CN104379724A - 用于分析物的检测和测量的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

描述了用于具有在其上功能化的、对于靶标实体特异的至少一种适体的感应器，制备和使用该感应器的方法，用于糖基化的蛋白质监测和/或生物标志物。

Description

用于分析物的检测和测量的方法和装置
相关应用的交叉引用
本发明要求2012年1月31日提交的美国临时申请号61,593,054的权益，其全部公开通过引用并入本文。
关于联邦政府赞助研究的声明
本发明不是在任何政府的支持下完成，并且政府对本发明没有权利。
序列表
本发明包含已通过EFS-web提交的序列表，并通过引用将其整体并入本文。ASCII拷贝创建于2013年1月31日，名为420_53354_SEQ_LIST_D2012-15.txt，大小为3,888字节。
技术领域和工业实用性
本发明涉及适体功能化的表面等离子共振(SPR)感应器、制造和使用所述感应器的方法。
背景
下面的描述提供了本公开相关信息的概述，而并不是承认本文所提供信息或引用的出版物是对于本发明的现有技术。
血液蛋白的直接检测可有益于多种科学和临床应用，如用于监测糖尿病中特定蛋白质糖基化比例、药物研究和环境监测的生物标记物、癌症诊断和治疗等等。当前对血液蛋白的临床和实验室测量技术为硼酸盐亲和免疫测定、高性能液相色谱法(HPLC)、基于质谱和毛细管的系统，其耗时且成本高昂。
更有效和快速响应的测量方法可以大大有益于并提高相关的应用领域，特别是用于开发下一代能实时分析的便携式手持诊断装置。最近对几种基于光学的诊断技术，如近红外光谱法、偏振测量法、光学相干断层成像术、表面等离子共振(SPR)、拉曼和荧光光谱法进行研究来监测血液成分。然而由于所研究样本中存在混杂物质的影响而限制许多这些光学方法的有效性。
一种用于体外筛选能高特异性结合靶标分子的核苷酸分子的方法通常被称为SELEX(通过指数扩增的配体系统进化)，其描述于题为“核苷酸配体”的美国专利号5,475,096和题为“核苷酸配体”的美国专利号5,270,163中，所述每个专利特通过引用并入本文。
尽管目前使用的SELEX处理过程是有用的，但一直都需要改进的处理过程，其允许筛选更有选择性的适体由体外筛选技术产生。
发明简述
在一个广泛的方面，本文提供了用于检测靶标实体存在的感应器，其包括具有连接到基质的氨基末端或类似的适体探针，其中当感应器被能量源激发：i)在缺乏靶标实体与适体探针之间的特异相互作用时，发出基准信号；或者ii)在存在靶标实体与适体探针之间的特异相互作用时，发出检测信号，其中的基准信号与检测信号不同，由此检测到靶标实体的选择性存在。
在特定实施方案中，适体探针包括与靶标实体特异性相互作用的核苷酸序列。
在特定实施方案中，靶标实体是如下的一种或多种：大生物分子、小生物分子、有机分子、小分子、核酸、金属离子、蛋白质、酶、肽、药物、染料、癌细胞、病毒、激素或微生物。在特定实施方案中，所述蛋白质是血液蛋白。
在特定实施方案中，所述适体探针包括适体和附着的氨基部分。
在特定实施方案中，所述适体探针包括在基质和氨基部分之间的SAM连接子。
在特定实施方案中，所述带氨基末端的适体探针通过3-巯基丙酸(MPA)连接到基质。
在特定实施方案中，所述感应器具有基于连接子特性的能检测pM-nM的可调检测范围。
在广泛的方面，本文提供一种用于检测靶标实体是否存在于样品中的方法，其包括：i)样品与本文描述的感应器接触；ii)用能量源激发感应器；和iii)确定发出信号的强度，由此确定靶标实体是否存在于样品中。
在特定实施方案中，用表面等离子共振(SPR)来测量能力源。
在特定实施方案中，所述方法具有小于1分钟的反应时间。在特定实施方案中，所述方法在大约室温下具有小于1分钟的反应时间。
在另一个广泛的方面，本文提供用于检测靶标实体的试剂盒，其包括：本文所描述的感应器；和包含感应器的至少一个容器，其中样品可以添加到所述容器中。
在另一个广泛的方面，本文提供用于制备感应器的方法，其包括：i)将自组装单层(SAM)连接子固定化到基质上；和ii)将氨基末端适体固定化到SAM连接子上。
在另一个广泛的方面，本文提供用于制备感应器的方法；其包括：i)用自组装单层(SAM)连接子来功能化基质；ii)将步骤i)中的功能化的基质暴露于具有氨基部分的组合物，其具有足以使氨基部分固定化到SAM连接子上；iii)将步骤ii)中的氨基功能化的基质暴露于至少一种适体，其足以使适体固定化到氨基部分上；iv)可选地，去除非特异性固定化的适体；和v)将步骤iii)或iv)中带氨基末端的适体功能化的基质暴露于封闭剂，其足以封闭被氨基部分活化的未占用的SAM位点。
在特定实施方案中，具有氨基部分的所述组合物缀合到如下的一个或多个：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)(N-(3-dimethylamnopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC))。
在另一个方面，本文提供使用本文所描述的感应器检测血液蛋白的方法。
在另一个方面，本文提供了用于在糖尿病治疗指导的应用中，用于糖基化蛋白的超灵敏和选择性的检测和测量的方法。在一个特定的实施方案中，所述方法包括使用表面等离子共振。
在另一个实施方案中，这种功能化方法可应用于其他感应形式，其包括拉曼和荧光光谱法，并可用来进一步提高现有监测技术的性能。
在另一方面，本文提供用于优化靶向血液蛋白的特异性糖基化形式的适体的体外筛选的方法。在一个实施方案中，表面功能化方法用于基于靶标特征来优化灵敏度和选择性。
在另一方面，本文提供用于进一步减少所研究样本中可能存在的混杂物质的影响的方法。
在另一方面，本文提供一种稳健的、低成本并便携的感应平台，其能够实现与现有大型临床仪器相似的性能。另外，整合的平台在能够评估对胰岛素依赖性糖尿病治疗的依顺性的诊断装置中有用。整合的平台考虑到低成本的手持装置可用于医师办公室或家庭环境中。整合的平台也提供对所收集数据的即时分析，因此允许护理者和/或患者评估患者的长期葡萄糖调节的依顺性。
在另一个广泛的方面，本文提供用于鉴定靶向明确位点(例如，糖基化蛋白位点)的适体的方法，其包括在至少一轮通过指数扩增的配体系统进化(SELEX)富集实验方案中引入非靶标的候选物(例如非糖基化的候选物)，以及在至少第二轮SELEX实验方案中引入非靶标候选来去除对糖基化和非糖基化蛋白形式都有亲和力的适体候选物。
在另一个广泛的方面，本文提供基于靶标和/或适体特征来优化灵敏度和选择性的表面功能化方法，包括：使用二元自组装单层(SAM)形成过程，使用具有所需连接间距和/或长度的连接，其中至少一个连接间距和/或长度的选取是为了基于靶标和/或适体特性来优化表面等离子共振(SPR)灵敏度和选择性。
在另一个方面，本文提供用于优化针对一种或多种分析物的感应器的灵敏度和/或选择性的方法，包括将一种或多种类型的适体连接到具有自组装单层(SAM)连接的基质上，所述SAM连接具有所需的连接间距和/或长度以在基质上形成功能化的表面。为了基于分析物和/或适体特性来优化表面等离子共振(SPR)、拉曼光谱法、或荧光光谱法中至少一种的灵敏度和选择性来选择所需的连接间距和/或长度。
在特定实施方案中，所述SAM连接的至少一种堆积密度和/或长度影响表面等离子共振(SPR)信号。
在特定实施方案中，连接是通过二元SAM和还原解吸附过程。
在特定实施方案中，所述解吸附过程包括将基质的功能化的表面暴露于抗蛋白质吸附的物质来防止蛋白质在功能化的基质上的非特异性吸附。
在特定实施方案中，抗蛋白质吸附的物质包括1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)。
在特定实施方案中，所述SAM连接包括使用巯基SAM固定化方法，其中巯基化合物具有能够与适体形成稳定键的羧基部分。
在特定实施方案中，巯基化合物包括二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)。
在特定实施方案中，使用二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)和(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)形成所述SAM连接，其中PEG3防止蛋白质的非特异性吸附，而且其中在DTSP上的羧基部分与适体形成稳定键合。
在特定实施方案中，二元的SAM巯基溶液用于所述SAM连接中。
在特定实施方案中，通过将3-巯基丙酸(MPA)与(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)的1mM乙醇溶液相混合，同时保持二元SAM的总浓度为约1mM来制备所述二元的SAM巯基溶液。
在特定实施方案中，MPA和PEG3以约20:80、约50:50或约80:20的比例存在。
在特定实施方案中，所述方法进一步包括通过还原解吸附来清除MPA，完整保留PEG3；和允许二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)与适体上的氨基基团共价键合，其中所述适体仅附着到DTSP，并且其中PEG3不形成任何键。
在特定实施方案中，所述适体包括能被固定化到MPA上的胺修饰的适体。
在特定实施方案中，所述表面具有在约5nM-约1000nM范围的最佳动力学。
在特定实施方案中，所述感应器包括混合长度的间隔层。
在特定实施方案中，所述混合长度层包括11-巯基十一烷酸(MUA)与3-巯基丙酸(MPA)相组合。
在特定实施方案中，使用水溶的包含巯基的氨基酸，其能直接结合到表面，以形成自组装单层(SAM)。在特定实施方案中，所述氨基酸包括半胱氨酸。
在另一个方面，本文提供用于形成针对一种或多种分析物的感应器的方法，包括：在基质上吸附由3-巯基丙酸(MPA)和(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)构成的二元组件；从步骤a)基质上还原解吸附MPA；将步骤b)的基质浸入DTSP溶液中以在基质上形成DTSP层；在步骤c)的基质上固定化至少一种类型的适体；并且，将未结合的适体从步骤d)的基质上的PEG3中去除，由此留下附着在基质的DTSP层上的适体。
在另一方面，本文提供用于形成针对一种或多种分析物的感应器方法，包括在乙醇溶液中在金表面基质上吸附由3-巯基丙酸(MPA)和(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)构成的二元组件；在0.5M KOH溶液中从基质上还原解吸附MPA，其中通过对溶液施加30分钟-1.2V的电势而选择性地还原在相分离的MPA和PEG3的二元自组装单层(SAM)中所吸附的MPA；将其上具有PEG3层的基质浸入1mM DTSP溶液中以在其上形成DTSP层；在基质上固定化至少一种类型的适体；并且将适体从基质的PEG3中去除，由此留下附着在基质的DTSP层上的适体。
在特定实施方案中，所述基质具有金表面。
在特定实施方案中，所述分析物包括血液或血清中蛋白质的糖基化形式。
在特定实施方案中，所述方法包括确定总血清蛋白水平中的一部分特定糖基化蛋白。
在特定实施方案中，所述分析物包括人血红蛋白、白蛋白(包括人血清白蛋白(HSA))、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、纤维蛋白原和/或其片段的一个或多个的非糖基化和/或糖基化形式。
在特定实施方案中，分析物包括至少第一种分析物，其具有与至少第二种分析物不同的半衰期，并且所述方法进一步包括量化第一种和第二种分析物来提供关于在一个或多个时间段中第一种和第二种分析物的水平的回顾性判断。
在特定实施方案中，第一种分析物包括血红蛋白并且第二种分析物包括IgM。
在特定实施方案中，所述分析物包括至少第一种分析物，至少第二种分析物和至少第三种分析物，第一种、第二种和第三种分析物的每一种具有不同的半衰期，所述方法进一步包括：量化第一种、第二种和第三种分析物以提供关于在一个或多个时间段中第一种、第二种和第三种分析物的水平的回顾性判断。
在特定实施方案中，第一种分析物包括血红蛋白，第二种分析物包括IgM并且第三种分析物包括白蛋白。
在特定实施方案中，所述方法对监测过去的平均葡萄糖水平是有用的，所述方法包括：将通过本文描述的方法形成的感应器与血液样品相接触；确定血液中糖基化形式的蛋白质的量；和将血液样品中以糖基化形式存在的蛋白质的量与给定时间范围的对照葡萄糖水平相关联。
在特定实施方案中，糖基化形式的蛋白质的量是用表面等离子共振(SPR)来确定。
在另一方面，本文提供用于检测一种或多种分析物的存在的感应器，其中所述感应器是通过本文所述的任一种方法形成的。
在特定实施方案中，所述适体包括能够与一种特定的分析物相互作用的核苷酸序列。
在特定实施方案中，所述感应器能够与选自如下的一种或多种分析物相互作用：大生物分子、小生物分子、有机分子、小分子、核酸、金属离子、蛋白质、酶、肽、药物、染料、癌细胞、病毒、激素或微生物。
在特定实施方案中，所述分析物是如下的一种或多种：生物样品、环境样品、化学样品、药物样品、食品样品、农业样品和兽医样品。
在特定实施方案中，所述蛋白质为血液蛋白。
在特定实施方案中，所述感应器具有基于连接子特性的能检测pM至nM的可调检测范围。
在特定实施方案中，所述感应器具有小于1分钟的反应时间。
在特定实施方案中，所述感应器在大约室温下具有小于1分钟的反应时间。
在另一方面，本文提供用于检测一种或多种分析物的试剂盒，其包括：本文描述的感应器；和包含感应器的至少一个容器，其中样品可以添加到所述容器中。
在另一方面，本文提供用于减少样本中可能存在的至少一种混杂物质的影响的方法，其包括：将一个或多个亲水基团并入到基质上的非结合位置，其足以基本上减少/防止混杂物质的非特异性吸附，将适体连接到具有自组装单层(SAM)连接的基质上，所述SAM连接具有所需的连接间距和/或长度以形成在基质上的功能化的表面，以及通过SPR感应器在超过普通SPR检测限度的分隔距离上检测适体结合反应。
本文还描述了一种方法，其使用表面等离子共振(SPR)光谱法以及为用户开发的基于适体的功能化的感应器表面，以在测试环境中检测和/或量化一种或多种靶标分子或其片段。所述方法允许检测和/或测量具有大范围半衰期的分子，包括但不限于具有半衰期比血红蛋白短的靶标分子。而且，所述方法可在不使用标签或标记(例如荧光染料或光交联)的情况下来进行。所述方法也具有低的样品消耗，并提供快速响应时间(一般为数秒)，使其在评估血糖依顺性的应用上是有用的。
在另一方面，本文提供感应器，其包括：连接到具有自组装单层(SAM)连接的基质上的一种或多种类型的适体，所述SAM连接具有所需的连接间距和/或长度以形成在基质上的功能化的表面，为了基于分析物和/或适体特性来优化表面等离子共振(SPR)、拉曼光谱法、或荧光光谱法中至少一种的灵敏度和选择性来选择所需的连接间距和/或长度。
