TWI482857B - 針對糖化血紅素及血紅素具有高專一性的適合體及其應用 - Google Patents

針對糖化血紅素及血紅素具有高專一性的適合體及其應用 Download PDF

Info

Publication number
TWI482857B
TWI482857B TW102137946A TW102137946A TWI482857B TW I482857 B TWI482857 B TW I482857B TW 102137946 A TW102137946 A TW 102137946A TW 102137946 A TW102137946 A TW 102137946A TW I482857 B TWI482857 B TW I482857B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
nucleic acid
acid sequence
heme
hemoglobin
Prior art date
Application number
TW102137946A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201516145A (zh
Inventor
Gwo Bin Lee
Shu Chu Shiesh
Ching Chu Wu
Hsin I Lin
Ko Wei Chang
Original Assignee
Nat Univ Tsing Hua
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nat Univ Tsing Hua filed Critical Nat Univ Tsing Hua
Priority to TW102137946A priority Critical patent/TWI482857B/zh
Priority to US14/225,081 priority patent/US9086406B2/en
Application granted granted Critical
Publication of TWI482857B publication Critical patent/TWI482857B/zh
Publication of TW201516145A publication Critical patent/TW201516145A/zh

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • G01N2333/805—Haemoglobins; Myoglobins

Description

針對糖化血紅素及血紅素具有高專一性的適合體及其應用
本發明係關於一種對糖化血紅素及血紅素專一性結合之適合體、及該些適合體之應用。
糖尿病(Diabetes mellitus)為一種非傳染性的慢性病，近年來已漸漸成為威脅人類健康的一主要疾病。糖尿病的成因與胰島素的不足或功能不全相關。胰島素是由胰臟製造的一種荷爾蒙，它可以幫助葡萄糖進入細胞，提供熱能，故若人體無法產生足夠的胰島素或所產生的胰島素無法正常作用，葡萄糖則無法進入細胞，導致血糖濃度升高，形成糖尿病。研究顯示，糖尿病與遺傳基因的關係密切並容易引發多種併發症，例如：心血管疾病、肺炎、神經病變，慢性腎臟病、失明等等。糖尿病同時也與一些不正常的生活習慣有關，故亦被視為二十一世紀具有挑戰性的文明病之一。
關於糖尿病的治療，早期的發現及患病後的控制得以降低相關併發症發生的機率，故對於糖尿病相關的檢測有其發展的必要性。目前，通常以血糖的變化(飯前、飯後的血糖測量)作為糖尿病的診斷及治療期間監控，然而，血糖值的測量容易受到飲食、運動、胰島素等影響，可能會有 較不穩定的波動，對於診斷及監測的準確度較低。目前亦有以糖化血紅素(hemoglobin A1c,HbA1c)作為指標的糖尿病檢測，測量糖化血紅素的變化可反應大約3個月的血糖變化狀況，較測量血糖更具可信度。
當前測定糖化血紅素的方式包括：陽離子交換層析法(Cation exchange HPLC)及親和力層析法(Boronate affinity HPLC)等，但由於檢測成本較高，需精密的儀器設備，且檢測的時間較長，故無法取代一般的血糖檢測。亦可使用免疫分析(Immunoassay)檢測糖化血紅素，但所使用的抗體價格普遍昂貴，且抗體本身對外在的環境條件，如：溫度、濕度，非常敏感，故保存不易且容易失去活性，會造成儲存、運送、及使用上的不便。再者，因抗體的製備為批次反應，各批次間的活性不會完全相同，而且操作抗體時容易受到人為或操作環境的影響而產生誤差。
