CN102171572A - 用于糖尿病的生物标记物和测定 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的生物标记物和其组合物。本发明还提供关于检测和监测疾病特别是糖尿病的测定和数据评估方法。具体的，根据本发明的生物标记物包括但不限于，额定的野生型蛋白质变异形式如Gc-球蛋白或GcG(也以结合维他命D的蛋白质公知)，β2-微球蛋白(b2m)，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cysC)，白蛋白(Albumin)和HemA&B。由本发明方法预期的糖尿病的特定形式包括但不限于，1型糖尿病(T1D)，2型糖尿病(T2DM)，pre-T1D，和pre-T2DM。本发明还提供以一种测定检测多种生物标记物的方法并应用能够在疾病，如糖尿病确诊和监测中正确应用这些数据的数据评估方法。

Description

用于糖尿病的生物标记物和测定
发明背景
据估计接近二千四百万的美国人患有糖尿病(总体患有1型和2型糖尿病)，这些人中的大约三分之一不知道本身患有疾病。糖尿病保守地估计是导致美国人死亡的第六诱导因素，并且发现在少数人群中患病率比例失调(具有更大的百分比)。从1990年到2000年的十年以大约50％的比率增加，估计糖尿病在接下来的四十年中会加倍流行，并且在一定程度上被认为是对种族的全球性威胁，导致死亡率增加，生活质量下降以及保健护理成本增加。在2007年，估计糖尿病护理的总费用为1740亿$，其中仅仅在医药支出上就占了总费用的大多数。每年糖尿病导致12,000-24,000的新的失明案例，并且是肾衰的诱导因素，导致具有晚期肾病的大约150,000患者仅在透析治疗上每年花费超过75亿$。其还导致60％的非创伤性下肢截肢(在2002年82,000是因为糖尿病造成的)，从成本计算治病的开销等于国家开销大约每年花费80亿$来进行下肢截肢。考虑到这些主要的缺陷(死亡或伤残)，通过早期检测和治疗可防止(或至少延迟)糖尿病的影响。非药物治疗养生法以改变通常所吃的食物、减轻体重和进行系统锻炼的形式而关注于对生活方式进行干涉。对急性糖尿病的规范药物治疗通过磺脲或甲福明二甲双胍，以及短期作用形式或长期作用形式的胰岛素配方。最近，如由二肽基肽酶-IV抑制剂(例如，Januvia和Galvus)代表的新药物显示出可预期控制血糖水平。此外，目前有超过350种的药物改进候选方案正在开发(例如，GLP-1变异体，DPP-IV抑制剂和SGLT2抑制剂)，使得糖尿病成为关于对健康研究开发方面的仅次于癌症的第二健康威胁。对于所有治疗的及时处理重要的是在早期的诊断，最好是通过在容易获取的生物流体中进行的生物标记物的敏感度检测。同样重要的是(特别是考虑到一些新药物研发)利用生物标记物来监测治疗的有效性。
目前，在糖尿病检测中通常利用两种生物标记物：血糖和糖化血红蛋白(HbA1c)。这两种标记物基本是对血流中血糖升高的直接监测(葡萄糖)和间接监测(HbA1c)。每一种标记物在检测和监测糖尿病中有其自身的用处。葡萄糖是对血糖升高的直接测量，并且用于协助对糖尿病的诊断和治疗监测。HbA1c是长期暴露于升高血糖的测量，时标通常等于血红蛋白体内的半衰期(60-90天)，并且通常用于监测正在进行的糖尿病治疗。两种标记物都可利用单一的临床检测平台(例如，Beckman Coulter SYNCHRON)来测量，但是每一种需要不同的测定方案。葡萄糖通常利用酶测定(己糖激酶)利用分光光度读出进行测量，而HbA1c利用对总血红蛋白的直接分光光度测量与适于测量糖化血红蛋白的浊度免疫抑制结合进行测量。此外，许多点护理装置(例如，Therasense Freestyle(斯而森利舒坦)(血糖)和Bio-Rad in2it(HbA1c))可用于两种标记物，显示出转译更接近于患者的生物标记物和测定的重要性。
两种分析都依赖于对目标生物标记物中的相对少量变化的精确测量。在快速血糖测试中，小于100mg/dL的血糖水平被认为是正常的，而大于126mg/dL的血糖水平被认为患有糖尿病；在浓度上具有大约25％的变化。类似的增加与口服葡萄糖耐量试验(OGTT)相关，此处小于140mg/dL的血糖水平被认为是正常的，而大于200mg/dL的血糖水平指示患有糖尿病(大约40％的变化)。不是测量绝对浓度，而是测量相对于总血红蛋白的糖化血红蛋白。小于6％的HbA1c值是对于正常个体或接受治疗的糖尿病患者的目标值，而大于7％的值指示治疗较差，并且会获准进行治疗上的变化(也就是，在相对量上小至16％的变化被认为是重要的)。对于混合问题，在这些值中存在灰色区域(也就是，100-125mg/dL的空腹血糖；OGTT＝140-200mg/dL；以及HbA1c＝6-7％)，上述通常导致“糖尿病前期”状态。
因此，将健康状态与糖尿病前期状态区分或将糖尿病前期状态与糖尿病状态区分需要比当前可获得的单一标记物可提供的测量更为精确的测量。
因此，需要研发多种新颖的标记物和测定，当利用合适的数据评估方法时其可正确地检测糖尿病以及监测治疗效果。
发明内容
本发明识别新的生物标记物和其组合物。本发明还提供关于检测和监测糖尿病的测定和数据评估方法。具体的，根据本发明的生物标记物包括但不限于，额定的野生型蛋白质变异形式。本发明预期的蛋白质变异可通过本领域内公知的方法进行，包括但不限于，基因变异(GM)，转译后修饰(PTM)和/或代谢改变(MA)。由本发明方法预期的糖尿病的特定形式包括但不限于，1型糖尿病(T1D)，2型糖尿病(T2DM)，1型糖尿病前期(pre-T1D)，2型糖尿病前期(pre-T2DM)。生物标记物、测定和数据评估方法还暗示导致蛋白质相对变异的其他疾病。最重要的是可在存在野生形式蛋白质的情况下明确检测GM，PTM和MA蛋白质形式的测定能力。此外重要的在于以一种测定检测多种生物标记物以及应用数据评估方法(能够在糖尿病确诊和监测中正确应用这些数据)的能力。
因此，本发明的一方面涉及新的生物标记物，包括但不限于，Gc-球蛋白或GcG(也以结合维他命D的蛋白质公知)，β2-微球蛋白(b2m)，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cysC)，白蛋白(Albumin)和HemA&B。
本发明的另一方面涉及通过检测和/或监测生物标记物来检测和监测疾病或紊乱(优选糖尿病)的方法，生物标记物包括但不限于，GM，PTM和MA形式的人类血浆和尿蛋白。
在另一方面，本发明涉及通过利用多种测定来确定与糖尿病相关的GM，PTM，和/或MA的组合以便检测和监测疾病或紊乱(优选糖尿病)的方法。
