖型糖尿病，可用于预测早期肥胖型糖尿病的发生，或者用于制备检测肥胖型糖尿病的制剂或试剂盒等，用于制备预测早期肥胖型糖尿病的发生的制剂或试剂盒等。

本发明还提供了用于诊断肥胖型糖尿病的试剂盒，该试剂盒包括：特异性识别VDBP或其蛋白片段的试剂。所述的试剂例如是：单克隆抗体或多克隆抗体。

所述的试剂盒中还可含有：用于免疫组织化学分析的试剂，所述的试剂例如：第二抗体、染色剂、显色剂等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书等。

更具体地，所述的试剂盒可以是一种基于酶联免疫反应(ELISA)技术的试剂盒。用于检测肥胖型糖尿病或预测早期肥胖型糖尿病的发生。ELISA技术以及基于该技术的检测试剂对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

更具体地，所述的特异性识别VDBP或其蛋白片段的试剂也可固定于试纸上，制备成免疫胶体金试纸或类似检测材料。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示VDBP或其蛋白片段可以作为诊断肥胖型糖尿病的标志物。

(2)首次制备出了特异性识别VDBP或其蛋白片段的试剂，所述试剂特异性好，检测灵敏度高，准确性高，具有良好的临床应用价值。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、差异表达蛋白质的筛选方法-乙醇沉淀法分级-阳离子交换色谱-反相色谱串联质谱策略

本实施例中所有的实验用水均来自Milli-Q(Millipore，Bedford，MA，USA)超纯水装置；dithiothreitol(DTT)、SDS、尿素、盐酸胍、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙]-丙磺基(CHAPS)、Tris、碳酸氢铵(NH₄HCO₃)和iodoacetamide(IAA)从Bio-Rad公司(HercμLes，CA，USA)购买；胰蛋白酶(Trypsin)购自Promega公司(Madison，WI，USA)；甲酸(formic acid，FA)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)和乙腈(Acetonitrile)购自Aldrich公司(MilWaukee，WI，USA)；磷酸购自上海化学试剂公司。除乙腈为色谱纯外，其余的化学试剂均为分析纯。

在150μL血浆样品中加入750μL溶液(100mM NaCl，10mM Tris，pH7.4)，用0.22μm滤膜在4℃ 10000g的转速下离心去除脂类；取780μL除脂后的血浆样品加入565μL冷乙醇溶液，置于4℃立式摇床上混合1h，然后4℃ 16000g离心45min。上清即为高丰度组分，沉淀部分即为低丰度组分。将低丰度组分用100％(v/v)冷乙醇润洗一遍，进行低温冻干，加入600μL 6M盐酸胍溶液进行溶解，取300μL，加入5μL 1M DTT，混匀，37℃放置2.5h，冷却至室温后，加入25μL 1M IAA，室温避光放置40min。经过上述处理的蛋白质完全变性，二硫键被打开，巯基被封闭。然后加入1.6ml冷蛋白质沉淀液(丙酮∶乙醇∶乙酸＝50∶50∶0.1)，-20℃放置15h后，4℃ 15000g离心45min，去除上清，加入1mL 100％(v/v)冷丙酮，振荡1min，4℃ 15000g离心45min，去除上清，加入1mL 70％冷乙醇，振荡1min，4℃ 15000g离心45min，去除上清，冻干，加入250μL 100mM碳酸氢铵溶液，50ug胰蛋白酶，37℃酶解4h后，再次加入50ug胰蛋白酶，37℃酶解，16h后。将EP管内液体转移至Millipore 10K超滤管中，4℃ 10000g超滤45min，除去酶和未被酶解的蛋白质，收集滤液、冻干，每管用0.1％甲酸水溶液复溶，取原血浆蛋白质酶解产物(等质量)50ug上样质谱检测。