在特定实施方案中，所述SAM连接的至少一种堆积密度和/或长度影响表面等离子共振(SPR)信号。
在特定实施方案中，所述连接是通过二元SAM和还原解吸附过程。
在特定实施方案中，所述基质的功能化的表面已暴露于抗蛋白吸附的物质，其足以抑制蛋白质在功能化的表面上的非特异性吸附。
在特定实施方案中，抗蛋白质吸附的物质包括1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)。
所述SAM连接包括具有能够与适体形成稳定键的羧基部分的巯基化合物。
在特定实施方案中，巯基化合物包括二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)。
在特定实施方案中，使用二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)和(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)形成所述SAM连接，其中PEG3防止蛋白质的非特异性吸附，而且其中在DTSP上的羧基部分与适体形成稳定键合。
在特定实施方案中，二元的SAM巯基溶液用于所述SAM连接中。
在特定实施方案中，通过将3-巯基丙酸(MPA)与(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)的1mM乙醇溶液相混合，同时保持二元SAM的总浓度为约1mM来制备所述二元的SAM巯基溶液。
在特定实施方案中，MPA和PEG3以约20:80、约50:50或约80:20的比例存在。
在特定实施方案中，通过还原解吸附清除MPA，完整保留PEG3；和二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)与适体上的氨基基团共价结合，并且PEG3不形成任何键。
在特定实施方案中，所述适体包括能被固定化到3-巯基丙酸(MPA)上的胺修饰的适体。
在特定实施方案中，所述表面具有在约5nM-约1000nM范围的最佳动力学。
在特定实施方案中，所述感应器包括混合长度的间隔层。
在特定实施方案中，所述混合长度层包括11-巯基十一烷酸(MUA)与3-巯基丙酸(MPA)相组合。
在特定实施方案中，所述SAM连接包括水溶的包含巯基的氨基酸，其能直接结合到基质的表面。
在特定实施方案中，所述氨基酸包括半胱氨酸。
在另一方面，本文提供了感应器，其中基质的至少表面是金的。
在特定实施方案中，感应器配置为感应包括血液中蛋白质的糖基化形式的分析物。
在特定实施方案中，感应器配置为从总血清蛋白水平中确定一部分特定的糖基化蛋白。
在特定实施方案中，所述分析物包括如下的一种或多种：人血红蛋白、白蛋白(包括人血清白蛋白(HSA))、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、纤维蛋白原和/或其片段，所述分析物为糖基化或非糖基化形式。
在特定实施方案中，分析物包括至少第一种分析物，其具有与至少第二种分析物不同的半衰期。
在特定实施方案中，第一种分析物包括血红蛋白并且第二种分析物包括免疫球蛋白M(IgM)；并且其中第一种分析物或第二种分析物以糖基化形式或非糖基化形式存在。
在特定实施方案中，所述分析物包括至少第一种分析物，至少第二种分析物和至少第三种分析物，第一种、第二种和第三种分析物的每一种具有不同的半衰期。
在特定实施方案中，第一种分析物包括血红蛋白，第二种分析物包括IgM并且第三种分析物包括白蛋白；其中第一种分析物、第二种分析物或第三种分析物的一种或多种是以糖基化形式或非糖基化形式存在。
在另一方面，本文提供了使用本文所描述的感应器的任一种来监测过去的平均血液分析物水平，其通过：将用本文所描述的方法形成的感应器与血液样品相接触；确定血液中分析物的糖基化形式的量；并将血液样品分析物中以糖基化形式存在的分析物的量与给定时间范围的对照水平相关联。
在特定实施方案中，所述蛋白质的糖基化形式的量使用表面等离子共振(SPR)来确定。
在特定实施方案中，所述适体包括能够与特定的分析物相互作用的核苷酸序列。
在特定实施方案中，所述感应器能够与选自如下的一种或多种分析物相互作用：大生物分子、小生物分子、有机分子、小分子、核酸、金属离子、蛋白质、酶、肽、药物、染料、癌细胞、病毒、激素或微生物。
在特定实施方案中，所述分析物是如下的一种或多种：生物样品、环境样品、化学样品、药物样品、食品样品、农业样品和兽医样品。
在特定实施方案中，所述蛋白质为血液蛋白。
在特定实施方案中，所述感应器具有基于连接子特性的能检测pM-nM的可调检测范围。
在特定实施方案中，所述感应器具有小于1分钟的反应时间。
在特定实施方案中，所述感应器在约室温下具有小于1分钟的反应时间。
在特定实施方案中，所述感应器包括适体，其中所述适体包括与SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15中任一的完整序列有至少70％同一性的DNA序列。
在另一方面，本文提供用于检测一种或多种分析物的试剂盒，其包括：本文所描述的任意一种或多种感应器；和包含感应器的至少一个容器，其中样品可以添加到所述容器中。
在特定实施方案中，所述试剂盒还包括一种或多种固体支持物、用于从洗脱物中分离感应器的一种或多种分离剂，以及用于从感应器中分离适体的一种或多种试剂。
在另一方面，本文提供从其中具有单个靶标位点结合适体和非靶标蛋白结合适体的核酸库中鉴定出单个靶标位点结合适体的方法，其包括：
a)向到核酸库中加入单个位点靶标蛋白复合物，其中库中存在的单个靶标位点结合适体和非靶标蛋白结合适体结合到单个位点靶标蛋白复合物上，并形成单个靶标位点结合适体+非靶标蛋白结合适体+单个位点靶标蛋白复合物；
b)从库中分离单个靶标位点结合适体+非靶标蛋白结合适体+单个位点靶标蛋白复合物；
c)将所述单个靶标位点结合适体和非靶标蛋白结合适体从单个位点靶标蛋白复合物上洗脱；
d)向上面步骤中的洗脱物中加入非靶标蛋白复合物，其中存在于步骤c)中的所述非靶标蛋白结合适体结合到非靶标蛋白复合物，并形成非靶标蛋白结合适体+非靶标蛋白复合物；
e)将非靶标蛋白结合适体+非靶标蛋白复合物从上面步骤的洗脱物中分离出来，在洗脱物中留下单个靶标位点结合适体；并且，
f)从洗脱物中分离单个靶标位点结合适体；任选地，进一步扩增单个靶标位点结合适体。
在特定实施方案中，所述单个靶标位点结合适体用来选择如下的一种：血红蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)和白蛋白。
在特定实施方案中，所述单个靶标位点结合适体选自：SEQ IDNO:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
在特定实施方案中，所述单个位点靶标蛋白固定化到固体支持物上。
在特定实施方案中，所述非靶标蛋白复合物固定化到固体支持物上。
在特定实施方案中，所述固体支持物包括磁珠、层析基质、微量滴定盘或阵列。
在另一方面，本文提供结合到糖基化的血红蛋白的适体，其中所述适体包括选自SEQ ID NO:4和5的核酸序列。
在特定实施方案中，所述糖基化的血红蛋白为人血红蛋白。
在特定实施方案中，所述适体对于人血红蛋白具有100nM或更小的解离常数。
在另一方面，本文提供结合到糖基化的血红蛋白的适体，其中所述适体包括选自SEQ ID NO:4和5的核酸序列，以及5’-连接子和3’-连接子中的一个或多个。
在特定实施方案中，所述连接子为自组装单层(SAM)。
在另一方面，本文提供适体，其与SEQ ID NO:4和5中任一的完整序列有至少70％同一性并结合到糖基化的人血红蛋白。
在另一方面，本文提供了物质的组合物，其包括缀合到核酸适体分子的自组装单层(SAM)，所述核酸适体分子含有能特异地结合糖基化的血红蛋白的区域的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列选自SEQID NO:4和5。
在另一方面，本文提供结合到非糖基化的血红蛋白的适体，其中所述适体包括选自SEQ ID NO:6和7的核酸序列。
在特定实施方案中，所述非糖基化的血红蛋白为人血红蛋白。
在特定实施方案中，所述适体对于人血红蛋白具有100nM或更小的解离常数。
在另一方面，本文提供了结合到非糖基化的血红蛋白的适体，其中所述适体包括选自SEQ ID NO:6和7的核酸序列，以及5’-连接子和3’-连接子中的一个或多个。
在特定实施方案中，所述连接子为自组装单层(SAM)。
在另一方面，本文提供了适体，其与SEQ ID NO:6和7中任一的完整序列有至少70％同一性并结合到非糖基化的人血红蛋白。
在另一方面，本文提供了物质的组合物，其包括缀合到核酸适体分子的自组装单层(SAM)，所述核酸适体分子含有能特异地结合非糖基化的血红蛋白的区域的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列选自SEQ ID NO:6和7。
在另一方面，本文提供了结合糖基化的血清白蛋白的适体，其中适体包含选自SEQ ID NO:3、8和9的核酸序列。
在特定实施方案中，所述糖基化的血清白蛋白为糖基化的人血清白蛋白。
在特定实施方案中，所述适体对于糖基化的人血清白蛋白具有100nM或更小的解离常数。
在另一方面，本文提供了结合到糖基化的血清白蛋白的适体，其中所述适体包括选自SEQ ID NO:3、8和9的核酸序列，以及5’-连接子和3’-连接子中的一个或多个。
在特定实施方案中，所述连接子为自组装单层(SAM)。
在另一方面，本文提供了适体，其与SEQ ID NO:3、8和9中任一完整序列有至少70％同一性并结合到糖基化的人血清白蛋白。
在另一方面，本文提供了物质的组合物，其包括缀合到核酸适体分子的自组装单层(SAM)，所述核酸适体分子含有能特异地结合糖基化的血清白蛋白的区域的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列选自SEQ ID NO:3、8和9。
在另一方面，本文提供了结合到非糖基化的血清白蛋白的适体，其中所述适体包括选自SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15的核酸序列。
在特定实施方案中，所述非糖基化的血清白蛋白为糖基化的人血清白蛋白。
在特定实施方案中，所述适体对于非糖基化的人血清白蛋白具有100nM或更小的解离常数。
在另一方面，本文提供了结合到非糖基化的血清白蛋白的适体，其中所述适体包括选自SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15的核酸序列，以及5’-连接子和3’-连接子中的一个或多个。
在特定实施方案中，所述连接子为自组装单层(SAM)。
在另一方面，本文提供了适体，其与SEQ ID NO：10、11、12、13、14和15中任一的完整序列有至少70％同一性并结合到非糖基化的人血清白蛋白。
在另一方面，本文提供了物质的组合物，其包括缀合到核酸适体分子的自组装单层(SAM)，所述核酸适体分子含有能特异地结合非糖基化的血清白蛋白的区域的多核苷酸序列的，其中多核苷酸序列选自SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15。
在特定实施方案中，所述适体包括至少一种化学修饰。
在特定实施方案中，所述修饰选自：在糖位点的化学替换、在核苷酸之间连接的化学替换和在碱基位点的化学替换。
在另一方面，本文提供了试验试剂，其包含有效量的本文所描述的适体或其盐，以及其支持物。
在另一方面，本文提供了试剂盒，其包含至少一种本文所描述的适体。
在特定实施方案中，所述适体为聚乙二醇化的。
在特定实施方案中，所述聚乙二醇化的适体分子包括1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)。
在特定实施方案中，使用二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)和(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)形成所述SAM连接。
在特定实施方案中，所述适体包含至少一种化学修饰。
在特定实施方案中，所述修饰选自：在特定实施方案中的在糖位点上的化学替换，在核苷酸之间连接的化学替换和在碱基位点的化学替换。
试验试剂，其包含有效量的一种或多种本文所描述的适体或其盐，以及其支持物。
试剂盒，其包含一种或多种本文所描述的适体。
在另一方面，本文提供了纯化和分离的非天然发生的DNA序列，其选自SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
在另一方面，本文提供了用于减少样本中可能存在的至少一种混杂物质的影响的方法，其包括：a)将一个或多个亲水基团并入基质上的非结合位置，其足以基本上减少/防止混杂物质的非特异性吸附，b)将适体连接到具有自组装单层(SAM)连接的基质上，所述SAM连接具有所需的连接间距和/或长度以形成在基质上的功能化的表面，和c)通过SPR感应器在超过普通SPR检测限度的分隔距离上检测适体结合反应。
本发明的其他系统、方法、特征和优势对于本领域技术人员在查阅下面的附图和细节描述后是显而易见的。所有这些附加的系统、方法、特征和优势都包括在本描述中，是在本发明的范畴内，并被附带的权利要求所保护。
附图简述
专利或应用程序的文件可能包含一个或多个彩色绘制的图和/或一个或多个照片。当提出请求并支付必要费用，专利局将提供带彩色的图和/或照片的本专利或专利申请出版物的副本。
图1：感应表面功能化方法的示意图。
图2：阻抗谱的奈奎斯特图，其来自含有5mM Fe(CN)6 3-/Fe(CN)6 4-的100mM PB溶液(pH7.2)(柱A)裸Au(金)；(柱B)Au/MPA/EDC-NHS/EA/PPA；(柱C)Au/MPA/EDC-NHS/EA/PPA/APT1。右图显示每一层的(Ret)。在0.1Hz-100kHz的频率范围潜在振幅为5mV均方根(rms)以10倍频率内点数为10来收集阻抗谱。
图3：图形显示了通过磁珠耦合法得到的适体/凝血酶结合比，以mol表示。
图4：图形显示了裸Au与适体修饰感应器的SPR反应。所有的数据点为三次实验读数的平均。样品为单独的凝血酶(上面的图)和带有400nM BSA的凝血酶(下面的图)。嵌入图是相同数据以对数刻度绘制以允许更低浓度下更好的可视化。
图5：图形显示不同感应表面的SPR反应，即对于400nM BSA(BSA组)、500nM凝血酶(凝血酶组)和带有400nM BSA的500nM凝血酶(凝血酶+BSA组)。误差线代表从三个新鲜制备样品确定的数值的标准偏差。
图6：图形显示不同感应表面的SPR反应，即对于带有和不带有400nMBA的50nM、250nM、500nM凝血酶，上坐标轴(APT1)，下坐标轴(APT2)；下坐标轴的零点已被故意地移位以更好的区分会重叠的点。