还在另一发明，本发明涉及通过利用单一测定来同时确定与糖尿病相关的GM，PTM，和/或MA的组合以便检测和监测疾病或紊乱(优选糖尿病)的方法。
在本发明的特定方面，GM，PTM和MA都存在于同一基因产品上并且都可以在单一的基于蛋白质的分析中被检测。
还在另一方面，从根据本发明方法的多种标记物获得的多种数据利用分类算法进一步评估以便确定健康和糖尿病状态。
在另一方面，根据本发明方法的生物标记物与体内寿命相关联以便确定与糖尿病和糖尿病前期状态相关的纵向记录。
在特定的另一方面，根据本发明方法的生物标记物与体内寿命相关联以便确定与糖尿病处理和治疗相关的纵向记录。
通过参照下述详细说明和附图将明了本发明的这些和进一步的其它目的。在该点上，各种参考都在背景部分以及详细说明中引用，每一参考以其整体结合于此作为参考。
附图说明
该专利文件包含至少一幅彩色附图。在提出请求并支付所需费用的情况下将由专利和商标局来提供具有彩色附图的该专利副本。
图1：从四个个体的GcG分析产生的反褶积ESI质谱覆盖图。质谱代表由研究过程中被研究的超过100个个体的分析产生的数据。来自三个主要等位基因产品(Gc-1F，Gc-1S和Gc-2)以及低频变异等位基因(变异体)的信号被指示。此外还对自其相应等位基因产品(除了Gc-2之外)在Δm＝+656Da处的自然糖基化进行观察。给出数据以便示出从应用于人群的GcG的目标性自上而下(“top-down”)分析产生的信息程度。
图2：健康(左列，n＝50个个体)和T2DM(右列，n＝52个个体)的GcG等位基因频率。在T2DM监视受试者中以大于大约5倍的频率观察到Gc-1s。
图3：来自三个个体的GcG质谱覆盖图(所有都是Gc-1f/1f基因类型)：健康(为红色)，T2DM(绿色)以及id-T2DM(蓝色)，示出与T2DM相关的升高的糖化GcG。插页：标准化(normalized)到适于健康(红色；n＝50)，T2DM(绿色；n＝37)以及id-T2DM(蓝色；n＝15)的总GcG整体的糖化GcG的盒须图分布，其中点代表来自受试者的平均值。平均后，糖尿病患者显示在相对的糖化上有4-5倍的增加。
图4：来自三个个体的b2m质谱覆盖图：健康(为红色)，T2DM(绿色)以及id-T2DM(蓝色)，示出与T2DM相关的升高的糖化水平。插页：标准化到适于健康(红色；n＝50)，T2DM(绿色；n＝37)以及id-T2DM(蓝色；n＝15)的总b2m(整合信号)的糖化b2m的盒须图(Box plot)分布。平均后，糖尿病患者显示由于糖化在相应信号上有2-5倍的增加。
图5：来自用于产生图3和图4的相同样本的cysC质谱覆盖图。将升高的糖化指示为：相对于健康(红色)而言，T2DM(绿色)以及id-T2DM(蓝色)。插页：标准化到健康(红色；n＝50)，T2DM(绿色；n＝37)以及id-T2DM(蓝色；n＝15)的总cysC(整合信号)的糖化cysC的盒须图分布。平均后，糖尿病患者显示由于糖化在相应信号上有3-4倍的增加。
图6：来自两个个体：健康(红色)和T2DM(绿色)的C-缩氨酸的质谱覆盖图。与健康个体(1.7％；MW＝2819)相比，在T2DM个体(8.1％；MW＝2819)中观察到存在明显相对较高的des(GluAla)变异体。插页：盒须图代表相对于在样本中存在的所有异构体的des(GluAla)C-缩氨酸的百分含量。对于健康而言的平均值为4.8％，而对于T2DM而言的平均值为9.3％。
图7：来自用于产生图5的相同样本的TTR质谱覆盖图。将升高的TTR磺化(相对于TTR的自然形式)指示为：相对于健康(红色)而言，T2DM(绿色)以及id-T2DM(蓝色)。插页：对于健康(红色；n＝50)，T2DM(绿色；n＝37)以及id-T2DM(蓝色；n＝15)而言，TTR磺化相对于自然TTR的比率盒须图(Box plot)分布。平均后，糖尿病患者显示与健康个体相比在TTR磺化与自然TTR的比率上有大约10倍的增加。
图8：在102个人中的b2m，cysC和GcG的相对糖化。将50个健康样本(红色)与15个id-T2DM样本(蓝色)和37个非-id-T2DM(绿色)的空间分离暗示组合使用的蛋白质糖化生物标记物可用于将健康人群与T2DM患者进行区分。注意GcG值与基因类型无关。
图9：来自图9中所示的102个数据点的主成分分析的得分图-红点指示健康样本，蓝点指示ID-T2DM样本，以及绿点指示非-ID-T2DM样本。主要成分1和2(在此所描绘的)对在原始数据组中观察到94％的变异作出解释，并且用于产生基于SIMCA分类的模型。
图10：由对健康(红色)、T2DM(绿色)和id-T2DM(蓝色)个体的单一分析产生的每一数据点的GcG基因类型和GcG糖化概况。阴影虚线代表作为T2DM指示器的适于依赖于基因类型的糖化的预期参考水平，没有健康控制所显示的15/IS基因类型因此这里没有给出数值。数字(1-4)指示适于在本文中所述个体的值。
图11：利用多个MA的时间监测。三个标记物的每个标记物的相应糖化的值(糖化/总x 100)与体内半衰期相对进行描绘(过去的时间)。由虚线连接的值是得到的适于健康(正方形)、T2DM(倒转的三角形)和id-T2DM(圆圈)受试者的平均值。个体1(X’s)和个体2(向前的斜线)证明具有相对好的维持性，尤其在抽血前的几天。个体3(向后的斜线)和个体4(圆圈)被观察到偏移到他/她的各自种类之内或之外，暗示需要更迫切或更规范的治疗。个体(5)证明在经过几个月之后具有相对好的维持性。
图12A-12D：从健康和T2DM患者(向前的斜线)所取的Alb，ApoA1，Apo C1和TTR的质谱覆盖图(如图所示)。插页显示健康(n＝50)和T2DM(向前的斜线；n＝52)的氧化百分比(当糖化的离子信号整体标准化到所有种类的整体时对每种蛋白质进行测量)。
图13：从健康和T2DM患者(向前的斜线)所取的C-缩氨酸的MSIA质谱。
图14：从健康和T2DM患者(向前的斜线)个体所取的胰岛素的正离子MSIA质谱。
图15：适于表1中所列的八种标记物的接受者操作特性(ROC)曲线，包括S-磺化TTR(S-磺化TTR)，氧化的APO C1(向后的斜线)，糖化的GcG(三角形)，氧化的白蛋白(倒转的三角形)、糖化的白蛋白(正方形)、糖化的CysC(X’s)，糖化的血红蛋白(圆圈)、糖化的B2m(正弦曲线)和氧化的Apo Ai(尖的波浪线)。
图16：将糖化与自糖化的PC1(利用四种蛋白质的不同糖化值的PCA产生)产生的氧化和氧化的PC1(利用三种蛋白质中观察到的不同氧化程度的PCA产生)描绘的图。T2DM个体用X指示。
具体实施例