有鑑於準確的診斷及血糖控制是治療糖尿病的基礎，需要一種檢測糖化血紅素的產品及方法，然而目前市面上尚缺乏一種準確、低成本、易保存且可高效率測量糖化血紅素值的檢測技術。
緣此，本發明之一目的係提供一種專一性地結合糖化血紅素的適合體，其中該適合體係一核酸分子且至少包含SEQ ID NO：1之核酸序列或其互補之核酸序列，該互補之核酸序列係為SEQ ID NO：2，其中當該適合體包含SEQ ID NO：1之核酸序列時，該適合體進一步包含正向引子SEQ ID NO：9之核酸序列及反向引子SEQ ID NO：10之核酸序列；當該適合體包含SEQ ID NO：2之核酸序列時，該適合體進一步包含正向引子SEQ ID NO：11之核酸序列及反向引子SEQ ID NO：12之核酸序列。
本發明之另一目的係提供一種專一性地結合血紅素的適合體，其中該適合體係一核酸分子且至少包含SEQ ID NO：5之核酸序列或其互補之核酸序列，該互補之核酸序列係為SEQ ID NO：6；其中，當該適合體包含SEQ ID NO：5之核酸序列時，該適合體進一步包含正向引子SEQ ID NO：13之核酸序列及反向引子SEQ ID NO：14之核酸序列；當該適合體包含SEQ ID NO：6之核酸序列時，該適合體進一步包含正向引子SEQ ID NO：15之核酸序列及反向引子SEQ ID NO：16之核酸序列。另外，本發明之專一性結合糖化血紅素的適合體及/或專一性地結合血紅素的適合體皆具有主幹與環結構的二級結構。
本發明之又一目的係提供一種用於偵測血液中糖化血紅素及/或血紅素存在之微流體晶片，係包含本發明之專一性地結合糖化血紅素的適合體及/或專一性地結合血紅素的適合體。
本發明提供一種偵測檢體中糖化血紅素及/或血紅素存在之方法，其步驟包含：(a)提供至少一種專一性地結合糖化血紅素的適合體及/或專一性地結合血紅素的適合體；(b)將該適合體與一檢體接觸，使該檢體中的糖化血紅素及/或血紅素與該適合體結合；以及(c)偵測與該適合體結合之糖化血紅素及/或血紅素，以判定該檢體中糖化血紅素及/或血紅素存在與否，其中若步驟(c)係判定該檢體中糖化血紅素之存在與否，則選擇SEQ ID NO：3之適合體，其係包含SEQ ID NO：1之專一性結合糖化血紅素之核酸序列，或選擇SEQ ID NO：4之適合體，其係包含SEQ ID NO：2之專一性結合糖化血紅素之核酸序列；若步驟(c)係判定該檢體中血紅素之存在與否，則選擇SEQ ID NO：7之適合體，其係包含SEQ ID NO：5之專一性結合血紅素之核 酸序列，或選擇SEQ ID NO：8之適合體，其係包含SEQ ID NO：6之專一性結合血紅素之核酸序列。該與適合體結合之糖化血紅素及/或血紅素進一步與一顯光劑結合，該顯光劑可發出冷光、螢光、可見光或紫外光；在本發明之一實施例中，步驟(c)之偵測檢體中糖化血紅素及/或血紅素存在的方法包括但不限於免疫分析法(immunoassay)或電化學法，且該檢體係為血液。
本發明之適合體對糖化血紅素或血紅素具有高度專一性及結合率，可用於檢測血液中的糖化血紅素或血紅素，尤其糖化血紅素之適合體對於其他同源非糖化血紅蛋白不與其結合。且本發明之適合體分子量小、具有熱穩定性、抗降解，可長期保存、可重覆使用並容易聯結其他分子，相較於抗體，不僅能克服動物生產的缺點，且容易放大、能保持生產的精確性，故可取替代抗體，低成本並精確地檢測血液中的糖化血紅素及血紅素。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用，而非以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
11‧‧‧磁珠
12‧‧‧目標蛋白質
13‧‧‧牛血清蛋白
14‧‧‧目標蛋白質-磁珠複合物
15‧‧‧DNA分子庫
16‧‧‧單股DNA分子
17‧‧‧SELEX微流體晶片
18‧‧‧TA選殖
19‧‧‧競爭分析
20‧‧‧DNA定序
41‧‧‧表面修飾卵白素的磁珠
411‧‧‧磁珠
412‧‧‧卵蛋白
42‧‧‧修飾生物素的糖化血紅素專一性適合體
421‧‧‧生物素
422‧‧‧糖化血紅素專一性適合體
43‧‧‧糖化血紅素
44‧‧‧吖啶翁酯標記之糖化血紅素抗體
441‧‧‧糖化血紅素抗體
442‧‧‧吖啶翁酯
45‧‧‧冷光偵測
第1圖係利用一微流體晶片篩選對目標蛋白質具專一性適合體之流程圖。