图7：被激活的表面等离子体的示意图。
图8a：具有Kretschmann配置的SPR的示意图。
图8b：因折射率改变而产生的共振角移位的示意图。
图9：在附着到SPR感应表面的SAM表面上固定化的适体结合HbA1c的示意图(上面)；和因折射率改变而产生的共振角移位的示意图(下面)。
图10：图形显示对于不同糖基化水平的HSA(％百分比；糖化/总蛋白)的SPR反应。注意：每个样品的总蛋白浓度恒定为1μg/mL总蛋白的水平。(绿色)适体功能化的表面，(红色)裸Au表面。
图11a-11e：对于DTSP-PEG3二元SAM形成的还原解吸附的示意图：(图11a)在Au上的MPA和PEG3的共吸附；(图11b)MPA的还原解吸附；(图11c)DTSP的吸附；(图11d)适体固定化；和(图11e)从PEG3去除适体。
图12：对于SELEX过程的MB反选择的示意图。
发明详述
贯穿本公开，各种出版物、专利和出版的专利说明书通过标识引用来作为参考。这些出版物、专利和出版的专利说明书所公开的内容通过引用并入本公开以更充分的描述本发明所属的目前工艺水平。
定义
本说明书引用的所有出版物、出版的专利文献和专利申请表明了本发明涉及的本领域技术水平。本文所引述的所有出版物、出版的专利文献和专利申请特此以引用方式都并入，程度上相同与每个人出版、出版的专利文献或专利申请被具体地和单独地表明了通过引用方式而并入。
除非内容明显另外指示，如本说明书包括权利要求中所用到的单数形式“一”，“一个”和“一种”包括复数个指示物，并且可与“至少一个”和“一个或多个”互换使用。那就是说，提到“一个适体”包括适体的混合物，提到核苷酸包括核苷酸的混合物，依此类推。
本文所用术语“大约”代表数值的无关紧要的修饰或变化，如此以致数值所相关的项目的基本功能是不变的。
本文所用术语“包括(comprises)”，“包括(comprising)”，“包括(includes)”，“包括(including)”，“包含(contains)”，“包含(containing)”及其变体，旨在涵盖非排他的包括，如此以致包括(comprises)、包括(includes)或包含(contains)一种元素或一系列元素的过程、方法、方法限定产物(product-by-process)或物质的组合物不仅包括那些元素而且可包括对于这些过程、方法、方法限定产物(product-by-process)或物质的组合物的没有明文列出的或不是固有的其他元素。
本文所用术语“适体”表示能够结合特定的靶标实体的寡核苷酸或肽分子。通常，适体为人造的寡核苷酸，因为其对各种靶标化合物的高亲和力和选择性而可充当抗体模拟物，所述靶标化合物的范围从小分子例如药物和染料到复合生物分子如酶、肽和蛋白质。通过称为通过指数扩增的配体系统进化(SELEX)的体外迭代过程，从随机寡核苷酸库中可鉴定出针对特定的靶标化合物的订制的适体。SELEX过程的实例参见美国专利申请号5,270,163；5,475,096；和5,567,588，其通过引用整体并入本文。
类似于抗体，适体可形成3D结构充当对其靶标化合物特异的受体。适体也具有多个超越抗体的优势，例如对范围广泛的pH和盐浓度耐受、热稳定性、容易合成以及成本效益。适体的特异性和亲和力如果不高于抗体，也是与抗体可比的。适体也能可逆地变性来释放靶标化合物，其使适体成为对于生物感应应用来说特别有用的受体。
例如，适体可由的单链(ss)寡核苷酸和/或化学合成的肽构成，其通过反复多回合的体外筛选或本领域技术人员可辨识的相当的技术来构建，以结合各种靶标。
“适体”或“核酸配体”是一类或各种具有特定核苷酸序列的核酸分子的一套拷贝。适体可包括任何合适数量的核苷酸。“适体”是指一套以上这样分子。不同的适体可具有相同数量或不同数量的核苷酸。适体可是DNA或RNA并可以是单链、双链或包含双链区域。
应该理解适体和分析物或靶标之间的亲和相互作用是程度的问题。也就是说，适体的对于其靶标的“特异性结合亲和力”意为所述适体与其适体结合的亲和力远远高于这种适体可与混合物或样品中的其他非靶标成份结合的亲和力。
本文所有术语“扩增(amplification)”或“扩增(amplifying)”意为增加分子或一类分子的量或拷贝数量的任何过程或过程步骤的组合。
本文所用“库(pool)”是从中筛选所需配体的不同序列的核酸的混合。库的来源可从天然产生的核酸或其片段、化学合成的核酸、酶促合成的核酸或上述技术的组合产生的核酸。修饰过的核苷酸例如具有可检测的标签、反应基团或其他修饰的核苷酸，可并入到库里。在特定实施方案中，本文所描述的SELEX过程和/或改进的SELEX方法可用来制备库。库也可以包括具有一个或多个共同的结构部分的核酸，如此以致所述核酸可通过结构来分离，并不通过化学、大小或其他的分离方法。本文所用的库也有时指“文库(library)”或“候选或核酸混合物”。例如，RNA库指由RNA组成的候选混合物。
本文所用“核酸”，“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用来指任何长度的核苷酸的聚合物，并且这些核苷酸可包括脱氧核苷酸、核糖核苷酸和/或类似物，或者化学修饰的脱氧核苷酸或核糖核苷酸。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”包括双链或单链分子以及三倍螺旋分子。
本文所用术语“感应器”表示测量物理量并将其转换成可被观测者或仪器读出的信号的装置。能理解感应器根据已知的标准校准。因此，通过利用适体对靶标实体的亲和力，感应器可用来捕获靶标实体，并可使用技术人员在阅读本公开后可辨识的技术来检测。
本文所用术语“检测(detect)”或“检测(detection)”表示确定在有限空间内的靶标或信号的存在(existence)、出现(presence)或客观事实(fact)，其包括但不限于样品、反应混合物、分子复合物以及包括平台和阵列在内的基质。当其指代、关于、涉及对靶标或信号的量或数量的测量(也指代量化)，检测是“量化的”，其包括但不限于设计来确定所述靶标或信号的量或比例的任何分析。当其指代、关于、涉及依据对其它靶标或信号的相对丰度来识别所述靶标或信号的品质或种类(其未被量化)时，检测是“定性的”。“光学检测”表示通过视觉上可检测的信号来进行的检测：来自目的靶标或附着至靶标的探针的光谱或图像。
术语“标记试剂”，“标记”，或“可检测的部分”，或“可检测的元素”，或“可检测的组分”是指可用来检测靶标分子/适体复合物的一个或多个试剂。可检测的部分或标记是能被直接或间接检测的。
术语“靶标”，“靶标实体”或“分析物”可在本文互换，并一般是指一种物质、化合物或组分，其在样品中的存在或不存在必须被检测到。分析物包括但不限于生物分子并且特别是生物标记物。本文所用术语“生物分子”表示与生物环境相关的物质、化合物或组分，包括但不限于蔗糖、氨基酸、肽、蛋白质、核苷酸、多聚核酸、多肽、有机分子、半抗原、表位、生物细胞、生物细胞的部分、维生素、激素等等。术语“生物标记物”表示与生物环境的特定状态(包括但不限于细胞周期的阶段、健康和疾病状态)相关的生物分子。生物标记物的存在、不存在、减少、上调与特定状态相关或指示特定状态。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”旨在包含任意长度的氨基酸的聚合物，线性或分支的，其可能被或未被天然地或介入地修饰，例如通过糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、二硫键形成、接合或其他操作或修饰。
术语“固体支持物”意指具有分子可直接或间接地通过共价或非共价键附着的表面的任何基质。基质材料可以是天然发生的、合成的或天然发生材料的修饰。固体支持物材料可包括磁珠或能具有一个或多个功能基团的其他任何材料，所述功能基团例如任意氨基、羧基、巯基或羟基功能基团，比如并入到其表面。固体支持物可采用各种配置中任一种，范围从样品到复合物，并具有若干形状中任一，包括珠、盘、粒子、平板、棒、条、管、孔等等。所述表面可以是相对平面(例如，薄片)，球形(例如，珠)，圆柱体(例如，柱子)，或凹槽状。
术语“分离”意指借以将混合物中的一个或多个组分从混合物其他组分中分离出来的任何过程。例如，结合到靶标分子的适体可从其他没有结合到靶标分子的核酸和从非靶标分子中分离出来。也就是，分离过程或步骤允许将候选混合物中的全部核酸基于其针对靶标分子的相对亲和力和/或解离速率分离成至少两个库。分离过程可通过各种方法完成。例如，其上缀合有靶标分子的磁珠可用于分离混合物中的适体。作为另一个实例，表面等离子共振(SPR)技术可用于分离混合物中的核酸，通过将靶标固定化到感应器芯片上并将混合物流过芯片，其中具有针对靶标的亲和力的那些核酸可结合到靶标上，而且他核酸可被洗掉。
本文所用术语“样品”是指混合物、气体、或者可能包含或不包含靶标或分析物的物质。样品包括但不限于生物样品，例如血液、痰、呼气、尿、精液、唾液、羊水、脑膜液、腺体液、乳头抽出物、淋巴液、支气管抽出物、关节抽出物、滑液、细胞提取物、脑脊液、来自粪便或组织样品的匀浆的固体材料、细菌培养物、病毒培养物或其实验分离片段。
术语“非靶标”是指与适体形成非特异性复合物的样品中的分子。需领会对于第一个适体是非靶标的分子可能是第二个适体的靶标。类似地，对于第一个适体是靶标的分子可能对第二个分子是非靶标。
一般说明
所述方法和装置提供了系统，其具有所需的高亲和力和特异性从而能够在所需测试环境中和灵敏的浓度下检测糖基化的蛋白。
在一个特定的方面，所述方法包括从总血清蛋白水平中确定特定的糖基化的蛋白的比率(fraction)。这种蛋白质的非限制性的实例包括：人血红蛋白、白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA))和IgM蛋白。
体内两个常见的糖基化的蛋白是血红蛋白A1c(HbA1c)和免疫球蛋白M(IgM)(其为存在于B细胞的一种基本抗体)。HbA1c和IgM在体内具有不同的半衰期，例如HbA1c为～6-8周，而IgM为～1周。因此，血清中这些糖基化的蛋白的量化提供关于在较短和较长时期的血糖控制的回顾性判断。所述方法克服了其他测试的首要不足，在其他测试中只有一种类型的糖基化的血清蛋白可被检测；并且因此关于葡萄糖控制的任何依顺性评估限于仅一个固定时期。也要注意本方法克服了限制测定结果的其他不足，例如来自血红蛋白病、溶血、贫血的干扰。
应理解，在本文所描述的方法/装置的其他特定的实施方案中，一个或多个其他分子或其片段，例如其他糖基化的蛋白可被精确地测试。因为所述方法促进除血红蛋白或位点特异性HbA1c之外的糖基化的血液蛋白的检测和测量，所述方法也对其他用来评价血糖控制的技术是有用的。
在特定实施方案中，可以完成糖基化的蛋白的目标历史时间记录从约数天到约6周的时期，取决于所评估的特定的糖基化的蛋白，因为糖基化的蛋白在血中具有不同半衰期。相比之下，先前的测试局限于评估仅一个固定时期。
这种方法和使用这种方法的平台是高度的小型化的并在提供实时检测和分析的手持装置中是有用的。
所述方法具有在分析物的医学测试中有用所必需的灵敏度。
所述方法进一步允许不同种类蛋白质的评估，例如糖基化的血红蛋白和其他糖基化形式的血液蛋白。
本文所描述的一个方法中，表面等离子共振与高度功能化的适体感应表面一起使用以提供一种精确、快速和相对低廉的方法，通过测量血清中特定血糖蛋白的水平来评估血糖依顺性。
适体的测定
本文所描述的方法对检测不同类型的适体有用。在一个实施方案中，为了分离和鉴定对血红蛋白、白蛋白和IgM的糖基化/非糖基化的蛋白特异性的寡核苷酸(适体)，可使用通过指数扩增的配体系统进化(SELEX)富集流程。
虽然标准的SELEX流程允许对给定目的蛋白的特有配体的筛选，本文所描述了改进SELEX方法，其鉴定出能检测并捕获两种蛋白版本(比如糖基化和非糖基化形式)的第二适体，如本文进一步解释的那样。
本文所描述的一个实施方案中，第二适体的鉴定用来确定糖化百分比，其与给定时间框架内的平均葡萄糖水平相关联。
检测平台：蛋白感应和表面等离子共振(SPR)光谱法
对于蛋白质检测，自组装单层(SAM)用来将特异性受体附着到金SPR感应表面。SPR光谱法本身与导体和电解质之间界面上发生的现象有关。在此界面，可存在表面等离子体，其为电子结构中的电荷密度振荡。这些表面等离子体最常见地被在可见光到近红外光谱内的光所激发。这种激发可作为在连续金属表面的自由传导表面等离子体或通过使用基于纳米颗粒结构的金属作为局部效果而发生。在本文所描述的一个实施方案中，使用了自由传导表面等离子体。
简而言之，价电子从原子核解离，并实质上作为在外电场存在下的一种电子气；可表明，表面等离子体是具有相应波矢量等于如下的合成波：
k sp = 2 π λ ϵ metal ϵ sample ϵ meatal + ϵ sample , - - - ( 1 )
其中λ为光的波长，并且εmetal和εsample分别是介质的相对介电常数。因此，如果入射光具有的电场矢量带有能量接近ksp的横模极化分量，将发生向表面等离子体的能量传递(比如，其会被激发)。
如图7所示，入射光矢量具有分量kx，其可通过如下方程式表示：
k x = 2 π λ n i sin θ i , - - - ( 2 )
其中ni为入射介质的折射率并且θi为进入光接触金属表面的入射角。表面等离子共振对样品折射率的局部变化高度敏感，这归因于εmetal和εsample对入射光的波长λ的依赖性。折射率的变化可使用基于折射的方法来测量。如图7所示，在两种电解质的界面折射的光产生在表面具有最大强度的瞬逝场，其会与自由电子(如表面等离子体)共振。这导致转移到表面等离子体的光能具有在反射光的程度上相应的减少。发生所述减少的角通常称为共振角。
用来测量共振角的Kretschmann仪器配置在图8a中显示。在这个配置中，光经过棱镜，其在玻璃-金属之间界面被反射。在图7中显示了在金属-光之间界面处相互作用的放大版。在金属/样品之间界面的折射率的任何变化会导致共振角的相应变化或移位，如图8b所示。
本方法克服了单独使用SPR的缺点，其经常因缺乏特异性带来不利影响。另外，在单独使用SPR时，如果感应分析物不引起折射率的至少中度变化，SPR也会因缺乏灵敏感的问题带来不利影响。
本方法通过使用本文所描述的选择性的适体和通过使用与SPR一起的自组装单层(SAM)克服了这些不利的问题。本方法提供了如高灵敏度和选择性、成本效率、化学和温度稳定性、温和的合成和存贮这样的优点。
本文所描述的基于感应方法的适体作为生物感应器的应用中的感应元件特别有用。适体的核酸属性也使得固定化和再生更容易。在SPR应用的一个实施方案中，受体(即适体)在不同类型固体基质上固定化用来捕获靶标分析物或分子(参加图9)。
另外，本文所描述的方法和装置克服了与SAM相关的蛋白质非特异性吸附的过去的问题，其中这样的非特异性吸附不利于感应器活性。特别是，来自复合物样品母体(如血液、尿或其他临床样品)的非特异性吸附是限制灵敏度的主要因素。