本发明的一个实施例涉及新的生物标记物，包括但不限于，Gc-球蛋白或GcG(也以结合维他命D的蛋白质公知)，β2-微球蛋白(b2m)，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cysC)，白蛋白(Albumin)和HemA&B。
至于“生物标记物”意味着用作生物状态指示器的物质。如在本申请中所使用的那样，生物标记物是作为正常的生物学过程、致病过程或治疗介入的药理反应指示器进行他觉测量和评估的特性。由本发明预期的特别优选的生物标记物是其检测指示特定疾病或紊乱状态的物质，上述疾病或紊乱状态包括但不限于，糖尿病、心血管疾病、冠状和外周动脉疾病、慢性阻塞性肺疾病、中风、癌症、老年痴呆症、神经病、视网膜病和营养缺乏症；上述为单独的一种或作为与糖尿病关联的共病。本发明还预期指示与疾病危险或进展相关的蛋白质表达或状态变化的生物标记物，或具有进行给定治疗的疾病的敏感性。
根据本发明，生物标记物可以是基因变异(GM)，转译后修饰(PTM)或代谢改变(MA)。预期的生物标记物在从普通的生物环境中检测到的基因产品中找到(例如，血浆、血清、尿、唾液、泪液、汗液或组织提取物。基因变异可包括但不限于，核苷酸多态性，基因点突变，单倍型，等位基因变异和拼接变异体。转译后修饰包括但不限于，关于通常或特定生理学的基因产品的酶和非酶变异。代谢改变包括但不限于，关于疾病病理生理学的基因产品的酶和非酶变异。
本发明还预期适用于检测和监测疾病或紊乱的数据评估测定和/或方法，上述疾病或紊乱不限于，糖尿病、心血管疾病、冠状和外周动脉疾病、慢性阻塞性肺疾病、中风、癌症、ALZheimer疾病、神经病、视网膜病和营养缺乏症；上述单独的一种或作为与糖尿病关联的共病。优选的，本发明涉及适用于检测和监测糖尿病的数据评估测定和/或方法。
相应的，本发明的另一实施例涉及通过检测和/或测定生物标记物来检测和监测疾病或紊乱的方法，生物标记物包括但不限于，GM，PTM和MA形式的人类血浆和尿蛋白。由本发明检测和/或测定的疾病或紊乱不限于，糖尿病、心血管疾病、冠状和外周动脉疾病、慢性阻塞性肺疾病、中风、癌症、老年痴呆症、神经病、视网膜病和营养缺乏症；上述为单独的一种或作为与糖尿病关联的共病。优选的，本发明涉及通过检测和/或测定GM，PTM和MA形式的人类血浆和尿蛋白生物标记物对糖尿病进行检测和监测的方法。
根据本发明的测定可包括常规或非常规形式的基因产品分析，包括但不限于，Immunometeric(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA))，高性能液体色谱(HPLC)，毛细电泳(CE)，二维凝胶电泳(2D-GE)，表面质粒基因组共振(SPR)以及质谱分析(MS)或其组合。
根据本发明的数据评估方法包括但不限于，线性回归，遗传性和显性值的测重和非测重评估，主成分分析(PCA)，分类模拟的软独立建模(SIMCSA)和依时间的评估，诸如遗传性和显性值与疾病状态的关系曲线与时间的关系曲线(或蛋白质半衰期)。
根据本发明的糖尿病的监测和诊断包括但不限于，危险决定因素和起作用的标记物及其组合。本发明预期的检测和诊断还包括组合使用多种标记物以便从健康、糖尿病前期以及糖尿病状态中进行正确区分，以及将健康、糖尿病前期或糖尿病状态与其它疾病区分开。
至于根据本发明的“监测”包括使用一种或多种标记物来明确糖尿病的状态或进展，以及对治疗的反应。
在另一个实施例中，本发明涉及利用多种测定来确定与糖尿病相关的GM，PTM，和/或MA的组合以便检测和监测疾病或紊乱(优选糖尿病)的方法。
还在另一实施例中，本发明涉及通过利用单一测定来同时确定与糖尿病相关的GM，PTM，和/或MA的组合以便检测和监测疾病或紊乱(优选糖尿病)的方法。
在本发明的特定实施例中，GM，PTM和MA都存在于同一基因产品上并且都在单一的基于蛋白质的分析中被检测。
还在另一实施例中，从根据本发明方法的多种标记物获得的多种数据利用分类算法进一步评估以便确定健康和糖尿病状态。
在另一实施例中，根据本发明方法的生物标记物与体内寿命相关联以便确定与糖尿病和糖尿病前期状态相关的纵向记录。
根据本发明，利用下述方法对T2DM进行检测和监测。该方法包括下述导致在受试者体液中的特定蛋白质进行检测的步骤。血浆、血清、尿、唾液、泪液、汗液或组织提取物都是合适体液的所有实例。开始从受试者采集体液样本。在一个实施例中，采集的体液样本是血液。在采集完后，体液准备利用电喷雾质谱(ESI-MS)进行质谱免疫测定(MSIA)。通过采用ESI-MS的MSIA进行的具体准备和测试在下面的实例2中进行更详细的描述。
在另一实施例中，在采集完后，体液准备利用基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)进行MSIA。通过采用MALDI-TOFMS的MSIA进行的具体准备和测试在下面的实例2中进行更详细的描述。
收集针对糖化标记物的由特定质谱仪提供的结果，包括GcG，b2m，cysC，Alb和Hem A&B。此外，收集针对重点的氧化标记物的由特定质谱仪提供的结果，包括白蛋白(Alb)，载脂蛋白A1(Apo A1)，载脂蛋白C1(Apo C1)以及前白蛋白(TTR)。此外，收集针对包括C-缩氨酸(C-pep)和胰岛素的两种酶信号标记物的由特定质谱仪提供的结果。
在T2DM受试者中的糖化标记物将其自身表现为相对于健康受试者的目标蛋白质的MS结果的正质量偏移。这在下面的实例4中进行更详细的描述。具体的，在b2m，cysC，GcG，Alb和血红蛋白A&B链((Hem A&B，其中的一种成分为HbA1c)中发现糖化的比例升高。
在T2DM受试者中的重点氧化标记物将其自身表现为相对于健康受试者的目标蛋白质的MS结果的正质量偏移。这在下面的实例8中进行更详细的描述。具体的，在选择的高密度脂蛋白成分Apo A1，Apo C1以及TTR和Alb中发现氧化程度不同。
在T2DM受试者中的酶标记物(具体为C-缩氨酸和胰岛素)将其自身表现为相对于健康受试者的目标蛋白质的MS结果的负质量偏移，其中某些蛋白质被截断。这在下面的实例7中进行更详细的描述。具体的，在T2DM受试者中以更高的频率以更高的几率观察到C-pep和胰岛素的截断变异体。
利用接受者操作特性(ROC)的初始单变量和利用主成分分析(PCA)和分类模拟的软独立建模(SIMCSA)的所有数据的多变量导致将健康受试者与患有T2DM的受试者良好地区分开。该数据可用于监测在特定受试者中从健康到T2DM的轨线。此外该数据还可用于为受试者提供前几天的糖化水平的回顾分析。
通过下面的非限制性实例对本发明进行进一步的解释说明。
实例1
患有疾病的受试者：健康，2型糖尿病(T2DM)和依赖于胰岛素类 型的2型糖尿病(id T2DM)