第2圖係本發明篩選適合體之膠體電泳圖，其中(a)係正篩選；(b)係負篩選；(c)係競爭分析結果，其中N代表牛血清蛋白包覆的磁珠 與SEQ ID NO：3之結合情形、Hb代表血紅素聯結的磁珠與SEQ ID NO：3之結合情形、P代表糖化血紅素聯結的磁珠與SEQ ID NO：3之結合情形、C代表競爭組分析。
第3圖係本發明之專一性地結合糖化血紅素的適合體由MFOLD程式預測之二級結構圖，其中(a)SEQ ID NO：3；(b)SEQ ID NO：4。
第4圖係使用本發明之專一性地結合糖化血紅素的適合體檢測血液中糖化血紅素的流程圖。
第5圖係本發明之專一性地結合糖化血紅素的SEQ ID NO：3適合體對糖化血紅素之結合率。
第6圖係本發明之專一性地結合糖化血紅素的SEQ ID NO：3適合體對糖化血紅素之專一性。
第7圖係本發明之專一性地結合血紅素的適合體由MFOLD程式預測之二級結構圖，其中(a)SEQ ID NO：7；(b)SEQ ID NO：8。
第8圖係本發明之專一性結合血紅素的SEQ ID NO：7適合體對血紅素之結合率。
本發明提供一種專一性地結合糖化血紅素的適合體，係藉由系統性配分子指數增益演繹程序(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)體外篩選技術與微流體晶片技術結合篩選而得，其對糖化血紅素亦具有高結合率。更進一步以本發明之專一性地結合糖化血紅素的適合體聯結於磁珠上進行免疫分析並用冷光偵測，以驗證其對糖化血紅素之高專一性並可用於檢測血液中的糖化血紅素，或作為糖尿 病的檢測。
本發明亦提供一種專一性地結合血紅素的適合體，該適合體之篩選亦經由上述SELEX體外篩選與微流體晶片技術，其對於血紅素具有高結合率。同樣地，以本發明專一性地結合血紅素的適合體聯結磁珠，透過免疫分析及冷光偵測，驗證其對血紅素之高專一性，故，可用於檢測血紅素，或作為貧血之檢測，或作為糖尿病檢測之基本要件。
定義
「核酸」、「核酸分子」、「核酸序列」、「聚核苷酸」、「核苷酸」、、「聚核苷酸序列」及「核苷酸序列」一詞在本文中可互換使用，以表示任何長度之核苷酸的聚合物形式。核苷酸包含去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及/或其類似物或衍生物。聚核苷酸之實例亦包含但不限於單股型式、雙股型式、主幹(stem)及環(loop)結構及類似者之所有序列型式。本文所示之核苷酸序列係以5’至3’方向排列。
「具專一性」係為當該適合體可與糖化血紅素或血紅素結合或產生交互作用，但未顯著地與其他血紅素或蛋白質結合或產生交互作用。
「微流體晶片」、「微流體裝置」、及「晶片」一詞在本文中可互換使用，以表示一獨立的整合單元，其具有一微流體反應器、一個或多個微流體流道、及一個或多個閥門(valve)。微流體晶片亦典型地具有其他微流體組件，例如：泵浦(pump)、槽(chamber)、混合器(mixer)、及其類似的組件。微流體晶片通常係由合成橡膠(elastomer)、玻璃(glass)、或矽(silicon)製成。典型地，微流體晶片係為具有一高度相較於長度及寬度為短的盒狀物，然而，晶片亦可為任意形狀，例如：立方體、圓柱體、或其他。
「抗體」一詞在本文中係包括但不限於一實質上由免疫球蛋白編碼的多胜肽或多胜肽片段，其專一性地結合且辨識一被測物(抗原)。
SELEX微流體晶片與檢測微流體晶片
本發明提供兩種微流體晶片：SELEX微流體晶片與檢測微流體晶片。SELEX微流體晶片係用來自動化的執行SELEX，分離出本發明專一性地結合糖化血紅素的適合體及專一性地結合血紅素的適合體；檢測晶片係用來執行糖化血紅素或血江素的檢測。本發明之SELEX微流體晶片與檢測微流體晶片皆由兩層聚二甲基矽氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS，Sylgard 184A/B，Dow Corning Corp.，美國)及一玻璃層(G-Tech Optoelectronics Corp.，臺灣)以三層三明治結構(three-layer sandwich structure)組成。在該三層三明治結構中，中層的聚二甲基矽氧烷層係一薄液體微流道層(thin-film liquid microchannel layer)；上層的聚二甲基矽氧烷層係一厚空氣槽層(thick-film air chamber layer)；底層則為該玻璃層作為一基材(substrate)。承載槽(loading chamber)的直徑為5mm。液體微流道的厚度大約為0.3mm、深度大約為0.2mm。該厚空氣槽層含有一氣動式組件(pneumatic component)，其包括微泵浦(micropump)、微混合器(micromixer)、常閉式微閥門(normally-closed microvalves)，該厚空氣槽層之厚度大約為5mm。空氣係由一個或多個電磁閥(electromagnetic valves，EMVs)注入該厚空氣槽層，該電磁閥係由電腦程式所控制。