其他限制因素为被吸附表面自身的生物物理或化学属性。在这种SAM中，这些属性需要被抑制以便保证与目的分析物的特异性的亲和力相互作用。而且，吸附在SAM表面的蛋白质部分地失去其生物活性，是因为在二级结构的构象变化和/或在所述表面上非理想状态的定向和分布。用于制备表面的流程和质量输送的条件也会显著影响蛋白吸附反应。因此，获得自不同实验室的数据的量化比较是困难的并经常不精确。
实施例
本发明进一步在下面的实施例中界定，其中所有部分和百分比是按重量计算并且度数为摄氏度，除非另作说明。应当理解这些实施例表明本发明优选的实施方案，仅通过示例说明的方式给出。从上述讨论和这些实施例中，本领域技术人员可探明本发明的本质特征，并在不背离其精神和范畴的情况下，可以进行本发明的各种不同改变和修饰来使其适应各种不同的使用和条件。在本说明书中所提及的全部出版物包括专利和非专利文献通过引用清楚地并入本说明书。下面实施例旨在示例说明本发明的特定的优选实施方案而并不应该被解读为限制所述权利要求所界定的本发明的范围，除非特别说明。
实施例1
材料
所鉴定的适体由Integrated DNA Technologies(Coralville,IA)合成，其包15bp适体(APT1)：5’-NH2-(CH2)6-GGTTGGTGTGGTTGG-3’[SEQ ID NO:1]，和34bp适体(APT2)：5’-NH2-(CH2)6-CTATCAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’[SEQ ID NO:2]。
甲苯磺酰基活化的(tosylactivated)磁珠(MB)从Invitrogen(Carlsbad,CA)购买。所有其他化学药品从Sigma Aldrich(Carlsbad,CA)购买可获得的最高纯度。适体溶液用1M pH8的磷酸缓冲液来制备。3-巯基丙酸(MPA)溶液在乙醇中制备。蛋白质样品溶液用具有5mM KCl和1mM MgCl2的0.1M pH7.2的PBS缓冲液制备。所用磷酸(PPA)为100mM。所有其他溶液在去离子(DI)水中制备。
仪器
用商业级别的SensiQ Discovery系统(ICx Technologies,Arlington,VA)在25℃进行SPR测量。此感应器是基于Kretschmann配置，其中来自与棱镜结合在一起的发光二极管(LED)的光首先极化并接着从金表面内部反射。光反射的角度和相对强度用光电二极管阵列来测量。当样品溶液施用到感应表面时，SPR分布图(profile)最小值(也称为SPR角)作为上载样品的折射率的函数移位，提供实时折射率读数(即使，感应器自身对于任一给定的靶标不是特异性/选择性)。SPR反应分布图通过SensiQ软件被记录并在进行处理。
电化学阻抗光谱(EIS)的测量在作为支持电解质的具有KCl的5mM Fe(CN)6 3-/Fe(CN)6 4-溶液中使用Gamry Reference 600稳压器(Warminster,PA)进行。全部实验用氮气净化15分钟的溶液在室温下进行并且在实验过程保持氮气层。所述实验在25℃进行。在0.1Hz-100kHz的频率范围潜在振幅为5mVrms以10倍频率内点数为10来收集阻抗谱。通过将实验阻抗数据拟合到电等效电路模型来分析EIS结果。通过将阻抗函数拟合到测量的博德-奈奎斯特图(Bode andNyquist plots)使用构建在Gamry EIS 300电化学阻抗光谱中的复合物非线性最小平方(CNLS)程序获得电-等效电路的参数。
适体结合能力可确定如下：摇床温育器内37℃下18小时，10nmol的胺修饰的适体结合到10mg的洗过的磁珠(MB)。未占据的结合位点被牛血清白蛋白(BSA)封闭。缀合适体的MB彻底洗涤，并接着摇床内在室温将10nmol凝血酶与缀合适体的MB混合2小时。除了适体不存在，对照组是通过完全相同方法制备的。用SensiQ提供的羧基功能化的SPR感应器检测全部和未结合的蛋白质。
选取凝血酶和抗凝血酶适体来证明使用基于适体的SPR感应器来检测血液蛋白。通过物理气相沉积(PVD)在预清洁的显微镜盖玻片形成1nm的钛层和50nm的金层来制备金薄片。这些通过大量的DI水和乙醇来洗涤。在用之前在氮气中将其干燥。
为了将金薄片功能化，将其浸没于10mM的MPA溶液达30分钟，并接着用乙醇和DI水进行洗涤。在薄片干燥后，接着将其浸没于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)(NHS 0.2M,EDC 0.05M)达30分钟。薄片接着用DI水进行洗涤，并接着浸没于5μM适体溶液。最后，薄片用PBS缓冲液漂洗来冲洗掉非特异性吸附的蛋白质。然后薄片做好了测量的准备。在特定实施方案中，这种两步法表面功能化流程不仅可应用于SPR，也可以应用于拉曼和荧光光谱法。表面功能化流程在图1中图示说明。
未作涂层的(例如，没有金)SensiQ基础感应器用开发的基于金的SPR感应表面来定制修饰。特别是，用折射率匹配的光学油将新鲜制备的适体-固定化的金基质缀合到已解吸附的感应器。然后接着将100μL的1M乙醇胺(EA)以20μL/min的流速上样来封闭未占用的经EDC/NHS活化的MPA位点，接着以50μL/min注射100μL的100mM磷酸(PPA)来去除非特异性结合。运行缓冲液为0.1M pH7.2的PBS。感应器首先用缓冲液归一化达10分钟，然后以5μL/min将浓度为5nM、25nM、50nM、250nM、500nM、1000nM、2000nM的凝血酶样品(25μL)上样。带BSA的样品全都用400nM BSA制备。在样品注射后的290s、300s和310s记录全部数据并进行平均。通过以50μL/min注射100μL PPA接着用运行缓冲液进行洗涤来进行感应器的再生。
实施例1的结果
EIS测量
每个功能化层的成功固定化通过EIS测量来确认。图2显示在不同电极上的阻抗谱的奈奎斯特图。裸金电极在高频下表现为一个非常小的圆圈，表明对溶解于电解质溶液中的氧化还原探针的非常低的电子转移电阻(曲线A)。当MPA固定化在电极上，用EA和PPA来处理，电子转移电阻(Ret)增加到125Ω(曲线B)。然后，当5μM的APT1适体加入并与SAM结合，Ret增加到600Ω(曲线C)。在这个实施方案中，金电极上的反应位点被EA(乙醇胺)封闭来阻止适体非特异性吸附到金表面上，因此确保所述适体只附着到SAM上。Ret的增加是由固定化的适体与氧化还原探针之间的静电排斥造成的，其导致对界面电子转移的屏障。这些结果显示SAM层成功固定化到金表面以及适体与SAM的稳定键合。
基于磁珠(MB)的最大结合能力
在结合了适体的MB被彻底洗涤后，加入凝血酶并且使用羧基修饰的SPR感应器测量浓度变化。仅通过所加入的凝血酶的浓度变化来控制折射率。其他实验变量比如蛋白降解和温度对SPR结果有很小影响并因此不被认为会影响结果。
图3所示，凝血酶的浓度变化对于对照组是无关紧要的(小于3％)，其不会被适体功能化。这显示了两个实验组的浓度变化主要因为适体和凝血酶之间的结合。对于APT1和APT2组，允许适体功能化的MB与凝血酶溶液的混合物反应18小时并且根据MB厂家说明书反应被认为已完成。因此，终浓度反映了适体与凝血酶的最大mol/mol结合能力。
结果显示APT1的结合比(57.1％)比APT2(55.2％)具有更好的能力。两种适体对凝血酶具有大于50％的mol/mol结合比，表示它们对于凝血酶感应应用是好的受体候选物。应理解，在特定实施方案中，不是所有的适体都可结合到MB上，并且因此对于靶标化合物的结合适体的实际结合能力可能会稍微更高。
对照组是由不具有适体功能化的MB构成，并且全部结合位点被BSA封闭。含适体的组为：被分别的适体功能化的APT1-和APT2-MB，其未占用的位点被BSA封闭。误差线代表从三个样品中确定的数值的标准偏差。
SPR结果
两种不同适体被固定化到金表面并且比较每一种的结合性能。作为参考，不同凝血酶浓度(5nM、25nM、50nM、250nM、1000nM、2000nM)的样品单独地上样到裸Au感应器，分别地APT1感应器和APT2感应器。第二个实验接着用相同凝血酶浓度进行；然而具有400nM的BSA混杂组分加入到每个凝血酶样品做比较。在图4中所示的对于“只有凝血酶”的实验，对于裸Au感应器表面的SPR移位非常低，甚至对相对高的凝血酶浓度。
与之相反，对于适体修饰的感应器，其SPR移位显著增强并且最佳检测范围为5nM-1000nM(线性范围)。“凝血酶+400nM BSA”数据(图4中所示)显示大的400nM BSA混杂浓度组分被加入到每个凝血酶样品浓度。与只有凝血酶的组相比，反应几乎相同，说明适体修饰的APT1和APT2感应器仅对凝血酶是特异的。
这在图5中进一步阐示，其显示了对于具有或不具有400nM的BSA的500nM凝血酶浓度的SPR移位。向样品中加入BSA对适体修饰的感应器的SPR反应有最小限度的影响，说明感应器对凝血酶的好的选择性。这与裸Au感应器形成对照，其在具有和不具有BSA的凝血酶样品之间发生显著的变化。对于所有的凝血酶浓度，APT1改良的感应器缺失比APT2感应器具有稍微更高的移位。在线性反应范围内，APT1的拟合线的斜率也比APT2略微更大(图6)，也证明了更好的灵敏度。这两个适体结合到凝血酶的不同位点，因此在界面结合环境中和在溶液中对靶标的亲和力都是不同的。
抗体感应
在MB结合测试中，APT1具有已APT2稍微更高的结合能力，这在功能化的感应器的灵敏度方面与SPR结果相对应。虽然不希望被理论所束缚，人们认为在本实施方案中，这可能是因为更小的适体具有更有可能接近靶标蛋白的结合位点。在特定实施方案中，而且更大的适体其具有更复杂的二级结构可能需要额外的空间灵活性来形成与靶标蛋白的键合。
如本文实施例1所示，MPA层在金上具有良好的覆盖度而且对为了生物感应目的抗体免疫是有用的。这些结果也显示胺修饰的适体容易固定化到MPA层上，并且感应器的性能够与基于抗体的感应器是可比的。
为每个适体以及对照组制备三个感应薄片。当使用新鲜制备样品时，感应器性能是一贯性的，对于每个测量产生相对小的误差并且平均低于总信号2％的标准偏差(图5中所示误差线)。
加入BSA的确引入稍微更大的误差，并且通过降低流速和增加样品上样时间，误差可以降低尽管不认为其足够显著而需考虑。大部分误差被认为是由温度变化引起的；因此，在一些实施方案中，将感应器置于温度可控的环境可有助于增加精确度。
本文所描述的感应表面具有在约5nM-约1000nM范围的最佳动力学，其与对于凝血酶基于适体的感应技术的最大的已报道的动力学范围相当或更大。因为已报道在人血中凝血酶浓度范围是在低的毫微摩尔到低的微摩尔范围，本文所描述的方法非常适合用于体内凝血酶定量检测。
感应器的可逆性
为了测试感应器的可逆性，固定的样品浓度反复10次上样到感应器。感应器的再生通过PPA完成。在图6中显示使用50nM、250nM和500nM的凝血酶浓度的平均SPR反应，其带有表示标准偏差的误差线。全部数据获得自新鲜制备感应薄片。对于相同样品浓度的每一次上样SPR反应一般降低约0.5％。所有的感应薄片在第10次上样后保持大于95％的原SPR移位反应。而且，第二次样品上样与随后的上样相比通常具有最高的反应变化。用更长的PPA注射时间，感应器恢复率可增加，其取决于实验要求。BSA的出现的确降低感应器的灵敏度(如在图6中，BSA的出现的确稍微减低了反应曲线的斜率)，但其不会影响感应器的可逆性。图6也证明了在50nM-500nM样品范围内存在和不存在BSA情况下感应器保持了线性反应。
实施例2
感应器的其他实施方案
在另一个实施方案中，感应器可包括混合长度的间隔层。在一个非限制性的实施例中，混合长度的间隔层可以为11-巯基十一烷酸(MUA)与MPA的结合，其可用于特定实施方案来增加灵敏度和特异性。
在其他实施方案中，可包括混合长度的间隔层来帮助形成并维持固定化的适体的特定形态。
在另一个实施方案中，亲水基团例如环氧乙烷可插入适体的5c端以降低非特异性蛋白质结合。
在本文所描述的两步法固定化方法的特定实施方案中，也可通过调节MPA SAM密度，或通过乙醇胺和适体以不同摩尔比共孵育来分隔适体。
血液蛋白的检测
对于不同血液蛋白的检测，为了发现特异性和直接结合目的靶标蛋白的适体，可使用SELEX程序。开发的适体随后进行氨基末端化并使用本发明所述方法中的一种固定化到金表面来形成对几乎任一蛋白的靶标特异性感应器。因此，适体可通过SELEX产生来以超过抗体的优势而靶向特定的化合物。
本文所描述的两步法固定化方法对于将SAM和氨基末端的适体固定化在金SPR感应表面上特别有用。本文所描述的SPR感应器提供例如低的样品消耗、不需标记、高灵敏度和快的反应时间的优势。两步法固定化方法的另外的优势包括可证实的成本效率、好的可逆性、均一的密度以及用作一种稳健和特异的血液蛋白检测平台。
实施例3
基于SPR适体的糖基化的白蛋白的蛋白质感应
糖基化的人血清白蛋白(HSA)被检测和量化。已开发和使用的适体(巯基化，非还原的)为：5’-SH-(CH2)6-CCGAAACCAGACCACCCCACCAAGGCCACTCGGTCGAACCGCCAACACTCACCCCA-3’[SEQ ID NO:3]。
通过物理气相沉积(PVD)在预清洁的显微镜盖玻片形成1nm的钛层和50nm的金层来制备金薄片。接着通过大量的DI水和乙醇来清洗金薄片。在用之前在氮气中将金薄片干燥。
巯基化的适体用1M磷酸缓冲液pH8来稀释并与Cleland'sREDUCTACRYLTM试剂在摇床里混合2小时以还原在适体序列中的二硫键。半胱氨酸为水溶含巯基氨基酸，可直接结合到金表面来形成自组装单层(SAM)，其被加入到适体溶液来帮助分隔开适体，填补适体间的间隙，并降低非特异性的表面吸附。在这个预实验中的适体终浓度设为1μM并且适体:半胱胺酸摩尔比为1:10。在37℃下金薄片浸没到适体/半胱胺酸混合溶液中。
固定化过程之后，金薄片用0.01M的PBS缓冲液pH7.4进行洗涤。功能化的表面接着缀合到对应的SPR感应器，并且制备1μg/mL总蛋白的HSA样品(即，总量＝糖基化+非糖基化)为给定的糖基化百分比(％)(糖基化/总蛋白)为：2、6、10、14和18％。
记录每个个别样品的SPR反应。在图10中概括了对功能化的表面和裸Au表面的结果。适体功能化的SPR表面对糖基化的蛋白的含量变化做出直接响应。应注意样品间的总蛋白浓度恒定在1μg/mL。
非功能化的表面(如，裸金)展现出微不足道的反应，进一步说明了功能化的表面中增强的灵敏度。尽管长度小(40-60nt)，在特定的实施方案中，适体序列可根据大小和电荷来区别靶标，并且亲和力可受影响。虽然不希望被理论所束缚，发明人在此认为适体的3D结构可能也在发挥作用；一个非限制性的实施例包括半胱胺酸富集的凸环结构和ACC(C)或(C)CCA基序。
对于HbA1c、白蛋白和IgM的非糖基化和糖基化的蛋白结合位点 的适体
适体被开发来附着到自组装单层(SAM)。对于特定实施方案，蛋白血红蛋白、白蛋白和IgM是有用的，因为每一种的半衰期提供在血糖控制中的跨越短期、中期和长期的历史记录信息。在下面表1中提供了一些常见血液蛋白的属性的概述。