下面给出通过对由健康个体(不知道患有疾病；n＝50)、T2DM个体(诊断为T2DM并且通过控制平常饮食、锻炼和非胰岛素药物治疗；n＝37)和id-T2DM个体(依赖于胰岛素，诊断为T2DM并且通过施加胰岛素进行治疗；n＝15)的人群进行初选获得的基因变异、转译后修饰和代谢改变的实例。从禁食8小时后的这些个体中采集EDTA-血浆样本(经告知同意并且认可IRB)，并且在-70℃下储存直到利用下述方法进行分析。还从每个糖尿病患者获得性别、种族、BMI、用药历史以及当前治疗的记录。
实例2
人群蛋白质组学和T2DM
表1示出15种血载标记物(蛋白质&蛋白质变异体)的示范性列表，每一种都能够将健康和T2DM受试者区分开。重要的应该注意到标记物是由于与已知在T2DM诊断或治疗中受到影响的生理学路径相关的PTM的相对调控造成的。
Figure BPA00001256415000141
Figure BPA00001256415000151
血红蛋白MSIA检测HbA1c以及血红蛋白B-链(在+120Da处)的第二PTM以及A-链(+162Da)的糖化。以自然形式相对于所有变异形式(例如，在+119Da处的半胱氨酸化)的耗损检测氧化程度差异。还利用该测定监测(同时)糖化差异。氧化差异是在cys10处发生的磺化(+80Da)增加。在蛋氨酸(+16Da至+48Da)处发生氧化。百分比反映出总的氧化能力。Apo C1具有两种形式，完整的和在n终端Thrpro处截断。C-缩氨酸在n终端谷氨酸丙氨酸(GluAla)处截断-称为C-缩氨酸(3-31)。胰岛素在c-终端Thr(b-链)处截断。该测定还同意检测胰岛素配方的质量偏移，例如，Lantus和Novolog。
在表1的观察栏中，标注的百分比是对于每一蛋白质而言的具体种类的测量值。β2-微球蛋白测量一种形式的相应糖化。半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cysC)测量一种形式的相应糖化。GcG测量一种形式的相应糖化以及与T2DM相关联的基因型数据的三种单倍型。白蛋白测量两种形式的相应糖化以及一种形式的氧化半胱氨酸化。血红蛋白A&B测量一种形式的血红蛋白A的相应氧化以及两种形式的血红蛋白B-链。TTR测量两种形式的相应氧化。Apo C1测量两种形式的相应氧化。C-缩氨酸测量两种形式的相应截断，des(E)和des(EA)。胰岛素测量一种形式的内在胰岛素的相应截断，b-链des(30)以及Lantus和Novolog的用药形式及其截断形式的相对分布。
这些研究对由50个健康个体(不知道患有疾病)以及52个T2DM患者(包括37个诊断为T2DM并且通过控制平常饮食、锻炼和非胰岛素药物治疗的患者和15个依赖于胰岛素，诊断为T2DM并且通过施加胰岛素进行治疗的患者)构成的受试者进行。从禁食8小时后的这些个体中采集EDTA-血浆样本，并且在-70℃下储存直到利用下述方法进行分析。还从每个糖尿病患者获得性别、种族、BMI、用药历史以及当前治疗的记录。
如下利用电喷雾质谱(ESI-MS)进行质谱免疫测定(MSIA)。将人类血浆样本(125μL)在HEPES缓冲盐(HBS)中稀释两倍并且放置到96个容器的滴定板内。利用装有萃取吸液管尖的自控控制系统对蛋白质(和变异体)(根据选择的蛋白质用兔抗人多克隆lgG制备)进行萃取。在萃取后，未明确结合的蛋白质通过用HBS，水，2M醋酸铵/乙腈(3∶1v/v)冲洗而去除，然后再次水洗。接着通过将5μL的蚁酸/乙腈/水(9/5/1v/v/v)抽吸到尖部(覆盖固体支撑物)内对残留的蛋白质进行洗提，在经过短时间(～30秒)后，将洗提的蛋白质排出到洁净滴定板的容器内。接着将洗提物用水稀释两倍为ESI-MS做准备。通常，对24个样本进行平行处理(不是用全部的96个)以便匹配LC/ESI-MS的日输出。利用Bruker microTOFq与Eksigent nanolC*1D低流动性的HPLC结合操作来执行质谱测定。对于这些分析使用捕获和稀释形式的样本浓度/溶剂置换而不是传统的LC。通过Spark Holland Endurance自动取样器以微升提取模式将5微升的样本注入并且由Eksigent nanolC*1D以10μL/min(90/10水/乙腈包含0.1％蚁酸，溶剂A)加载到蛋白质帽捕获器(Michrom Bioresources，Aubum，CA)(配置成在6个端口的转向阀上非直接流动)上。在2分钟后，转向阀位置自动转换，并且在帽捕获器滤筒上的流动速度变为溶剂A的1μL/min(直接流到ESI入口)，1μL/min的溶剂A立即倾斜8分钟成为包含0.1％蚁酸的10/90水/乙腈溶液。10.2分钟后运行结束，并且100％的溶剂A流回。通过使得所有的离子通过质谱测定仪的四重阶段(没有预先选定)以及以500-3000m/z的范围(在5kHZ下取样)监测离子飞行时间以便仅以TOF模式获取数据。对经过蛋白质萃取物的色谱峰顶的记录大约1.5分钟的波谱取平均。在任意反褶积的波峰的任一侧上利用BrukerDaltonics DataAnalysis v3.4软件将ESI饱和状态的包络线进行反褶积到1000Da的质量范围。反褶积的波谱进行基线去除和对所有的波峰进行整合。
利用基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)进行MSIA。根据感兴趣的蛋白质利用装有萃取吸液管尖的自控控制系统对蛋白质和变异体(用兔抗人多克隆lgG衍生)进行萃取。在萃取后，未明确结合的蛋白质通过用HBS，水，2M醋酸铵/乙腈(3∶1v/v)冲洗而去除，然后再次水洗。接着通过将5μL的基体溶液(2∶1v/v，水：用添加0.4％TFA的Sinapinic酸饱和的ACN)抽吸到尖部(覆盖固体支撑物)内对残留的蛋白质进行洗提，并且将基体/蛋白质混合物沉积到为MALDI-TOFMS目标而规格化的96个容器的表面上。利用Bruker Autoflex III以延迟萃取线性模式和200HZ的激光重复速率(Nd:YAG)执行质谱测定。通过将在样本制备内的不同位置所取的25X 100激光照射(每一个满足S/N＞10和辨析率(FWHM)＞1,000的标准)波谱求和而获得波谱(2,500激光照射)。通过基线去除以及随后的每个感兴趣信号的信号整合(相对于基线)对波谱进行处理。对于每个个体，通过将蛋白质的变异形式整体标准化到发现的所有形式的蛋白质而确定变异体(离子信号)的相应值。
实例3
Gc-球蛋白(也称为结合维他命D的蛋白质)：基因变异和转译后 修饰