阳离子交换色谱-反相色谱串联质谱(SCX-RP-MS/MS)包括一个自动进样器、两个高压混合泵和用于二维液相色谱分离的阳离子交换色谱分离柱(SCX柱)和C18反相色谱分离柱(RP柱)以及两个C18反相trap柱，一个十通阀。高效液相色谱溶液包括两种：一、阳离子交换色谱分离溶液，包括A：pH 2.5溶液；B：pH 8.5溶液；二、反相色谱分离溶液：A：0.1％(v/v)甲酸；B：0.1％甲酸，100％(v/v)乙腈。肽段混合物先经过由低到高不同pH值的洗脱溶液冲洗，在不同pH梯度下洗脱下来的肽段再经过反相色谱分离，然后进行质谱检测。具体实验过程如下所示。酶解后的肽段混合物经自动进样器以无损失的模式进入到SCX柱中，在某一pH值的洗脱液的冲洗下，未保留的肽段被冲到后边的一号C18 trap柱上，180min后，十通阀切换，SCX柱上进行下一个pH梯度的洗脱，洗脱下来的肽段结合到二号C18 trap柱上，同时，用2-35％(v/v)的100％乙腈溶液冲洗一号C18 trap柱上，并将该trap上洗脱下来的肽段在C18反相色谱分离柱进行再次分离，质谱检测，180min后，十通阀再次进行切阀，此时，pH梯度洗脱下来的肽段结合到一号C18 trap柱上，并用2-35％的100％乙腈溶液冲洗上一个pH梯度洗脱下来的结合在二号C18 trap柱上的肽段，并将该trap上洗脱下来的肽段在C18反相色谱分离柱进行再次分离，质谱检测，如此反复进行。一共使用了10个不同的pH梯度对SCX柱子上的肽段进行洗脱。在整个过程中的质谱条件为：质谱扫描条件设定为一个400-2000M/z的全扫描(fullscan)后面进行全扫描中前10个最高峰的MS/MS扫描，其中动态排除(dynamic exclusion)的设定是：重复次数(repeat count)为2，重复容忍时间(repeatduration)为30s，动态排除时间(exclusion duration)为120s。质谱检测重复一次。

实验中使用了33例血浆样品包括：5例正常体重且正常血糖样本(组1)，5例正常体重且高血糖样本(组2)，5例正常体重且肥胖型糖尿病样本(组3)，6例肥胖且正常血糖样本(组4)，6例肥胖且高血糖样本(组5)，6例肥胖型糖尿病样本(组6)。每组样本各自取出等体积血浆样本混匀成150μL血浆混合样品，共得六个样品，分别进行上述实验操作。所有样本临床指标见表1。测定的临床指标分别为：空腹血糖(FPG，mmol/l)，胰岛素(Insulin，μU/ml)，甘油三酯(TG，mmol/l)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL_C，mmol/l)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL_C，mmol/l)，总胆固醇(TC，mmol/l)。

表1、33例血浆样本临床资料

实施例2、质谱结果分析

将上述实施例中两次质谱检测得到的原始数据用IPI human 3.51查库，做buildsummary，肽段筛选策略为peptide FDR＜＝1％且unipeptides＞＝2的参数，共鉴定到717个蛋白质，反库中鉴定到31个，蛋白质FDR为4.32％。

表2显示的是正常健康对照血浆和肥胖型糖尿病病人血浆的维生素D结合蛋白(VDBP)的肽段(为VDBP特有的)鉴定次数，表明维生素D结合蛋白(VDBP)在肥胖型糖尿病病人血浆中蛋白含量显著低于正常人，表中的肽段都是酶解维生素D结合蛋白(VDBP)而得到的肽段序列。

图1显示了质谱多反应监测技术中用于检测血浆中VDBP的特有肽段FPSGTFEQVSQLVK的MS/MS谱图。经鉴定这条肽段强度较高，其检测肽段数较高，且包含氨基酸个数适中，适合应用于质谱多反应监控技术检测验证(通常质谱多反应监控技术可以检测包含7-22个氨基酸的肽段)。

表2、6组血浆中维生素D结合蛋白质谱鉴定的肽段数

表2中，“.”表示胰蛋白酶的酶切位点；胰蛋白酶专一性识别并切割K和R的羧基参与形成的肽键。酶切后获得两个“.”之间的肽段。

以上表格表明：维生素D结合蛋白(VDBP)在肥胖型糖尿病病人血浆中蛋白含量显著低于正常人，经成对T-test检验P value＝0.0315。经过这次实施例找到了维生素D结合蛋白(VDBP)这个有显著性差异的蛋白质，后面用MRM进行验证。

实施例3、维生素D结合蛋白(VDBP)差异表达的质谱多反应监测技术验证

本实施例中使用的二硫苏糖醇(DTT)购自Sigma公司；碘乙酰胺(IAA)、甲酸购自Fluka公司；乙腈购自Merck公司；毛细管反相液相色谱，三重四级杆质谱均购自Agilent公司。常规方法合成标准重标肽段FPSGTFEQVSQLV*K(5¹³C-Val)(“*”表示重标的氨基酸)。

血浆样本每3μL原液加入97μL 2D裂解液(8M urea，40mM Tris，65mM DTT)，4℃放置1h，加入1μL 1M DTT，于37℃放置2.5h，待冷却至室温后，加入15μL 1M IAA，于室温避光放置40min，将样品转移至Millipore10K超滤管中，4℃，10000g离心45min，加入100μL 50mM碳酸氢氨溶液，4℃，10000g离心45min，然后加入12ug胰蛋白酶，76μL 50mM碳酸氢氨溶液，37℃酶解16h，然后将滤膜转移至另一离心管中，4℃，10000g离心45min，加入100μL 50mM碳酸氢氨溶液，4℃，10000g离心45min，收集两次离心所得液体，加入3μL甲酸，冻干。冻干后的肽段样品用100μL0.1％(v/v)FA溶液溶解。