各个蛋白的糖基化可通过各个蛋白在含1M葡萄糖和DTPA的pH7.4的PBS中孵育(37℃)两天来完成。糖基化的蛋白可随后进行透析过程，并接着通过亲和层析进一步富集。在这一步，糖基化的蛋白可使用支持柱中固定化在硼酸聚丙烯酰胺珠子上从各个非糖基化形式中分离。通过这个过程，未结合和结合的部分都能被收集并使用过滤方法进一步浓缩。
为实现对糖基化和非糖基化的蛋白形式的血红蛋白、白蛋白和IgM特异的关键寡核苷酸(适体)的分离和鉴定，可使用改进的通过指数扩增的配体系统进化(SELEX)富集方法，其在下面进一步解释并在图12中图示说明。
改进的SELEX方法允许对目的蛋白所特有的配体的筛选。改进的SELEX方法可通过产生一个大的随机RNA序列的文库来进行。所述的文库通常包括1014-1015个不同的RNA种类，其基于特定的序列折叠成不同的结构。接着将这个文库与目的靶标蛋白一起孵育，并且这些包含在文库里的结合蛋白质的RNA从那些不结合的RNA中分离出来。保留的RNA接着通过RT-PCR扩增并体外转录来产生富集了能结合目的靶标的RNA的库。这种筛选和扩展步骤可重复8-12回合直到分离出具有对靶标蛋白最高亲和力的RNA配体。接着对这些适体进行克隆和测序。
糖基化的蛋白相对于总蛋白的比例的确定
糖基化的蛋白相对于总蛋白的百分比的测量与特定时间窗口的平均血液葡萄糖相关。
可产生对靶标蛋白的糖基化位点特异的适体。也产生结合各个蛋白的糖基化和非糖基化版本的适体。在一个实施方案中，血红蛋白、白蛋白和IgM的糖基化版本可用作SELEX流程中的靶标。产生的减缩的适体库包含非糖基化位点和糖基化位点特异性的适体。在这一步以及后面的回合中，非糖基化的蛋白(如正常的蛋白质)可引入其中，识别糖基化位点的当前适体不会结合并能被恢复来做特征描绘。该方法提供了分离的适体，所述适体可结合蛋白质的糖基化/非糖基化版本，以及那些仅对糖基化版本特异的适体。
表面等离子共振自组装单层基于适体的功能化的表面的优化
所鉴定的适体可对包括结合特性、灵敏度、特异性和选择性的一般性能进行初步特征描绘。下面表2中呈现了基于性能水平的靶标规格的例子。
特别是，表征结合的亲和力的一种方法为使用SPR方法。基于已鉴定的适体候选物，SPR对于产生各个结合反应曲线是有用的。例如，特定的装备(如SensiQ、iCx Nomatics)装配上双微流通道并具有可控的流速。使用类似于图1所述的固定化方法来进行测试。
促进固定化的修饰
而且，在特定的实施方案中，糖基化和非糖基化的特异性的适体可用5’-NH2-C6附着进行修饰来促进固定化到-COOH修饰的金SPR表面上。然后使用SPR测量来对适体候选物的各自亲和常数进行表征。
除了亲和测试，使用SPR芯片固定化适体，可评估特异性和灵敏度。在这些实施方案中，各个适体芯片曝露于每个糖基化和非糖基化形式的蛋白。确定对于给定蛋白的两种形式以及不同蛋白(例如白蛋白对于HbA1c适体芯片)之间的交叉反应。在特定的优选的实施方案中，希望靶标的交叉反应是低至约6％。如果确定这个标准没有达到，SELEX流程可使用改进的筛选条件来重复(例如，增加清除回合的频率)来进一步提高交叉反应的性能。
也应理解，好的靶标识别也可被用于固定化的适体连接步骤所影响。在特定实施方案中，所述方法可包括使用一种或多种可选的适体连接方法。在特定实施方案中，连接可通过3’-氨基、巯基或其他可能的连接。
这些连接可通过例如控制特定的参数如密度和长度来修饰，这也在预期范围内。这样，可优化适体和连接方法来提高最大化的所需性能。另外，来产生功能化的表面的本文所描述的方法可被优化来提供在表面上所需水平的均一性，以及来优化适体感应器反应。
自组装单层(SAM)连接
除了上述连接方法，可用的其他方法包括通过二元自组装单层(SAM)和还原解吸附过程的连接。因为SAM的堆积密度和SAM的长度影响SPR信号，二元SAM的密度和长度可用还原解吸附过程来控制。
在特定实施方案中，合成的二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)和(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)一起使用来调整混合的SAM。PEG3是抗蛋白质吸附的，可用来防止蛋白质的非特异性吸附。另外，DTSP中的羧基部分与适体形成稳定键合。
在特定的实施方案中，使用二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)的巯基SAM固定化方法在磷酸缓冲溶液中使用。DTSP对SAM有用至少一部分是因为其与众不同的表面特性，如亲水性、润湿性、化学反应性和对例如血红蛋白和细胞色素c的亲和力。
对于二元SAM的固定化，可使用3-巯基丙酸(MPA)和(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)。在特定的实施方案中，选择MPA是因为其比PEG3具有较低的氧化还原电位，这意味着MPA可容易地被还原解吸附清除掉而完整保留PEG3。DTSP可与适体的氨基形成共价键而PEG3不会，所以适体只附着在DTSP。
通过将以不同比例混合MPA与PEG3的1mM乙醇溶液，同时保持二元SAM的总浓度为1mM来制备双组分的巯基溶液。MPA和PEG3的比例为20:80、50:50或80:20的二元SAM可通过将电极浸入混合的巯基溶液达1h而在金电极上形成。
现在参考图11a-11e中的图示说明，显示了二元SAM形成和还原解吸附过程。首先，在乙醇溶液中，3-巯基丙酸(MPA)和PEG3的二元组分吸附到金表面(图11a)。在0.5M KOH溶液中从金电极上还原解吸附MPA。通过施加30分钟-1.2V的电势，选择性地还原在MPA和PEG3的相分离的二元SAM中所吸附的MPA(图11b)。
MPA还原解吸附之后，将具有PEG3层的样品浸入在1mM DTSP溶液以形成DTSP层(图11c)。图11d显示适体固定化，并且图11e显示将适体从PEG3中去除。
适体共价缀合到曝露出-COOH末端基团的DTSP的SAM上。为了共价键的形成，PBS中的适体(50μg/ml)与新鲜制备的NHS和EDC一起注射。在N末端具有氨基的适体可通过CO-NH酰胺键形成被固定化到DTSP的SAM上。DTSP和PEG3的比例可变化来控制SAM的组装，并且因此可获得提供最佳SPR信号的蛋白质结合。
表面覆盖度的测量
循环伏安法(CV)和电化学阻抗光谱(EIS)可用来测量固定化的SAM的表面覆盖和样品的氧化还原反应。表面组合物可从吸附的巯基的循环伏安图的峰面积来估算。沉积在修饰的电极上的二元SAM的反应可与未修饰电极的反应相比较。
在0.5mol dm-3磷酸缓冲溶液中使用Ag-AgCl-饱和的KCl电极作为参考电极并且铂丝作为反电极来记录还原解吸附的循环伏安图。SAM+适体覆盖的金电极(Au+SAM+适体)与在金电极上的还原清除的SAM和适体(Au+RD SAM+适体)的CV曲线可以相互比较。对于还原清除以100mV/s的扫描速率来记录CV曲线。在每个伏安图中，SAM的还原解吸附的向下的峰预期出现在50mV附近。
可控制SAM的长度和密度来获得最佳的SPR反应。当连接子的长度长时，更多的适体可被固定化，但SPR的下降可能变得更宽，因为适体离表面更远了。同样地，当连接子的密度高时，更多的适体可附着到SAM，但SPR的下降可能变更窄并且更难以检测。通过使用5’-NH2-C6/-COOH法的方法来对这些适体修饰表面进行特征描述。
已开发的功能化的SPR感应表面的校准验证
用于HbA1c、白蛋白和IgM的糖基化/非糖基化的蛋白检测的SPR感应平台，可首先在测试中用带有已知靶标蛋白比例的生理盐水缓冲液来校准。对于固定水平的总蛋白，以与在血中所见的水平相比合理的比例水平制备各自的样品溶液(见表1)。
对于每一个样品，糖基化的蛋白相对于蛋白质总量的比例可在所需的范围变化(例如，对于HbA1c％水平在6-15％分别对应于60-360mg/dL的平均血糖水平)。在这些实施方案中，1-25％v/v的范围是适当的。在各自的样品中，SPR反应可被评估而且校准模式可关于％糖基化来进行校准，并可计算校准的标准误差。为进一步评估已开发的SPR测定的准确性，独立样品(即没有用来校准的样品)可用来基于各自的校准模式来评估测定表现。可确定相对误差和绝对误差，并与有用诊断目的所需的范围进行比较。
血液血清的测试
为了测定在实际血液血清中的表现，可使用非糖尿病来源的血液血清。可分析血清样品以通过标准临床测试来确定(对于两种蛋白靶标)糖基化相对于总蛋白的各自分数。
使用这些数值作为参照，各个样品掺入特定量的各自的糖基化的蛋白。可重复与用于生理盐水测试相似的测试评估。应理解因为血清中由于血清中靶标蛋白的高浓度(例如表1中所示血红蛋白)，可能需要在进行测试之前稀释样品。另外，在糖基化的蛋白之外，其他潜在的混杂效应例如在样品组合物中引入变化能够被检测到，作为因为血清的复杂的化学组分而引起的问题。
实施例4
用于靶向糖基化和/或非糖基化的蛋白位点的适体鉴定的改进的 SELEX方法
为了允许对糖基化的蛋白位点具有亲和力的适体的鉴定，改进了SELEX流程。该改进的SELEX流程允许糖基化的蛋白对于总蛋白的百分比的鉴定。
除了可以结合到各自蛋白的糖基化和非糖基化版本两者的适体，产生了对靶标蛋白的糖基化位点特异的适体。为了产生用于各自蛋白(如血红蛋白、白蛋白、IgM等等)的这样的适体，在第一回合扩增中，SELEX流程用于各自蛋白的糖基化版本。SELEX流程的第一回合回合导致缩减的适体库，其包括“非糖基化位点特异性的”适体和“糖基化位点特异性的”适体。
非糖基化的蛋白(例如正常蛋白)引入到第一回合SELEX扩增流程中所获得的库中。至少在扩增的第二回合，库中结合到这样非糖基化的蛋白的适体在SELEX的这一特定回合中没有被洗脱，并因此从库中去除了。这种改进的SELEX流程提高了对糖基化位点特异性的适体会保留在进行中的库里的机会。这些保留的适体可随后被回收用于在后续的SELEX回合中进行表征作为标准SELEX流程一部分。应理解，在其他实施方案中，“糖基化”的蛋白和“非糖基化”的蛋白的使用可以调换，例如其中“糖基化”的蛋白进入到第一回合SELEX扩增流程所获得的库中。
高亲和力的糖基化和/或非糖基化的蛋白的适体的确定
蛋白质分子(例如白蛋白)具有可糖基化的多个位点。糖基化水平通常是指已糖基化的给定蛋白浓度对于总蛋白水平的百分比，而糖基化比率是指在一个单独蛋白质分子中多少个位点已经结合了葡萄糖或葡萄糖衍生物。高度糖基化和非糖基化的蛋白质分子之间的3D构象和电荷分布显著不同，但是轻微糖基化(即单个糖化点)和非糖基化的蛋白质分子之间是非常相似的。因此，开发高亲和力单个位点特异的糖基化的蛋白的结合适体是非常具有挑战性的，其对非糖基化形式具有低的亲和力。
图12中显示了改进的SELEX体外选择流程的一个实例，其中大的随机DNA库最初与固定化到磁珠(MB)上的糖基化的蛋白靶标相混合；也就是第一或“糖基化的蛋白靶标-磁珠”复合物)。
对糖基化的蛋白靶标具有高亲和力的适体会结合并形成“适体-糖基化的蛋白靶标-MB复合物”。
“适体-糖基化的蛋白靶标-MB”复合物从最初的DNA库中分离出来。
在后续的步骤中，从“糖基化的蛋白靶标-MB”复合物(即，蛋白的单个或轻微糖基化形式)洗脱结合的适体。
这时，将对照蛋白(即，蛋白的非糖基化形式)添加到这第一洗脱物中，所述对照蛋白缀合到第二组MB(第二或“非糖基化的蛋白靶标-MB”复合物)。
“非糖基化的蛋白靶标-MB”复合物用来去除第一洗脱物中的“选择性”适体，其对非糖基化的蛋白形式也具有亲和力。
在后续的步骤中，“选择性”适体从“非糖基化的蛋白靶标-MB”复合物中洗脱。
经过通过“非糖基化的蛋白靶标-MB”复合物的去除，剩下的“选择性”适体是对单一或靶向的糖基化位点具有高亲和力的那些适体。
这时，标准的SELEX方法可用于扩增这些剩下的“选择性”适体，其对所需糖基化的蛋白位点具有很高亲和力。
特别是，这种改进的SELEX方法允许高亲和力单一糖基化位点适体的开发，所述适体对所述蛋白的非糖基化形式具有低的亲和力。这种改进的SELEX方法也对产生能区分具有非常相似化学结构的分析物/分子的适体有用。
糖基化和非糖基化适体的实例
下面显示了有用的适体的实例，其中XXX和YYY是指任何一个或多个额外的结合基团，例如生物素、巯基、氨基等等，其可用来促进给定的自组装单层(SAM)的形成。
糖基化的血红蛋白适体
5’-XXX-ATCCTTCATCCCATGGTTGCATATTGATTGCCGGTTCCTTAAAT-YYY-3’[SEQ ID NO:4]；和
5’-XXX-AGGGAAAGGTGTGGGTTAGGAGCTTGAAATCGAAAAGAGGGGCG-YYY-3’[SEQ ID NO:5]。
非糖基化的血红蛋白适体
5’-XXX-TTAGCGAGCTGCACACACAATGGACTCGTCATACCGTGCTGTTT-YYY-3’[SEQ ID NO:6]；和
5’-XXX-ATCTGCAGAATTCGCCCTTGCTGGTGCAGTACACACCCGGCGGG-YYY-3’[SEQ ID NO:7]。
糖基化：人血清白蛋白(HSA)适体：
5’-XXX-CTCACTCCATACTCACTTGCTGATTCGCCAACAACACACCCTTAAA CAGTC-YYY-3’[SEQ ID NO:8]；和
5’-XXX-CCGAAACCAGACCACCCCACCAAGGCCACTCGGTCGAACCGCCAACACT CAC-YYY-3’[SEQ ID NO:9]。
非糖基化：人血清白蛋白(HSA)适体
5’-XXX-CTCTCCGGCCGCTGACCCAGTTTGGAGGGGGGAGGAGGCCGGGC-YYY-3’[SEQ ID NO:10]；
5’-XXX-ACGGGCACTGGTTCCATCCGCATGAGATTGATGTGTCAACTTAT-YYY-3’[SEQ ID NO:11]；
5’-XXX-CAATACCGATTGTTCTAAGGGAAAACGTGTAACTTTGGATCCTT-YYY-3’[SEQ ID NO:12]；
5’-XXX-TAGCGACACACGTGGCCGCTGGTTGCCGGGCGCCACGGATCCTT-YYY-3’[SEQ ID NO:13]；
5’-XXX-CCAGCTCGTAGTGGCGTCTTTTTTTCATTTGGTACTTATCGCAA-YYY-3’[SEQ ID NO:14]；和
5’-XXX-AAATTTCATGTTCCCACACGTTCCATGCGCCCTCCTTCGAGTGC-YYY-3’[SEQ ID NO:15]。
实施例5
使用SAM用来基于靶标特征优化灵敏度和选择性的表面功能化 方法