Gc-球蛋白或GcG(也以结合维他命D的蛋白质公知)是具有标称分子量为～51kDa的血浆蛋白，并且其在血浆中的估计浓度在200-600mg/L。它公知在人群中存在三种高频率的等位基因变异体，Gc-1F，Gc-1S和Gc-2以及其它低频率的变异体。对于GcG而言，主要的生理角色包括维他命D代谢物传输、脂肪酸传输、肌动朊螯合作用以及巨噬细胞活化作用。这样该蛋白质的变异可构成Widesweeping结果的生理事件。
在研究过程中，利用免疫测定萃取之后经过电喷雾质谱测定(ESI-MS)从血液血浆中对基因性和显性变异体进行分析。将人类血浆样本(125μL)在HEPES缓冲盐(HBS)中稀释两倍并且放置到96-容器的滴定板内。利用装有萃取吸液管尖的自控控制系统对GcG(和变异体)(用兔抗人GcG多克隆lgG制备)进行萃取。在萃取后，未明确结合的蛋白质通过用HBS，水，2M醋酸铵/乙腈(3∶1v/v)冲洗而去除，然后再次水洗。接着通过将5μL的蚁酸/乙腈/水(9/5/1v/v/v)抽吸到尖部(覆盖固体支撑物)内对残留的蛋白质进行洗提，在经过短时间(～30秒)后，将洗提的蛋白质排出到洁净滴定板的容器内。接着将洗提物用水稀释两倍为ESI-MS做准备。通常，对24个样本进行平行处理(不是用全部的96个)以便匹配ESI-MS的日输出。利用Bruker microTOFq与Eksigent nanolC*1D低流动性的HPLC结合操作来执行质谱测定。对于这些分析使用捕获和稀释形式的样本浓度/溶剂置换而不是传统的LC。通过Spark HollandEndurance自动取样器以微升提取模式将5微升的样本注入并且由Eksigent nanolC*1D以10μL/min(90/10水/乙腈包含0.1％蚁酸，溶剂A)加载到蛋白质帽捕获器(Michrom Bioresources，Aubum，CA)(配置成在6个端口的转向阀上非直接流动)上。在2分钟后，转向阀位置自动转换，并且在帽捕获器滤筒上的流动速度变为溶剂A的1μL/min(直接流到ESI入口)，1μL/min的溶剂A立即倾斜8分钟成为包含0.1％蚁酸的10/90水/乙腈溶液。10.2分钟后运行结束，并且100％的溶剂A流回。通过使得所有的离子通过质谱测定仪的四重阶段(没有预先选定)以及以500-3000m/z的范围(在5kHZ下取样)监测离子飞行时间以便仅以TOF模式获取数据。对经过GcG萃取物的色谱峰顶的记录大约1.5分钟的波谱取平均。在任意反褶积的波峰的任一侧上利用Bruker Daltonics DataAnalysis v3.4软件将ESI饱和状态的包络线进行反褶积合到1000Da的质量范围。反褶积合的波谱进行基线去除和对所有的波峰进行整合。表格化的质谱波峰面积传输到电子制表软件以便对相应的波峰密度(Peak abundance)进行进一步计算和确定。
图1示出从四个个体的GcG分析产生的重叠合的ESI质谱覆盖图，给出其以便示出由单一测定导致的信息程度。对于三种通常在研究过程中观察到的纯合型基因进行信号观察。示出Gc-1F(MWcalc＝51188.2)，Gc-1S(MWcalc＝51202.2)以及Gc-2(MWcalc＝51215.3Da)。确定的质量(对于以该方式分析的所有样本而言)在计算值的2Da内。在研究过程中以高频率观察到的其它三种类型的基因是这三种类型基因的杂合组合，也就是，Gc-1F/1S，Gc-1F/2，以及Gc-1S/2。但是有时在研究过程中回发现其它基因型变异体，在研究过程中在Population中以低频率出现。此外还指示转译后的变异体，即O-链接的糖化[(NeuAc)1(Gal)1(GalNac)1disaccharides]。注意糖化信号在相对于Gc-1F和Gc-1S类型的基因在相同的质量偏移下观察到，而不是Gc-2类型的基因。该观察到的现象与源自缺乏O-链接糖化优选位置的GcG-2型基因一致(Thr420转变到Lys420)。仅对来自所有受试者(n＝102个个体)的基因型数据评估后，在T2DM受试者中主要发现Gc-1S等位基因(Gc-1S/1S，Gc-1F/1S和Gc-1S/2类型的基因)。如图2中所示，相对于健康受试者，在T2DM受试者中等位基因的频率增加～500％[卡方测验：(2个样本供体类型x3个主要的GcG等位基因；α＝0.01；2度的自由度；x2＝49.6，p＜0.0001；CramerV＝0.474)]。
该实例证明在源自单一基因的产品中存在基因变异(GM)和转译后修饰(PTM)，以及证明了利用单一分析(也就是，以单一的分析模式)同时确定这种变异的能力。
实例4
Gc-球蛋白(也称为结合维他命D的蛋白质)：代谢改变
基于蛋白质分析的独特优势是对于不通过基于核酸测定得到的附加数据进行比对的能力。如图1中所示，利用目标的ESI-MS测定对关于转移后变异的GcG进行进一步的特征分析是可能的。应该注意，取决于个体，在不同的相对强度(它们的相对量的反应)处可观察到诸如自然糖化的各种蛋白质表型(转译后修饰)。该相同的方法可用于筛选关于T2DM的病理生理学的转移后变异和代谢的改变，也就是GcG的糖化变异体。图3示出来自三个个体的GcG质谱覆盖图(所有都是Gc-1f/1f基因类型)：健康(为红色)，T2DM(绿色)以及id-T2DM(蓝色)。在源自患有T2DM的个体的质谱中在162Da处的信号水平增加，质量比自然GcG的质量大。相应于上述的分子量的该偏移预期是由增加1-deoxyfructosyl加合物导致的，其与关于T2DM的血糖水平升高一致。以组观察，在T2DM受试者中的糖化GcG的平均水平(整合离子信号)为比在健康个体中发现的糖化GcG的平均水平高大约4-5倍(参见图3的插页)。
该实例证明在源自单一基因的产品中存在基因变异(GM)和代谢的改变(MA)，以及证明了利用单一分析(也就是，以单一的分析模式)同时分析它们的能力。
实例5
β2-微球蛋白和cystatin C：代谢改变
在连续的基于人群的筛选中，两种其它的血浆蛋白的糖化变体在T2DM受试者中发现以升高的水平出现，这两种其它的血浆蛋白的糖化变体为β2-微球蛋白(b2m)(通常在血浆中以大约1mg/L存在的第一类主要组织相容性合成体的轻链)以及半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cysC)(通常在血浆中以大约0.1mg/L存在的半胱氨酸蛋白酶抑制剂)。测定通过利用兔抗人b2m和cysC的多克隆lgG制备的萃取吸液管尖从GcG测定中使用的同一样本中同时萃取b2m和cysC而进行。在萃取后，未明确结合的蛋白质通过用HBS，水，2M醋酸铵/乙腈(3∶1v/v)冲洗而去除，然后再次水洗。接着通过将5μL的基体溶液(2∶1v/v，水：用添加0.4％TFA的Sinapinic酸饱和的ACN)抽吸到尖部(覆盖固体支撑物)内对残留的蛋白质进行洗提，并且将基体/蛋白质混合物沉积到为MALDI-TOFMS目标而规格化的96个容器的表面上。利用Bruker AutoflexIII以延迟萃取线性模式和200HZ的激光重复速率(Nd:YAG)执行质谱测定。通过将在样本制备内的不同位置所取的25X 100激光照射(每一个满足S/N＞10和辨析率(FWHM)＞1,000的标准)波谱求和而获得波谱(2,500激光照射)。通过基线去除以及随后的每个感兴趣信号的信号整合(相对于基线)对波谱进行处理。对于每个个体，通过将蛋白质的糖化形式(b2m或cysC)整体标准化到发现的所有形式的蛋白质而确定相对糖化值(离子信号)。