糖化血紅素聯結的磁珠之製備
為執行SELEX篩選對糖化血紅素具有專一性之適合體，本發明進一步提供一種糖化血紅素聯結的磁珠，其製備方法如下：
1.加入25μL(濃度=4×108 磁珠/mL，直徑=4.5μm)環氧樹脂包覆的磁珠(Epoxy-coated magnetic beads)至微量離心管(Eppendorf tube)。
2.提供一磁場並去除微量離心管中之上清液。
3.以500μL磷酸緩衝液(0.01M，pH7.4)清洗磁珠三次。
4.加入5μg之糖化血紅素(1μg/μL)(IRMM，IFCC-466)至500μL之碳酸鹽緩衝液，於4℃隔夜反應。
5.提供一磁場並去除微量離心管中之上清液，重複第3步驟。
6.加入500μL含有牛血清蛋白之Tris緩衝液(10mM Tris，100mM NaCl，2mM CaCl2 ，1% BSA)至該微量離心管以潤飾該聯結血紅素磁珠表面上未聯結的部分，置於4℃並隔夜。
血紅素聯結的磁珠之製備
本發明亦提供一種血紅素聯結的磁珠，應用於SELEX篩選對血紅素具有專一性之適合體，其製備方法如上述糖化血紅素聯結的磁珠之製備，惟，上述糖化血紅素聯結的磁珠之製備的第4步驟，加入之血紅素為5μL，濃度為2μg/μL。(Sigma,H0267)
單股DNA分子庫(ssDNA library)
單股DNA分子庫之序列含有：一40-mer隨機的核苷酸序列位於中間、及前後各16-mer的引子序列。該單股DNA分子庫包含多種序列，該單股DNA分子庫包含之一種序列如下所示：5’-TGGCAGGAAGACAAAC-N40 -TGGTCTGTGGTGCTGT-3’，其中包含一正向引子：5’-TGGCAGGAAGACAAAC-3’(SEQ ID NO：9)及一反向引子：5’-ACAGCACCACAGACCA-3’(SEQ ID NO：10)；該單股DNA分子庫放大 後包含之另一種序列如下所示：5’-ACAGCACCACAG-ACCA-N40 -GTTTGTCTTCCTGCCA-3’，其中包含一正向引子：5’-ACAGCACCACAGACCA-3’(SEQ ID NO：11)及一反向引子：5’-TGGCAGGAAGACAAAC-3’(SEQ ID NO：12)；該單股DNA分子庫包含之另一種序列如下所示：5’-GGCAGGAAGACAAACA-N40 -TGGTCTGTGGTGCTGT，其中包含一正向引子：5’-GGCAGGAAGACAAACA-3’(SEQ ID NO：13)及一反向引子：5’-ACAGCACCACAGACCA-3’(SEQ ID NO：14)；該單股DNA分子庫放大後包含之另一種序如下所示：5’ACAGCACCACAGACCA-N40 -TGTTTGTCTTCCTGCC，其中包含一正向引子：5’ACAGCACCACAGACCA-3’(SEQ ID NO：15)及一反向引子：5’GGCAGGAAGACAAACA-3’(SEQ ID NO：16)。執行SELEX自單股DNA分子庫之序列中篩選出對糖化血紅素具有專一性之單股DNA分子，以及對血紅素具有專一性之單股DNA分子。
實施例1：篩選對糖化血紅素具有高專一性之適合體
為了篩選出對糖化血紅素具有高專一性之適合體以取代抗體，作為檢測血液中糖化血紅素的生物標記，本發明結合磁珠技術與SELEX進行篩選，因為其僅需少量的反應物，且磁珠可承受PCR放大反應時的高溫。糖化血紅素與適合體(核苷酸)係主要以凡得瓦力(van der Waals interaction)與氫鍵結合。除了可專一性結合糖化血紅素的適合體外，DNA分子庫中亦存在以靜電交互作用力非專一性結合糖化血紅素的分子，故執行數個SELEX循環提升對糖化血紅素具有高專一性適合體之淘選度。