可进一步提高用于适体调动的二元SAM形成的灵敏度和选择性。例如，为控制连接间距以及适体与SPR表面之间的距离，两种不同类型的自组装巯基分子沉积在表面上。分别制备11-巯基十一烷酸(SH-(CH2)5-COOH，MUA)和丙巯醇(SH-(CH2)2-OH,MPL)的1mM的乙醇溶液。每个溶液以1:1体积比混合保持两种组分的终浓度为1mM。通过将金表面浸没在混合的巯基溶液中达1小时在金表面上形成MUA和MPL的二元SAM。然后，将金表面随后用乙醇和DI水漂洗。
通过向在0.5M KOH溶液(pH13)中的金表面施加电势，为最佳的信号传输来控制MPL密度。施加-0.5～-1.0V的电势30分钟用于分离MPL部分，导致较低密度的MPL层，其提高了信号传输。然后，所述表面立刻用DI水进行洗涤。
表面干燥之后，用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)的溶液(NHS 0.2M，EDC 0.05M)处理所述表面达30分钟来激活MUA的羧基。所述表面接着用DI水进行洗涤并浸没在5μM的适体溶液中。适体共价附着在激活的MUA上。最终，所述表面用PBS缓冲液漂洗。
这种表面功能化方法不仅可应用于SPR，而且可用于优化其他感应形式如拉曼和荧光光谱法的灵敏度和选择性。所述方法可用于改进已存在的监测技术的性能。
实施例6
用于降低存在于样品中混杂物的影响的方法
作为功能化流程的一部分，MPL层本质上是亲水的。这一属性可防止蛋白质非特异性的吸附到所述表面。在另一个实施方案中，适体识别元件可以通过延伸的连接方式延伸超过正常的SPR感应范围(而仍然保持所需的灵敏度)。在此实施方案中，通过例如巯基的终端可获得多重连接。在终端之间，可通过将所述表面曝露于金纳米颗粒溶液来制备金纳米颗粒界面。这种纳米颗粒缀合可允许适体结合反应在超过正常SPR检测限度的分离距离上被SPR感应器检测。
应注意，在非适体的位置上，可制成长度在SPR范围之外的紧密堆积的连接，其避免金属颗粒缀合。因此，如果非特异性蛋白吸附或其他混杂组分发生在这些位置，相应的SPR反应不会发生，因此提高了感应器的选择性的表现。
在另一个实施方案中，第二物理气相沉积(PVD)可在后续的MPA层上形成，接着通过热处理来获得类似的结构以使适体从SPR基底面延伸出去，同时通过金属缀合连接保持灵敏度。
实施例7
生物标记物的检测
本文所描述的方法和平台在对于疾病诊断和评估的生物标记物检测领域也是有用的。
例如，对于本文所描述的蛋白质(例如糖基化的蛋白)，精确的检测可促进糖尿病的治疗并帮助使多个相关健康保健的病况最小化，所述病况例如增加的心血管疾病、失明、肾衰竭和许多其他的风险。
本文所描述的方法和平台可小型化以至于容易地整合到手提装置中，因此允许所述方法和/或平台直接用在医师办公室、家中或野外。
糖基化的蛋白的测量(其为血糖依顺性的测量)，因此对于患者或健康保健提供者以更容易评估的方式轻易获得，而不是仅在医师检查过程中通过不合时宜的现场外分析获得。这种更广泛可获得的测量会因而为那些自我监控的血液葡萄糖测量提供辅助信息来进一步帮助糖尿病患者更好的管理他们的病况并减缓潜在的长期并发症。
进而，如果在扩展的历史时间窗口以更频繁方式可获得这样的信息，这会显著影响对糖尿病群体之中和之外的葡萄糖调节的理解，其会导致通过开发、教育和训练新的和/或优化的糖尿病治疗方式对血糖控制的更好的理解。
实施例8
试剂盒
本文所描述的感应器可以以部件的试剂盒形式提供。这样的试剂盒包括但不限于诊断试剂盒、生物标记物发现试剂盒、环境测试试剂盒、生物危害和生物武器检测试剂盒，以及用于检测医学应用或分析化学应用中靶标的试剂盒。经由非限制性实施例，可以包括氨基末端的适体作为单独的或已经附着至基质的分子。也可包括额外的组分并包括微流体芯片、参考标准和基于阅读本公开的本领域技术人员所能识别的额外组分。而且，可提供试剂盒的组分与合适的说明书和其他必要试剂，以此进行本文所公开的方法。在一些实施方案中，试剂盒可在分开的容器中包括所述组分。用来执行实验的说明书(例如在纸或电子载体如在纸或CD-ROM上的书面的或语音的说明)也可包括在试剂盒中。试剂盒也可包括其他包装的试剂和材料(如洗脱缓冲液等等)，其取决于所用的特定方法。
尽管参考不同的优选的实施方案描述本发明，本领域技术人员应当理解在不背离本发明的基本范围的情况下可发生不同的变化并且其元素可替换为等同物。另外，可进行许多修饰来来使特定条件或材料适应本发明的教导而不背离其基本范围。
因此，旨在本发明不局限于计划用来实施本发明的本文公开的特定实施方案，而是包括属于所述权利要求范畴的全部实施方案。
本文列举的任一文献的引用不作为承认任何上述内容为相关的现有技术。对于具体日期的所有声明或对于这些文件的内容的表示是基于申请者可获得的信息，并不构成对所述日期或这些文件的内容的正确性的承认。

Claims (133)

1.用于优化针对一种或多种分析物的感应器的灵敏度和/或选择性的方法，包括
将一种或多种类型的适体连接到具有自组装单层(SAM)连接的基质上，所述SAM连接具有所需的连接间距和/或长度以在基质上形成功能化的表面，
为了基于分析物和/或适体特性来优化表面等离子共振(SPR)、拉曼光谱法、或荧光光谱法中至少一种的灵敏度和选择性来选择所需的连接间距和/或长度。
2.权利要求1的方法，其中所述SAM连接的至少一种堆积密度和/或长度影响表面等离子共振(SPR)信号。
3.权利要求1的方法，其中连接是通过二元SAM和还原解吸附过程。
4.权利要求3的方法，其中所述解吸附过程包括：将基质的功能化的表面暴露于抗蛋白质吸附的物质来抑制蛋白质在功能化的基质上的非特异性吸附。
5.权利要求4的方法，其中抗蛋白质吸附的物质包括1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)。
6.权利要求1的方法，其中所述SAM连接包括巯基化合物，所述巯基化合物具有能够与适体形成稳定键的羧基部分。
7.权利要求6的方法，其中巯基化合物包括二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)。
8.权利要求1的方法，其中使用二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)和(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)形成所述SAM连接，
其中PEG3防止蛋白质的非特异性吸附，而且
其中在DTSP上的羧基部分与适体形成稳定键合。
9.权利要求1的方法，其中二元的SAM巯基溶液用于所述SAM连接中。
10.权利要求9的方法，其中通过将3-巯基丙酸(MPA)与(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)的1mM乙醇溶液相混合，同时保持二元SAM的总浓度为约1mM来制备所述二元的SAM巯基溶液。
11.权利要求10的方法，其中MPA和PEG3以约20:80、约50:50或约80:20的比例存在。
12.权利要求10的方法，其进一步包括
通过还原解吸附来清除MPA，完整保留PEG3；和
允许二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)与适体上的氨基基团键合，而PEG3不形成任何键。
13.权利要求中任一项的方法，其中所述适体包括能被固定化到3-巯基丙酸(MPA)上的胺修饰的适体。
14.权利要求中任一项的方法，其中所述表面具有在约5nM-约1000nM范围的最佳动力学。
15.权利要求中任一项的方法，其中所述感应器包括混合长度的间隔层。
16.权利要求15的方法，其中所述混合长度层包括11-巯基十一烷酸(MUA)与3-巯基丙酸(MPA)相组合。
17.权利要求中任一项的方法，其中使用水溶的包含巯基的氨基酸形成SAM连接，所述氨基酸能直接结合到基质的表面。
18.权利要求17的方法，其中所述氨基酸包括半胱氨酸。
19.用于形成针对一种或多种分析物的感应器的方法，包括：
a)在基质上吸附由3-巯基丙酸(MPA)和(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)构成的二元组件；
b)从步骤a)的基质上还原解吸附MPA；
c)在步骤b)的基质上形成二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)层；
d)在步骤c)的基质上固定化至少一种类型的适体；并且，
e)将未结合的适体从步骤d)的基质上的PEG3中去除，由此留下附着在基质的DTSP层上的适体。
20.用于形成针对一种或多种分析物的感应器方法，包括：
a)在乙醇溶液中在金表面基质上吸附由3-巯基丙酸(MPA)和(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)构成的二元组件；
b)在0.5M KOH溶液中从步骤a)的基质上还原解吸附MPA，其中通过对溶液施加30分钟-1.2V的电势而选择性地还原在MPA和PEG3的相分离的二元自组装单层(SAM)中所吸附的MPA；
c)将其上具有PEG3层的步骤b)的基质浸入1mM DTSP溶液中，以在其上形成DTSP层；
d)在步骤c)的基质上固定化至少一种类型的适体；并且
e)将适体从步骤d)的基质上的PEG3中去除，由此留下附着在基质的DTSP层上的适体。
21.前述权利要求中任一项的方法，其中所述基质具有金表面。
22.前述权利要求中任一项的方法，其中所述分析物包括血液中蛋白质的糖基化形式。
23.权利要求22的方法，其包括确定总血清蛋白水平中的一部分特定糖基化蛋白。
24.权利要求中任一项的方法，其中所述分析物包括如下的一种或多种：人血红蛋白、白蛋白包括人血清白蛋白(HSA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、纤维蛋白原和/或其片段，所述分析物是非糖基化或糖基化形式。
25.权利要求中任一项的方法，其中所述分析物包括至少第一种分析物，其具有与至少第二种分析物不同的半衰期，并且所述方法进一步包括量化第一种和第二种分析物来提供关于在一个或多个时间段中第一种和第二种分析物的水平的回顾性判断。
26.权利要求25的方法，其中第一种分析物包括血红蛋白并且第二种分析物包括免疫球蛋白M(IgM)；并且，其中第一种分析物或第二种分析物以糖基化形式或非糖基化形式存在。
27.权利要求中任一项的方法，其中所述分析物包括至少第一种分析物，至少第二种分析物和至少第三种分析物，第一种、第二种和第三种分析物的每一种具有不同的半衰期，所述方法进一步包括：量化第一种、第二种和第三种分析物以提供关于在一个或多个时间段中第一种、第二种和第三种分析物的水平的回顾性判断。
28.权利要求27的方法，其中第一种分析物包括血红蛋白，第二种分析物包括IgM并且第三种分析物包括白蛋白；其中第一种分析物、第二种分析物或第三种分析物中的一种或多种以糖基化形式或非糖基化形式存在。
29.权利要求中任一项的方法，用于监测过去的平均血液分析物水平，所述方法包括：将通过前述权利要求中任一项的方法形成的感应器与血液样品相接触；确定血液中糖基化形式的分析物的量；和将血液样品分析物中以糖基化形式存在的分析物的量与给定时间范围的对照水平相关联。
30.权利要求29的方法，其中所述糖基化形式的蛋白的量是用表面等离子共振(SPR)来确定。
31.感应器，其包括：连接到具有自组装单层(SAM)连接的基质上的一种或多种类型的适体，所述SAM连接具有所需的连接间距和/或长度以形成在基质上的功能化的表面，
为了基于分析物和/或适体特性来优化表面等离子共振(SPR)、拉曼光谱法、或荧光光谱法中至少一种的灵敏度和选择性来选择所需的连接间距和/或长度。
32.权利要求中任一项的感应器，其中所述SAM连接的至少一种堆积密度和/或长度影响表面等离子共振(SPR)信号。
33.权利要求中任一项的感应器，其中所述连接是通过二元SAM和还原解吸附过程。
34.前述权利要求的感应器，其中所述基质的功能化的表面已暴露于抗蛋白吸附的物质，其足以抑制蛋白质在功能化的表面上的非特异性吸附。
35.前述权利要求的感应器，其中抗蛋白质吸附的物质包括1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)。
36.权利要求中任一项的感应器，其中所述SAM连接包括具有能够与适体形成稳定键的羧基部分的巯基化合物。
37.前述权利要求的感应器，其中所述巯基化合物包括二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)。
38.权利要求中任一项的感应器，其中使用二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)和(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)形成所述SAM连接，
其中PEG3防止蛋白质的非特异性吸附，而且
其中在DTSP上的羧基部分与适体形成稳定键合。
39.权利要求中任一项的感应器，其中二元的SAM巯基溶液用于所述SAM连接中。
40.前述权利要求的感应器，其中通过将3-巯基丙酸(MPA)与(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)的1mM乙醇溶液相混合，同时保持二元SAM的总浓度为约1mM来制备所述二元的SAM巯基溶液。
41.前述权利要求的感应器，其中MPA和PEG3以约20:80、约50:50或约80:20的比例存在。
42.权利要求中任一项的感应器，其中通过还原解吸附清除MPA，完整保留PEG3；和二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)与适体上的氨基基团共价结合，并且PEG3不形成任何键。
43.权利要求中任一项的感应器，其中所述适体包括能被固定化到3-巯基丙酸(MPA)上的胺修饰的适体。
44.权利要求中任一项的感应器，其中所述表面具有在约5nM-约1000nM范围的最佳动力学。
45.权利要求中任一项的感应器，其中所述感应器包括混合长度的间隔层。
46.前述权利要求的感应器，其中所述混合长度层包括11-巯基十一烷酸(MUA)与3-巯基丙酸(MPA)相组合。
47.权利要求中任一项的感应器，其中所述SAM连接包括水溶的包含巯基的氨基酸，其能直接结合到基质的表面。
48.前述权利要求的感应器，其中所述氨基酸包括半胱氨酸。
49.权利要求中任一项的感应器，其中基质的至少表面是金的。
50.权利要求中任一项的感应器，其配置为感应包括血液中蛋白质的糖基化形式的分析物。
51.前述权利要求的感应器，其配置为从总血清蛋白水平中确定一部分特定的糖基化蛋白。
52.权利要求中任一项的感应器，其中所述分析物包括如下的一种或多种：人血红蛋白、白蛋白包括人血清白蛋白(HSA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、纤维蛋白原和/或其片段，所述分析物为糖基化或非糖基化形式。
53.权利要求中任一项的感应器，其中分析物包括至少第一种分析物，其具有与至少第二种分析物不同的半衰期。