图4示出来自三个人的b2m质谱覆盖图：健康(为红色)，T2DM(绿色)以及id-T2DM(蓝色)。与所有波谱相同的是由于野生型的b2m(m/z＝11,730Da)以及基体添加物的信号(芥子酸；在m/z＝11,936&11,954Da)处的信号。与GcG分析类似，在源自患有T2DM的个体的质谱中发现糖化水平的增高，由在162Da处的信号在分子量上比b2m大进行指示。以组观察，在T2DM受试者中的糖化b2m的水平(相对于离子信号)为比在健康个体中发现的糖化b2m的水平高大约2-5倍(参见图4的插页)。
在cysC筛选中获得类似的结果。图5示出自GcG和b2m分析中使用的相同样本产生的cysC和变异体的质谱覆盖图。与所有谱图(Profile)相同的是四种形式cysC的信号：N-终端desSSP(m/z＝13,073Da)，N-终端desS(m/z＝13257/13273，分别在不具有及具有羟基脯氨酸的情况下)，自然的cysC(m/z＝13,344)和羟基脯氨酸cysC(m/z＝13360)，加上野生型的加成物和cysC(m/z＝13550-13584)。此外，在糖尿病患者中发现了糖化cysC(m/z＝13509和13525)的信号。对于GcG和b2m，对三个受试者确定的平均值显示出在来自T2DM受试者的糖化信号上有大约3-4倍的相应增加(见图5插页)。
该实例证明利用单一分析同时确定源自多个基因的多种形式产品的能力，其包括与疾病相关的代谢的改变(MA)。该实例还证明能够同时分析多于一种与疾病相关的MA的多成分测定。
实例6
C-缩氨酸：转译后修饰
在该研究中，利用类似于在实例2-4中使用的那些方法对C-缩氨酸在实例1的血浆中进行定量和半定量分析。图6示出由健康个体和患有T2DM个体获得的波谱。更有趣的，在T2DM患者中存在与健康个体相比的升高水平的先前未报告过的C-缩氨酸的变异体，确定为des(Glu-Ala)异构体，从而建立为适于T2DM的PTM形式的新候选的生物标记物。不意旨受到任何特定机制的限制，据信二肽蛋白酶IV(DPP-IV，CD26，EC 3.4.14.5)归功于该特定裂解产品，其与正在进行的T2DM的病理生理的研究一致。该多功能的跨膜丝氨酸蛋白酶可归功于在该研究中广泛看到的C-缩氨酸的Glu-Ala截断的版本，上述是由于上述酶特异性地将Xaa-Pro或Xaa-Ala从缩氨酸激素的胺基端裂开。考虑到此，在T2DM个体中的相应des(Glu-Ala)C-缩氨酸与健康个体相比的大量增加证实C-缩氨酸的这种特定转译后修饰形式是在T2DM临床诊断中的有效生物标记物并且示出DPP-IV的生物活性。
该实例证明将PTM和MA形式的蛋白质或基因产品用作与疾病相关的酶活性的直接标记物。
实例7
酶信号
糖化和氧化应激将它们自身表达为相对于目标蛋白质的正质量偏移。根据本发明，在关于T2DM的某些蛋白质中存在负的质量偏移-也就是，截断。简要而言，将适于C-缩氨酸(C-pep)和胰岛素(Ins)的(反射式)MALDI-TOFMS MSIA测定被研究以用于在此所述的研究中。在个体中进行初始筛选后，对C-缩氨酸、胰岛素和胰岛素类似物的截断变异体进行识别和观察以便与T2DM受试者相关联。图13示出定量代表由在该研究中检查的个体获得的那些内容的负离子MSIA波谱。在波谱中观察到在m/z＝3017.50Da的单同位素的完整C-缩氨酸信号以及m/z＝2888.49Da和2817.45Da处记录的其它两种信号。用10ppm的精度以及通过利用MALDI-TOF/TOFMS的部分基因序列分析完成，将这些信号分别确定为C-缩氨酸，C-pep(2-31)和C-pep(3-31)。一般在健康和T2DM受试者中观察到这三种信号。在上述受试者中(一名健康的女性)发现一次C-缩氨酸Ala 18Glu的杂合突变点。通过将每一不同定量物种的离子信号标准化到来自所有物种的总体信号而对来自每个个体的波谱数据进行相对的定量分析。接着通过将来自个体的数据分组到它们相应的受试者内而相对于T2DM的存在对每一物种的相应离子信号进行评估。C-缩氨酸(2-31)在健康和T2DM受试者之间显示出极少的差异。但是，发现C-缩氨酸(3-31)的相对分布在两个受试者之间存在相当大的差异。图13插页示出对于C-缩氨酸(3-31)的相应离子信号的两个受试者之间的出现频率比较的矩形图。对于T2DM受试者观察到大约平均(在受试者中的所有个体内进行平均)9.0％的宽范围分布，而相比之下对于健康受试者观察到大约平均4.8％的窄范围分布。向前的斜线为来自健康和T2DM的C-缩氨酸的MSIA波谱。在图13中可以看出在两个受试者内一致地发现两种n-端截断变异体，C-pep(2-31)和C-pep(3-31)。在T2DM受试者中以更高的频率以更高的相对几率观察到C-pep(3-31)(参见图13的插页)。
在受试者上也执行胰岛素MSIA。在图14中示出从健康个体和胰岛素依赖型的T2DM患者(向前的斜线)所取的两个示范性的波谱。在m/zave＝5,808.4Da处发现了完整的内因性胰岛素以便在两个体中进行调控。此外，在T2DM个体中(根据他的医疗纪录)发现了作为独立信号的Lantus的胰岛素同系物(甘精胰岛素；mw＝6,063.7)和Novolog(门冬胰岛素；mw＝5831.6)。根据公知的生理处理，发现初始通过两种C-端精氨酸残留物的去除，接着是次级Thr残留物(来自b-链的C-端)而观察到Lantus降解。但是观察不到与Nololog序列对齐的降解产品，将内因性的胰岛素变异体确定为(在所有的受试者中)截断的b-链的C-端残留物(Des(B30)HI)。类似于C-pep(3-31)，在T2DM受试者中以相对高的分布和频率存在(参见图14的插页)。
实例8
转甲状腺素蛋白(也称为前白蛋白或TTR)：转译后修饰体