取对应0.3μL原血浆的血浆蛋白质酶解产物(等体积)与20pmol标准重标肽段，混合后经自动进样器以无损失的模式加入到反相柱上。用于反相柱的溶剂为0.1％(v/v)甲酸水溶液(A液)，0.1％(v/v)甲酸，90％(v/v)乙腈溶液(B液)。以1.5μL/min的流速，对反相柱在0-20min以5％的B液上样，20-120min以5-35％(体积比)的B液进行梯度洗脱。从反相柱上洗脱的样品通过纳喷雾离子源进入QQQ 6410(Agilent)进行检测。选取783.9_574.4(y5)，783.9_673.4(y6)，783.9_710.4(y13)，783.9_801.5(y7)，783.9_930.5(y8)，783.9_1077.6(y9)共6个母离子-子离子对进行检测，取共洗脱处的信号为阳性信号并对其峰面积进行积分，最终取母离子-子离子对783.9_710.4(y13)的定量信息作为该肽段的定量信息，进行后续数据分析，在所有样本中该母离子-子离子对783.9_710.4(y13)在洗脱时间内的轻肽与重肽的信号强度的相关性见图2。表3显示了36例正常健康对照血浆中维生素D结合蛋白(VDBP)MRM质谱验证数据，表4显示了109例肥胖型糖尿病血浆中维生素D结合蛋白(VDBP)MRM质谱验证数据，表格内ratio为轻肽除以重肽的比值，即该段肽在血中含量比上标准肽的值，R2为轻肽与重肽的信号强度的相关性，其中93.1％的数据R²＞＝0.80。

表3

表4

取母离子-子离子对(783.9_710.4)的定量信息作为该肽段(FPSGTFEQVSQLVK)的定量信息，进行后续数据分析。对正常人和肥胖型糖尿病人该母离子-子离子对(783.9_710.4)所得比值做t-test检验，p值为0.0014，小于0.01，验证了维生素D结合蛋白(VDBP)在肥胖型糖尿病人血浆中蛋白含量显著低于正常人，见图3。

用MRM结果做ROC曲线，曲线下面积：0.69，VDBP cut point＝0.108，灵敏度＝0.692，假阳性率＝0.4444，特异度＝0.5556。

综上所述，维生素D结合蛋白(VDBP)在肥胖型糖尿患者血浆中显著降低，显然与肥胖型糖尿的发生发展有着密切关系，因此该蛋白作为一个分子标记物对其表达量进行检测可用于肥胖型糖尿病发生发展的预测。

实施例4、抗体的制备

本发明人把全长VDBP蛋白(GenBank登录号GI：32483410)注射入兔子体内，获取免疫血清。具体制备方法如下：

VDBP蛋白与弗氏佐剂按照体积比以1∶1混合后，注射到家兔，免疫量0.5mg，每隔2周免疫1次，免疫3次。经常规的亲和纯化后得到针对VDBP蛋白的兔多克隆抗体。

免疫印迹实验显示：获得的兔多克隆抗体只识别VDBP蛋白，基本不识别其它蛋白，可以作为检测肥胖型糖尿病或肥胖型糖尿病患病风险的检测试剂。

将所获得的多克隆抗体、二抗(常规)、显色试剂分别置于不同的容器中，将容器与使用说明书一起置于盒中，获得检测试剂盒。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种维生素D结合蛋白作为肥胖型糖尿病标志物的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的维生素D结合蛋白还包括其蛋白片段，该蛋白片段的氨基酸序列为维生素D结合蛋白所特有。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的维生素D结合蛋白的蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或其中第2-15位氨基酸所示。

4.一种分离的多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1或其中第2-15位氨基酸所示。

5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，其编码权利要求4所述的多肽。

6.一种维生素D结合蛋白的用途，用于制备检测肥胖型糖尿病的试剂。

7.一种特异性识别维生素D结合蛋白或其蛋白片段的试剂的用途，用于制备检测肥胖型糖尿病或区分肥胖型糖尿病高危人群的试剂盒。

8.一种特异性识别维生素D结合蛋白或其蛋白片段的试剂，所述试剂是多克隆抗体。

9.一种检测肥胖型糖尿病的试剂盒，所述试剂盒包含容器，以及置于所述容器中的权利要求8所述的试剂。

10.一种测试条，其包括固相载体，以及附着于所述固相载体上的权利要求8所述的试剂。

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