54.前述权利要求的感应器，其中第一种分析物包括血红蛋白并且第二种分析物包括免疫球蛋白M(IgM)；并且，其中第一种分析物或第二种分析物以糖基化形式或非糖基化形式存在。
55.权利要求中任一项的感应器，其中所述分析物包括至少第一种分析物，至少第二种分析物和至少第三种分析物，第一种、第二种和第三种分析物的每一种具有不同的半衰期。
56.前述权利要求的感应器，其中第一种分析物包括血红蛋白，第二种分析物包括IgM并且第三种分析物包括白蛋白；其中第一种分析物、第二种分析物或第三种分析物的一种或多种是以糖基化形式或非糖基化形式存在。
57.权利要求中任一项的感应器用于监测过去的平均血液分析物水平的用途，其通过：将用前述权利要求中任一项的方法形成的感应器与血液样品相接触；确定血液中分析物的糖基化形式的量；并将血液样品分析物中以糖基化形式存在的分析物的量与给定时间范围的对照水平相关联。
58.前述权利要求的用途，其中所述蛋白质的糖基化形式的量使用表面等离子共振(SPR)来确定。
59.权利要求中任一项的感应器，其中所述适体包括能够与特定的分析物相互作用的核苷酸序列。
60.权利要求中任一项的感应器，其中所述感应器能够与选自如下的一种或多种分析物相互作用：大生物分子、小生物分子、有机分子、小分子、核酸、金属离子、蛋白质、酶、肽、药物、染料、癌细胞、病毒、激素或微生物。
61.权利要求中任一项的感应器，其中所述分析物是如下的一种或多种：生物样品、环境样品、化学样品、药物样品、食品样品、农业样品和兽医样品。
62.权利要求中任一项的感应器，其中所述分析物为血液蛋白。
63.权利要求中任一项的感应器，其中所述感应器具有基于连接子特性的能检测pM-nM的可调检测范围。
64.权利要求中任一项的感应器，其具有小于1分钟的反应时间。
65.权利要求中任一项的感应器，其在约室温下具有小于1分钟的反应时间。
66.权利要求中任一项的感应器，其中所述适体包括与SEQ IDNO:4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15中任一的完整序列有至少70％同一性的DNA序列。
67.权利要求中任一项的感应器，其中所述适体包括本文所要求保护的适体中的任意一种。
68.用于检测一种或多种分析物的试剂盒，其包括：权利要求中任一项的感应器；和包含感应器的至少一个容器，其中样品可以添加到所述容器中。
69.权利要求中任一项的试剂盒，其还包括一种或多种固体支持物；用于从洗脱物中分离感应器的一种或多种分离剂，以及用于从感应器中分离适体的一种或多种试剂。
70.用于从其中具有单个靶标位点结合适体和非靶标蛋白结合适体的核酸库中鉴定出单个靶标位点结合适体的方法，其包括：
a)向到核酸库中加入单个位点靶标蛋白复合物，其中库中存在的单个靶标位点结合适体和非靶标蛋白结合适体结合到单个位点靶标蛋白复合物上，并形成单个靶标位点结合适体+非靶标蛋白结合适体+单个位点靶标蛋白复合物；
b)从库中分离单个靶标位点结合适体+非靶标蛋白结合适体+单个位点靶标蛋白复合物；
c)将所述单个靶标位点结合适体和非靶标蛋白结合适体从单个位点靶标蛋白复合物上洗脱；
d)向上面步骤中的洗脱物中加入非靶标蛋白复合物，其中存在于步骤c)中的所述非靶标蛋白结合适体结合到非靶标蛋白复合物，并形成非靶标蛋白结合适体+非靶标蛋白复合物；
e)将非靶标蛋白结合适体+非靶标蛋白复合物从上面步骤的洗脱物中分离出来，在洗脱物中留下单个靶标位点结合适体；并且，
f)从洗脱物中分离单个靶标位点结合适体；任选地，进一步扩增单个靶标位点结合适体。
71.权利要求70的方法，其中所述单个靶标位点结合适体用来选择如下的一种：血红蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)和白蛋白。
72.权利要求70的方法，其中所述单个靶标位点结合适体选自：SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
73.权利要求70的方法，其中所述单个位点靶标蛋白固定化到固体支持物上。
74.权利要求70的方法，其中所述非靶标蛋白复合物固定化到固体支持物上。
75.权利要求70的方法，其中固体支持物包括磁珠、层析基质、微量滴定盘或阵列。
76.结合到糖基化的血红蛋白的适体，其中所述适体包括选自SEQ ID NO:4和5的核酸序列。
77.权利要求76的适体，其中所述糖基化的血红蛋白为人血红蛋白。
78.权利要求76的适体，其中所述适体对于人血红蛋白具有100nM或更小的解离常数。
79.权利要求76的适体，其中所述适体包括至少一种化学修饰。
80.权利要求79的适体，其中所述修饰选自：在糖位点的化学替换、在核苷酸之间连接的化学替换和在碱基位点的化学替换。
81.试验试剂，其包含有效量的权利要求76的适体或其盐，以及其支持物。
82.包括权利要求76的适体的试剂盒。
83.权利要求中任一项的适体，其结合到糖基化的血红蛋白，其中所述适体包括选自SEQ ID NO:4和5的核酸序列，以及5’-连接子和3’-连接子中一个或多个。
84.权利要求83的适体，其中所述连接子为自组装单层(SAM)。
85.适体，其与SEQ ID NO:4和5中任一的完整序列有至少70％同一性并结合到糖基化的人血红蛋白。
86.物质的组合物，其包括缀合到核酸适体分子的自组装单层(SAM)，所述核酸适体分子含有能特异地结合糖基化的血红蛋白的区域的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列选自SEQ ID NO:4和5。
87.权利要求86的组合物，其中所述适体分子为聚乙二醇化的。
88.前述权利要求的组合物，其中所述聚乙二醇化的适体分子包括1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)。
89.权利要求86的组合物，其中使用二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)和(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)形成所述SAM连接。
90.结合到非糖基化的血红蛋白的适体，其中所述适体包括选自SEQ ID NO:6和7的核酸序列。
91.权利要求90的适体，其中所述非糖基化的血红蛋白为人血红蛋白。
92.权利要求90的适体，其中所述适体对于人血红蛋白具有100nM或更小的解离常数。
93.权利要求90的适体，其中所述适体包括至少一种化学修饰。
94.前述权利要求的适体，其中所述修饰选自：在糖位点的化学替换、在核苷酸之间连接的化学替换和在碱基位点的化学替换。
95.试验试剂，其包含有效量的权利要求90的适体或其盐，以及其支持物。
96.包括权利要求90的适体的试剂盒。
97.权利要求90的适体，其结合到糖基化的血红蛋白，其中所述适体包括选自SEQ ID NO:6和7的核酸序列，以及5’-连接子和3’-连接子中一个或多个。
98.前述权利要求的适体，其中所述连接子为自组装单层(SAM)。
99.适体，其与SEQ ID NO:6和7中任一的完整序列有至少70％同一性并结合到糖基化的人血红蛋白。
100.物质的组合物，其包括缀合到核酸适体分子的自组装单层(SAM)，所述核酸适体分子含有能特异地结合非糖基化的血红蛋白的区域的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列选自SEQ ID NO:6和7。
101.权利要求100的组合物，其中所述适体分子为聚乙二醇化的。
102.前述权利要求的组合物，其中所述聚乙二醇化的适体分子包括1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)。
103.权利要求100的组合物，其中使用二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)和(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)形成所述SAM连接。
104.结合到糖基化的血清白蛋白的适体，其中所述适体包括选自SEQ ID NO:3、8和9的核酸序列。
105.权利要求104的适体，其中所述糖基化的血清白蛋白为糖基化的人血清白蛋白。
106.权利要求104的适体，其中所述适体对于糖基化的人血清白蛋白具有100nM或更小的解离常数。
107.权利要求104的适体，其中所述适体包括至少一种化学修饰。
108.前述权利要求的适体，其中所述修饰选自：在糖位点的化学替换、在核苷酸之间连接的化学替换和在碱基位点的化学替换。
109.试验试剂，其包含有效量的权利要求104的适体或其盐，以及其支持物。
110.包括权利要求104的适体的试剂盒。
111.权利要求104的适体，其结合到糖基化的血清白蛋白，其中所述适体包括选自SEQ ID NO:3、8和9的核酸序列，以及5’-连接子和3’-连接子中一个或多个。
112.前述权利要求的适体，其中所述连接子为自组装单层(SAM)。
113.适体，其与SEQ ID NO:3、8和9中任一的完整序列有至少70％同一性并结合到糖基化的人血清白蛋白。
114.物质的组合物，其包括缀合到核酸适体分子的自组装单层(SAM)，所述核酸适体分子含有能特异地结合糖基化的血清白蛋白的区域的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列选自SEQ ID NO:3、8和9。
115.前述权利要求的组合物，其中所述适体分子为聚乙二醇化的。
116.前述权利要求的组合物，其中所述聚乙二醇化的适体分子包括1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)。
117.权利要求114的组合物，其中使用二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)和(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)形成所述SAM连接。
118.结合到非糖基化的血清白蛋白的适体，其中所述适体包括选自SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15的核酸序列。
119.权利要求118的适体，其中所述非糖基化的血清白蛋白为糖基化的人血清白蛋白。
120.权利要求118的适体，其中所述适体对于非糖基化的人血清白蛋白具有100nM或更小的解离常数。
121.权利要求118的适体，其中所述适体包括至少一种化学修饰。
122.前述权利要求的适体，其中所述修饰选自：在糖位点的化学替换、在核苷酸之间连接的化学替换和在碱基位点的化学替换。
123.试验试剂，其包含有效量的权利要求118的适体或其盐，以及其支持物。
124.包括权利要求118的适体的试剂盒。
125.权利要求118的适体，其结合到非糖基化的血清白蛋白，其中所述适体包括选自SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15的核酸序列，以及5’-连接子和3’-连接子中一个或多个。
126.前述权利要求的适体，其中所述连接子为自组装单层(SAM)。
127.适体，其与SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15中任一的完整序列有至少70％同一性并结合到非糖基化的人血清白蛋白。
128.物质的组合物，其包括缀合到核酸适体分子的自组装单层(SAM)，所述核酸适体分子含有能特异地结合非糖基化的血清白蛋白的区域的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列选自SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15。
129.前述权利要求的组合物，其中所述适体分子为聚乙二醇化的。
130.前述权利要求的组合物，其中所述聚乙二醇化的适体分子包括1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)。
131.前述权利要求的组合物，其中使用二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐(DTSP)和(1-巯基-11-十一烷基)三(乙二醇)(PEG3)形成所述SAM连接。
132.纯化和分离的非天然发生的DNA序列，其选自SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
133.用于减少样本中可能存在的至少一种混杂物质的影响的方法，其包括：
a)将一个或多个亲水基团并入基质上的非结合位置，其足以基本上减少/防止混杂物质的非特异性吸附，
b)将适体连接到具有自组装单层(SAM)连接的基质上，所述SAM连接具有所需的连接间距和/或长度以形成在基质上的功能化的表面，和
c)通过SPR感应器在超过普通SPR检测限度的分隔距离上检测适体结合反应。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107430107A (zh) * 2015-03-11 2017-12-01 双孔人公司 通过竞争分析的小分子的纳米孔隙检测
CN109690294A (zh) * 2016-07-04 2019-04-26 塞尔图股份有限公司 用于测定转染的装置和方法
CN111440235A (zh) * 2020-04-16 2020-07-24 成都中医药大学 一种捕获水蛭素类多肽的探针及其应用
CN116794287A (zh) * 2023-06-19 2023-09-22 中国科学院大学 一种高抗垢性高准确率的粪便隐血传感器及其制备方法和应用

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9448198B2 (en) * 2011-07-05 2016-09-20 Stmicroelectronics Pte Ltd. Microsensor with integrated temperature control
KR101829668B1 (ko) * 2013-03-27 2018-02-14 김성천 생체분자와 단일가닥핵산의 결합정보를 생성하기 위한 기준물질 및 핵산칩, 이들의 제조방법 및 이들을 이용한 생체분자 분석방법 및 장치
TWI482857B (zh) * 2013-10-21 2015-05-01 Nat Univ Tsing Hua 針對糖化血紅素及血紅素具有高專一性的適合體及其應用
EP3124606A4 (en) * 2014-03-28 2017-11-08 Kyocera Corporation Rna aptamer and sensor using same