請參考第1圖，該圖係利用微流體晶片篩選對目標蛋白質具專一性適合體之流程圖。本實施例中目標蛋白質12 係為糖化血紅素。首先，如上述方法，將目標蛋白質12 聯結磁珠11 形成一目標蛋白質-磁珠複合物14 ，該目標蛋白質-磁珠複合體14 進一步以牛血清蛋白13 潤飾複合體表面；接著，將DNA分子庫15 中的雙股DNA分子以PCR裝置將其變性形成單股DNA分子16 。將該目標蛋白質-磁珠複合體14 及單股DNA分子16 加入上述SELEX微流體晶片17 中，該SELEX微流體晶片17 可自動化地執行培養、清洗、放大流程，以篩選對目標蛋白質具有專一性的適合體，即為對糖化血紅素具有專一性的適合體。經過複數次的SELEX循環，篩選出數個單股DNA分子。接著進行TA選殖18 ，該些單股DNA分子進一步進行各自的競爭分析19 及DNA定序20 ，呈現對糖化血紅素具有高專一性的單股DNA分子，即為本發明對糖化血紅素具有高專一性之適合體。對糖化血紅素具有高專一性之適合體之解離係數(dissociation constant，Kd)以表面電漿共振(surface plasmon resonance)方法測量之。
上述SELEX之步驟，進一步詳細說明如下：首先，以牛血清蛋白潤飾流道層，防止單股DNA分子非專一性結合至該SELEX微流體晶片的玻璃層。將37μL糖化血紅素-磁珠複合體與3μL單股DNA分子庫(濃度為10μM)加入至該SELEX微流體晶片的培養槽並以微混合器混合5分鐘。待單股DNA分子庫中對糖化血紅素具有高專一性的單股DNA分子，即適合體，與糖化血紅素-磁珠複合體結合後，以一磁場將此適合體-糖化血紅素-磁珠複合體滯留在培養槽中，以微泵浦將1000μL磷酸緩衝液(0.01M，pH 7.4)注入，清洗未結合或結合能力較弱的單股DNA分子。再利用PCR放大該 結合糖化血紅素的單股DNA分子，加入28μL PCR試劑至該槽以進行PCR反應。上述培養、清洗、放大的流程即為一次SELEX循環。在進行下一次SELEX循之前，放大的DNA分子經由加熱變性為單股DNA分子，而後再一次進行上述培養、清洗、放大流程。上述SELEX中，若是以糖化血紅素-磁珠複合體進行結合單股DNA分子，稱之為糖化血紅素正篩選(Hemoglobin A1c positive selection)；若是以血紅素-磁珠複合體進行結合單股DNA分子，則稱之為糖化血紅素負篩選(Hemoglobin A1c negative selection)。本實施例共進行七次糖化血紅素正篩選與糖化血紅素負篩選，篩選出對糖化血紅素具有高專一性的適合體。
上述競爭分析之步驟，進一步詳細說明如下：將SELEX篩選出的適合體與牛血清蛋白包覆的磁珠、血紅素聯結的磁珠、及糖化血紅素聯結的磁珠共同反應，並於競爭組加入游離的糖化血紅素，使其與糖化血紅素聯結的磁珠競爭對適合體的結合反應，接著以磁場抓取，並經PCR放大偵測被抓取下的適合體。
藉由SELEX微流體晶片篩選對糖化血紅素具有高專一性的適合體的結果，請參考第2(a)及2(b)圖。第2(a)及2(b)圖中清楚顯示，糖化血紅素正篩選及糖化血紅素負篩選均篩選出72bp的DNA分子，即可與糖化血紅素專一性結合之適合體。
將篩選出的DNA分子進行TA選殖，並選擇其中13株進行競爭分析。該競爭分析的結果如第2(c)圖所示，在陽性控制組糖化血紅素(P)道的條帶明顯地較競爭組(C)道的條帶清晰，已明確表示本發明之適合體與糖化血紅素有高度親和性，而陽性控制組糖化血色素(P)道的條帶較血紅素 (Hb)道的條帶清晰，已明確表示本發明之適合體高專一性地結合糖化血紅素而非血紅素。
競爭分析後，選取對糖化血紅素具有最高專一性結合能力的DNA分子進行定序，可得到SEQ ID NO：3之核酸序列：5’-TGGCAGGAAGACAAACACATCGTCGCGGCCTTAGGAGGGGCGGACGGGGGGGGGCGTGGTCTGTGGTGCTGT-3’；以及SEQ ID NO：4之核酸序列：5’-ACAGCACCACAGACCACGCCCCCCCCCGTCCGCCCCTCCT-AAGGCCGCGACGATGTGTTTGTCTTCCTGCCA-3’。前述二序列並以MFOLD程式進行二級結構預測，其結果如第3圖所示，其中，SEQ ID NO：3之核酸序列具有較低的自由能為-14.9kcal/mol，且其包含SEQ ID NO：1之核酸序列，此為40個核苷酸之序列。另一方面，SEQ ID NO：4之核酸序列則具有-11.47kcal/mol的自由能，其包含SEQ ID NO：2之核酸序列。