以类似于b2m和cysC的上述方式的方式在健康受试者、T2DM受试者和id-T2DM受试者中进行完整TTR的目标性分析。图7示出来自健康个体、T2DM患者和id-T2DM患者的为几种不同变异形式的TTR的质谱图，主要是：自然TTR(m/z 13762)，磺化的TTR(m/z 13842)，半胱氨酸化的TTR(m/z 13881)和Cysteinylglycyl TTR(m/z 13938)。如插页中所示，发现在来自糖尿病患者的血浆样本中，磺化TTR与自然TTR的比率显示出较大的增加。这样一来，磺化TTR通过指示一个个体在过去几天内经受的发炎/氧化应激的通常程度，成为TZDM的辅助标记物。
以类似于蛋白质糖化的方式，在多种蛋白质中发现不同的氧化。图12A至图12D示出健康个体(n＝50)和T2DM(向前的斜线；n＝52)的氧化百分比(当糖化的离子信号整体标准化到所有物种的整体时对每种蛋白质进行测量)。图12A示出取自健康个体和T2DM(向前的斜线)个体的白蛋白(AlB)的质谱覆盖图，图12B示出载脂蛋白A1(Apo A1)的质谱覆盖图，图12C示出载脂蛋白C1(Apo C1)的质谱覆盖图以及图12D示出前白蛋白(TTR)的质谱覆盖图。白蛋白和TTR显示出分别以半胱氨酸化(dm＝119Da)和磺化(dm＝80Da)的形式在其自由半胱氨酸处的不同的氧化程度(在白蛋白波谱中也观察到的由于不同的糖化信号)。载脂蛋白的氧化主要在自由蛋氨酸处以亚砜形式发生(三种为Apo A1以及一种为APO C1)。由于自完整物种的两个n-端氨基酸的截断因此在Apo C1中也发现信号。该实例证明将PTM形式的蛋白质用作T2DM的辅助生物标记物。
实例9
代谢改变数据：健康对T2DM的分类建模
在实例1中所述的个体以上述的测定进行分析。适于GcG，b2m和cysC的MA的前兆图示出以三维空间将健康个体与T2DM个体区分开(图8)。上述区分暗示在进行合适的训练之后，监督分类技术可提供对这三种蛋白质定义正常的糖化“空间”(由椭圆指示)的有效手段，其可作为基线以便区分与T2DM关联在一起的异常糖化。在该点上，来自健康样本(图8中的红点)的数据为了生成分类模拟的软独立建模(SIMCSA)分类的目的进行主成分分析(PCA)(利用商购的软件：The Unscrambler；CamoSoftware，Inc.，Woodbridge，NJ)。
图9示出该PCA的得分图。简要而言，来自健康受试者(n＝50个体；每个个体三个数据值)的数据用全交叉验证和标准化的变量方差(也就是，三个糖化值将相同权重给予到模型)以便建立健康数据的模型。然后将模型用来自所有受试者(n＝102)的数据的挑战以便建立其将健康个体与T2DM个体区分开的实用性。以p＜0.001的有利水平下利用该模型，50个健康样本中的三个被分类为不健康，以及52个T2DM样本中的两个被分类为健康-度量上分别为96％的临床敏感度和94％的特异性。应该注意，测定对于三个判断错误的区分度相当重要，暗示这些个体可能会是并不知情的真正糖尿病患者-也就是，美国人的三分之一的部分不知道他们患有糖尿病。关于判断错误，应该注意到T2DM是具有处于健康和T2DM之间的“灰色区域”的一种疾病，通常称为糖尿病前期。一旦确诊为糖尿病，获得该糖尿病界线状态是用于治疗的真正目的。因此，T2DM的良好处理可解释上述两种判断错误。
总而言之，三种糖化蛋白质的基于SIMCA的分析显示出用于确定和监测T2DM的重要保障，并且代表适于较大挑战项目的处于领先地位的测定。此外，其用作可添加其它标记物(一旦它们被发现)进行改进的技术基础。为了正确评价对于生物标记物改进的该种附加方法，应该注意的是本发明不是通过利用多元分析以便仔细检查较大体积的包含确定和非确定值的波谱数据而开始的。相反，只添加来自确定形式蛋白质显示作为标记物(在该情况下，血浆蛋白的相对糖化值)的保障的数据以便进行分析。以该方式，单独(独立)标记物的值可作为整个分析的一部分进行评估。例如，利用所有三种决定来获得上述的错误判断率和负的比率(分别为6％和4％)。这些度量是经过利用刚才的两种蛋白质进行的改进，例如，仅仅使用b2m和GcG数据导致位居第二位的错误判断率和负的比率(分别为8％和12％)。如果反向观察，会将没有价值的标记物从分析中排除。“建立”多元分析的该方法与临床蛋白质组学的实例相反，临床蛋白质组学中考虑充裕的非目标性波谱数据，多数数据对于预测是不重要的，并且在最坏的情况下由于数据组(64，65)的假象导致错误。因此，通过将不合理(或错误)的值从测量中去除，本发明预期充分利用数据和评估方法以便将疾病正确分类。
该实例证明利用MA和PCA或分类建模的多个值来正确地将健康个体从疾病个体中检测和诊断出来。
实例10
单一测定：GcG的基因型和糖化
基于MS执行的GcG测定的优势在于可以单一测定来获得基因型和蛋白显性(糖化)数据-每一种度量独立地具有针对T2DM检测和监测的值。目前还没有能够产生同等数据的单一分析测定。例如利用当前的技术，可在核酸水平下例如利用单核苷酸多态性(SNPs)分析或基因测序进行GcG基因分型。这样，这三种主要的等位基因形式的GcG的分析将需要至少两种基于基因的能够将两种SNP识别为归因于基因型的测定。来自这种基因分型的数据将与糖化数据结合，其测定有些许不直截了当。类似于HbA1c，对于T2DM检测和监测而言，测量糖化形式的GcG的相应充裕度也是重要的。该测量将需要至少两种测定(例如，基于蛋白质的免疫量度方法)，一种是对所有形式的GcG(分母)，第二种测定能够识别所有的糖化GcG(分子)。总体上必须执行至少四种测定。可以提出其它的分析方案，但是在所有情况下，必须执行多个测定以便产生等价于基于MS测定的数据。
本发明认识到将GcG基因分型(GM)和糖化(MA)结合使用。图10示出两种度量结合在一起使用的结果。来自每一分析的每一点干在给定的个体[健康(红色)，T2DM(绿色)以及id-T2DM(蓝色)]上执行。在X-轴线上限定的是GcG的六个主要基因类型。在Y-轴线上给出的是在个体中发现的糖化GcG的相对充裕度。给出被灰色区域高亮的虚线以便作为糖化GcG(与GcG基因类型相对)的函数将健康个体从T2DM中最佳的区分出来，以及界定可指示充分处理T2DM(或前期T2DM)的个体的范围。除了几个异常值外，存在依赖于基因类型的指示T2DM的糖化GcG水平的上述阈值。该种(单一分析)基因类型的蛋白质的显性测定的前景是重要的。这种测定通过下述发挥其自身价值：1)指示发展成T2DM的可能性；2)检测T2DM，以及3)在个性化水平上监测T2DM的进展(和/或治疗效果)。参照在图2中示出的数据，X-轴可自身阐释为基于基因分型的适于T2DM的预先定位-也就是，测量一个人在其生命中会发展成T2DM的基因危险因子，携带Gc-1S基因类型将会更容易患T2DM。适于糖化的依赖于基因类型的阈值(作为T2DM的指示器)产生更个性化的测定，其基于初始危险因子以及T2DM的病理生理标记物的存在将个体从一般的人群中区分出来-也就是结合使用两个值以便更精确指出何时个体发展成T2DM以及他/她对于治疗的反应。这种区分是个性化药物的基本成分。