CN103957549B (zh) * 2014-05-14 2017-05-10 长江水利委员会长江科学院 基于遗传算法的河流局域无线传感器节点分布优化方法
WO2016159197A1 (ja) * 2015-03-30 2016-10-06 京セラ株式会社 Ｒｎａアプタマーおよびそれを用いたセンサ
US10071141B2 (en) 2015-05-08 2018-09-11 Spectral Platforms, Inc. Albumin-based non-covalent complexes and methods of use thereof
JP6548981B2 (ja) * 2015-07-14 2019-07-24 地方独立行政法人東京都立産業技術研究センター 表面プラズモン共鳴測定装置及びそのチップ
JP6822957B2 (ja) 2015-07-30 2021-01-27 京セラ株式会社 測定方法、および測定装置
KR102042661B1 (ko) * 2015-08-06 2019-11-08 광주과학기술원 타겟 물질 검출용 복합체 및 이를 이용한 타겟 물질 검출방법
JP6781876B2 (ja) * 2015-10-27 2020-11-11 国立大学法人 熊本大学 標的細胞捕捉装置
WO2017083310A1 (en) * 2015-11-09 2017-05-18 Inkaryo Corporation A normalization method for sample assays
US9863962B1 (en) * 2016-07-29 2018-01-09 Alfaisal University Aptamers and sensing technology used for detection of glycated hemoglobin in whole blood
WO2018089391A1 (en) 2016-11-08 2018-05-17 Dots Technology Corp. Allergen detection agents and assays
JP2018081027A (ja) * 2016-11-17 2018-05-24 新日本無線株式会社 バイオセンサ用電極の表面修飾方法
US10613083B2 (en) 2016-12-22 2020-04-07 Fundamental Solutions Corporation Universal biosensor system for analyte detection
CN106645074B (zh) * 2017-03-10 2020-04-14 泉州师范学院 一种胱氨酸片中胱氨酸含量的直接荧光光谱检测方法
EP3602065A4 (en) 2017-03-20 2020-12-23 Spectral Platforms, Inc. SPECTROSCOPIC METHODS OF DETECTION AND CHARACTERIZATION OF MICROORGANISMS
GB201709503D0 (en) 2017-06-15 2017-08-02 Method and device for assay improvement
WO2019117586A1 (ko) 2017-12-12 2019-06-20 주식회사 딕스젠 생체지표 진단용 실리카 나노입자 및 이의 제조방법
WO2019143923A1 (en) * 2018-01-18 2019-07-25 Eccrine Systems, Inc. Salinity-stabilized eab biosensors
CN108931647A (zh) * 2018-07-06 2018-12-04 深圳信息职业技术学院 光纤免疫传感器、检测装置及光纤免疫传感器的制作方法
RU2708546C1 (ru) * 2019-04-11 2019-12-09 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта" (БФУ им. И. Канта) Способ получения усиленного сигнала комбинационного рассеяния света от молекул сывороточного альбумина человека в капле жидкости
US11001847B2 (en) 2019-06-05 2021-05-11 Biovector, Inc. Aptamers against Clostridium difficile
RU2745511C1 (ru) * 2019-12-31 2021-03-25 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный технический университет имени Н.Э. Баумана (национальный исследовательский университет)" (МГТУ им. Н.Э. Баумана) Способ иммобилизации коротких нуклеотидных последовательностей на поверхность и торцевые области наноматериалов
US11898146B2 (en) 2020-12-03 2024-02-13 Liv Process, Inc. Aptamers against Clostridium difficile, compositions comprising aptamers against Clostridium difficile and methods of using the same
US11806711B1 (en) 2021-01-12 2023-11-07 Hound Labs, Inc. Systems, devices, and methods for fluidic processing of biological or chemical samples using flexible fluidic circuits
KR102328488B1 (ko) * 2021-06-24 2021-11-17 세종대학교산학협력단 니켈 이온 및 코발트 이온 중 적어도 하나에 특이적으로 결합하는 앱타머
WO2023189138A1 (ja) * 2022-03-30 2023-10-05 京セラ株式会社 光学デバイス及びバイオセンサ

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1720096A (zh) * 2002-12-04 2006-01-11 国际商业机器公司 表面处理

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991019813A1 (en) 1990-06-11 1991-12-26 The University Of Colorado Foundation, Inc. Nucleic acid ligands
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
DE10050632A1 (de) * 2000-10-12 2002-04-18 Stiftung Caesar Verfahren zum Nachweis biologischer Moleküle
US7179659B2 (en) * 2001-04-02 2007-02-20 Agilent Technologies, Inc. Sensor surfaces for detecting analytes and methods of use
JP4262426B2 (ja) * 2001-09-03 2009-05-13 富士フイルム株式会社 核酸断片固定電極及びその利用
JP2006337244A (ja) * 2005-06-03 2006-12-14 Matsushita Electric Ind Co Ltd 表面プラズモン共鳴法によるサンプル試料の測定方法及び装置
JP2008283883A (ja) * 2007-05-16 2008-11-27 Tokyo Medical & Dental Univ 標的タンパク質に特異的に結合する核酸のハイブリダイゼーションによる選択法
US20090042237A1 (en) 2007-08-06 2009-02-12 Henry John Smith Aptamer based point-of-care test for glycated albumin
EP2040075A1 (en) 2007-09-24 2009-03-25 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Compounds and markers for surface-enhanced raman scattering
US8137903B2 (en) * 2007-12-20 2012-03-20 Cytyc Corporation Method for magnetic separation of red blood cells from a patient sample
KR100962290B1 (ko) * 2008-02-13 2010-06-11 성균관대학교산학협력단 금 나노입자의 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서를 이용한 생체물질 검출 방법
JP5361221B2 (ja) * 2008-03-10 2013-12-04 国立大学法人九州大学 混合ｓａｍの作製方法
JP2011515680A (ja) * 2008-03-17 2011-05-19 ネルソン，ランドール，ダブリュ． 糖尿病のためのバイオマーカーおよびアッセイ
US20100099203A1 (en) 2008-10-03 2010-04-22 Molecular Sensing, Inc. Substrates with surfaces modified with PEG
US9310363B2 (en) * 2010-01-07 2016-04-12 Sensor-Kinesis Corporation Method and apparatus for forming of an automated sampling device for the detection of salmonella enterica utilizing an electrochemical aptamer biosensor

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1720096A (zh) * 2002-12-04 2006-01-11 国际商业机器公司 表面处理

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BYUNG-WOOK PARK等: "Surface modification of gold electrode with gold nanoparticles and mixed self-assembled monolayers for enzyme biosensors", 《KOREAN J. CHEM. ENG.》, vol. 28, no. 1, 31 December 2011 (2011-12-31), XP 055079935, DOI: doi:10.1007/s11814-010-0349-6 *
JENNIFER M.等: "A Multistep Chemical Modification Procedure To Create DNA Arrays on Gold Surfaces for the Study of Protein-DNA Interactions with Surface Plasmon Resonance Imaging", 《A MULTISTEP CHEMICAL MODIFICATION PROCEDURE TO CREATE DNA ARRAYS ON GOLD SURFACES FOR THE STUDY OF PROTEIN-DNA INTERACTIONS WITH SURFACE PLASMON RESONANCE IMAGING》 *
JEROEN POLLET等: "Fiber optic SPR biosensing of DNA hybridization and DNA–protein interactions", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》, no. 25, 3 September 2009 (2009-09-03) *
RUI ZHENG等: "Development of a highly specific amine-terminated aptamer functionalized surface plasmon resonance biosensor for blood protein detection", 《BIOMEDICAL OPTICS EXPRESS》, vol. 2, no. 9, 31 August 2011 (2011-08-31) *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107430107A (zh) * 2015-03-11 2017-12-01 双孔人公司 通过竞争分析的小分子的纳米孔隙检测
CN107430107B (zh) * 2015-03-11 2019-08-30 双孔人公司 通过竞争分析的小分子的纳米孔隙检测
CN109690294A (zh) * 2016-07-04 2019-04-26 塞尔图股份有限公司 用于测定转染的装置和方法
CN111440235A (zh) * 2020-04-16 2020-07-24 成都中医药大学 一种捕获水蛭素类多肽的探针及其应用
CN116794287A (zh) * 2023-06-19 2023-09-22 中国科学院大学 一种高抗垢性高准确率的粪便隐血传感器及其制备方法和应用
CN116794287B (zh) * 2023-06-19 2024-01-23 中国科学院大学 一种高抗垢性高准确率的粪便隐血传感器及其制备方法和应用

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