因此，本發明提供一種專一性地結合糖化血紅素之適合體，較佳為SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4：其中SEQ ID NO：3之適合體係包含與糖化血紅素專一性結合之SEQ ID NO：1核酸序列、SEQ ID NO：9之正向引子、及SEQ ID NO：10之反向引子；而其中SEQ ID NO：4之適合體係包含與糖化血紅素專一性結合之SEQ ID NO：2核酸序列、SEQ ID NO：11之正向引子、及SEQ ID NO：12之反向引子。
實施例2：以對糖化血紅素具有高專一性的適合體檢測糖化血紅素
本發明之檢測係為一雙抗體分析(Two-antibody assay)並由上述檢測微流體晶片執行。首先，將血液與以糖化血紅素抗體聯結的磁珠加入晶片的反應槽中，並以微混合器進行混合。待血液中的糖化血紅素與 以糖化血紅素抗體聯結的磁珠結合後，以磁場導引並清洗未結合的物質。接著，加入一顯光劑，較佳為吖啶翁酯(Acridinium ester，化學螢光)標記之糖化血紅素抗體至該反應槽，使其與被抓取的糖化血紅素反應。最後加入H2 O2 與NaOH進行混合，並以冷光儀(luminometer)偵測其化學螢光訊號。
請參考第4圖，該圖係以本發明之專一性地結合糖化血紅素的適合體檢測血液中糖化血紅素的流程圖。首先，使用專一性地結合糖化血紅素的適合體422 ，較佳為實施例1中具有較低自由能的SEQ ID NO：3之核酸序列，將生物素(biotin)421 標記於該適合體422 的5’端，並以之替代上述雙抗體分析中與磁珠聯結的糖化血紅素抗體。磁珠411 具卵白素(streptavidin)412 修飾磁珠411 的表面，該經生物素(biotin)標記之適合體42 係聯結至該表面修飾卵白素(streptavidin)的磁珠41 ，並與血液混合，本發明之適合體422 與血液中的糖化血紅素43 結合。以磁場導引並清洗去除未結合的物質。接著提供糖化血紅素抗體441 並以吖啶翁酯442 標記，加入該吖啶翁酯標記之糖化血紅素抗體44 ，反應後以冷光儀進行偵測45 。其結果如第5圖所示，第5圖顯示血液中糖化血紅素會與以本發明對糖化血紅素具有高專一性之適合體聯結之磁珠結合，並且呈現高斜率，即R2 為0.9833，表示本發明對糖化血紅素具高專一性之適合體對糖化血紅素具有高結合率。
此外，若將上述檢測流程中的吖啶翁酯標記之糖化血紅素抗體替換為吖啶翁酯標記之血紅素抗體，則所偵測到的化學螢光訊號顯著地下降，如第6圖所示。表示本發明之適合體係專一性地結合糖化血紅素，而非血紅素。
實施例3：篩選對血紅素具有高專一性之適合體
本發明亦以SELEX微流體晶片篩選出對血紅素具有高專一性之適合體，其可以取代抗體，作為辨識血液中血紅素的生物標記。篩選對血紅素具有高專一性之適合體流程係與實施例1相同，故，請參考第1圖之利用微流體晶片篩選對目標蛋白質具專一性適合體之流程圖，惟，本實施例中目標蛋白係為血紅素。
本實施例之SELEX篩選中，若是以血紅素-磁珠複合體進行結合單股DNA分子，稱之為血紅素正篩選(Hemoglobin positive selection)；若是以牛血清蛋白-磁珠複合體進行結合單股DNA分子，則稱之為血紅素負篩選(Hemoglobin negative selection)。經由本實施例之血紅素正篩選與-牛血清蛋白負篩選循環，篩選出對血紅素具有高專一性的適合體。
本實施例篩選出之對血紅素具有高專一性之單股DNA分子進一步進行定序，可得到SEQ ID NO：7之核酸序列：5’-GGCAGGAAGACAAACACCAGGTGAGGGAGACGACGCGAGTGTTAGATGGTAGCTGTTGGTCTGTGGTGCTGT-3’；以及SEQ ID NO：8之核酸序列：5’-ACAGCACCACAGACCAACAGCTACCATCTAACACTCGCGTCGT-CTCCCTCACCTGGTGTTTGTCTTCCTGCC-3’。將SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8之序列以MFOLD程式進行二結構之預測，其結果如第7圖所示，其中，(a)SEQ ID NO：7之核酸序列具有較低的自由能為-9.67kcal/mol，其包含SEQ ID NO：5之40個核苷酸序列。另一方面，(b)SEQ ID NO：8之核酸序列則具有-6.37kcal/mol的自由能，其包含SEQ ID NO：6之40個核苷酸之序列。