该实例证明将源自单一分析的GM和MA组合使用以便确定疾病。该单一测定和数据评估方法能够指示预定位、开始、进展以及对糖尿病治疗的反应。
实例11
多标记物：依赖于时间的评估
来自不同糖化蛋白质(MA)的数据的一个特定新颖的用途是作为时间函数来观察个体的血糖水平(通过三种蛋白质的糖化水平)，瞬时波动可通过与蛋白质体内寿命相关而被观察到。除了明显的T2DM的更精确诊断，在此感兴趣的其它主题是为了更精确地确定前期T2DM的“灰色阴影”，以及为了一旦其被确诊后监测T2DM个体的维持性。据信个体可在利用当前标记物监测的时间点内偏移进T2DM前期或偏移出T2DM前期(或良好地维持)(即刻或在过去的大约90天内)。当一个个体被诊断T2DM的起初筛选掉时(例如，由于测试前的大量快速筛选而进行的低FGT测试(没有用OGTT或HbA1c))上述效果会潜在地导致错误读数。对于已经诊断为T2DM的个体而言，会相对保持真实性(例如，阶段性略过治疗或在空腹葡萄糖测试之前不够空腹的那些)会潜在地导致治疗上的不必要改变。反映个体过去时间中不同时间点的多元测定可提供关于这些问题的一些益处。
图11示出在各种蛋白质糖化中建立瞬时波动的“半衰期时钟”的可能性。示出相对糖化对取样前时间的图。标记物的体内寿命对于b2m、cysC，GcG，AlB、Hem(A&B)分别为大约0.5，2，85，550和2000小时。彩色的虚线将为了在健康(倒转的三角形)和T2DM(正方形)受试者的分析过程中发现的糖化蛋白质的平均值链接起来。给出的还有自图16中指示的五个个体的数据。对于五个个体而言，所有的标记物都低于相应受试者的平均值，表示充分和受控的非基于胰岛素的治疗。个体4呈现大概相同的数据图表，除了在最近过去的时间中糖化升高(以及参照图16，也呈现相对高的氧化应激值)。在另一种极值下，个体1没有正确地进行治疗，或者治疗本身不正确。类似的，在过去的1-2个月内，个体2呈现(极值)升高的糖化，但是在过去的几周内糖化开始降低到相对低的水平。对于先前没有诊断为T2DM的个体3，发现偏移到T2DM水平之内或之外，作为基线的示例，或者为”T2DM前期”状态。最后，应该注意到，当利用糖化的血红蛋白进行测量时个体3，4和5都呈现为大概相同的糖化指数，但是在到达抽血的时间内沿着不同的轨线。
这些依赖于时间的标记物允许基于单一血浆样本的分析对个体的糖化状态进行详细观察。用作监测工具，多点图像提供维持T2DM的个体的详图，其为个性化药物的形式，在此对个体进行相对于他/她本身的长期监测。健康糖化的多点瞬时成像用作可能解决高危险性个体(T2DM前期)必要的基线，在此据信个体可偏移到T2DM状态之内或之外。最后，同时监测短期和长期糖化，关于“是非而是的葡萄糖”其相对于高血糖应激症导致的氧化过激是相对令人感兴趣的。
该实例证明利用多种MA来观察作为时间函数的疾病处理。
实例12
单变量测定和多维分析
利用接受者操作特性(ROC)曲线对每一糖化和氧化过激的标记物进行评估，其反映标记物通过所有可能的测定截断值将健康个体从T2DM个体中区分出来的能力。图15示出在表1中给出的标记物中的八种的ROC曲线。曲线下的面积范围从0.84到0.99，证明将健康受试者与受试者之间进行良好的区分。糖化和氧化过激归因于在产生曲线中利用的蛋白质变异体。
为了生成分类模拟的软独立建模(SIMCSA)分类的目的进行主成分分析(PCA)(利用商购的软件：TheUnscrambler；CamoSoftware，Inc.，Woodbridge，NJ)。图16示出将来自糖化数据的PC1相对于来自氧化数据的PC1绘图的结果。在低糖化、低氧化象限中群集健康的个体，也就是，“健康”糖化和氧化的象限，其用作T2DM的参考点，以及是一旦被确诊后的T2DM的治疗的目的。T2DM受试者中的多数个体落入高糖化、高氧化的象限内。T2DM个体的大约20％(X’s)呈现相对好的糖化控制，但是氧化应激升高。
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Claims (14)

1.用于在受试者内检测和监测疾病或紊乱的方法，包括检测和测定在受试者体液蛋白质内的基因变异(GM)、转译后修饰(PTM)或代谢改变(MA)的生物标记物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中疾病或紊乱是糖尿病。
3.根据权利要求1所述的方法，其中体液蛋白质是血浆或尿蛋白。
4.根据权利要求1所述的方法，其中从多个标记物获得的数据利用分类算法进行进一步评估以便建立健康和糖尿病状态。
5.根据权利要求1所述的方法，其中生物标记物与体内寿命相关联以便建立与糖尿病和糖尿病前期状态相关的纵向记录。
6.根据权利要求1所述的方法，其中生物标记物与体内寿命相关联以便建立与糖尿病的处理和治疗相关的纵向记录。
7.根据权利要求1所述的方法，其中疾病或紊乱选自于由下述构成的组：糖尿病、心血管疾病、冠状和外周动脉疾病、慢性阻塞性肺疾病、中风、癌症、老年痴呆症、神经病、视网膜病和营养缺乏症；上述为单独的一种病或作为与糖尿病关联的共病。
8.根据权利要求1所述的方法，其中生物标记物是选自于由下述构成的组的糖化生物标记物：Gc-球蛋白(GcG)，β2-微球蛋白(b2m)，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cysC)，白蛋白(Albumin)和Hem A&B。
9.根据权利要求1所述的方法，其中生物标记物是选自于由下述构成的组的氧化生物标记物：白蛋白(Albumin)，TTR，Apo A1和ApoC1。
10.根据权利要求1所述的方法，其中生物标记物是选自于由C-缩氨酸(C-pep)和胰岛素构成的组的酶生物标记物。
11.用于在受试者内检测和监测疾病或紊乱的方法，包括通过利用多种测定来确定与疾病或紊乱相关的GM，PTM，和/或MA生物标记物的组合。
12.用于在受试者内检测和监测疾病或紊乱的方法，包括通过利用单一测定来确定与疾病或紊乱相关的GM，PTM，和/或MA生物标记物的组合。
13.根据权利要求11所述的方法，其中GM，PTM和MA生物标记物都存在于同一基因产品上并且都可以单一的基于蛋白质的分析进行检测。
14.根据权利要求12所述的方法，其中GM，PTM和MA生物标记物都存在于同一基因产品上并且都可以单一的基于蛋白质的分析进行检测。
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