因此，本發明提供一種專一性地結合血紅素之適合體，較佳為SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：8；其中SEQ ID NO：7之適合體係包含與血紅 素專一性結合之SEQ ID NO：5核酸序列、SEQ ID NO：13之正向引子、及SEQ ID NO：14之反向引子；而其中SEQ ID NO：8之適合體係包含與血紅素專一性結合之SEQ ID NO：6核酸序列、SEQ ID NO：15之正向引子、及SEQ ID NO：16之反向引子。
實施例4：以對血紅素具有高專一性的適合體檢測血紅素
本實施例之檢測亦為一雙抗體分析，檢測流程請參考實施例2。所使用之適合體較佳為實施例3中具有較低自由能的SEQ ID NO：7之核酸序列。以經由生物素標記之該適合體取代雙抗體分析中之血紅素抗體並聯結至表面修飾卵白素的磁珠，將之與血液混合，對血紅素具有高專一性之適合體會與血液中的血紅素結合。經由磁場抓取並清洗報除未結合的物質後，加入一標記有吖啶翁酯之血紅素抗體，該標記有吖啶翁酯之血紅素抗體聯結至血紅素並產生發光反應，故，能以冷光儀進行偵測。結果請參考第8圖，第8圖顯示血液中的血紅素會與本發明對血紅素具有高專一性之適合體聯結之磁珠結合，且表現出高斜率，即R2 為0.9821，表示本發明對血紅素具高專一性之適合體對血紅素之結合率高。
綜上所述，本發明之適合體分別對糖化血紅素、血紅素具有高度的專一性及結合率，且適合體分子量小、低自由能、可重覆使用及容易連結其他分子，相較於抗體，不僅能克服動物生產的缺點，且容易放大、能保持生產的精確性，故可代替傳統使用抗體的方法，用來檢測血液中的糖化血紅素與血紅素。
本發明所提供之專一性地結合糖化血紅素、血紅素的適合體、用於偵測血液中糖化血紅素/及或血紅素存在之微流體晶片、及偵測血 液中糖化血紅素及/或血紅素存在之方法確具產業上之利用價值，惟以上之敘述僅為本發明之較佳實施例說明，凡精於此項技藝者當可依據上述之說明而作其它種種之改良，惟這些改變仍屬於本發明之精神及以下所界定之專利範圍中。
<110> 國立清華大學
<120> 針對糖化血紅素及血紅素具有高專一性的適合體及其應用
<160> 16
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 與糖化血紅素專一性結合之DNA
<400> 1
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 與糖化血紅素專一性結合之DNA
<400> 2
<210> 3
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 糖化血紅素專一性適合體
<400> 3
<210> 4
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 糖化血紅素專一性適合體
<400> 4
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 與血紅素專一性結合之DNA
<400> 5
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 與血紅素專一性結合之DNA
<400> 6
<210> 7
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 血紅素專一性適合體
<400> 7
<210> 8
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 血紅素專一性適合體
<400> 8
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 糖化血紅素專一性適合體之正向引子
<400> 9
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 糖化血紅素專一性適合體之反向引子
<400> 10
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 糖化血紅素專一性適合體之正向引子
<400> 11
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 糖化血紅素專一性適合體之反向引子
<400> 12
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 血紅素專一性適合體之正向引子
<400> 13
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 血紅素專一性適合體之反向引子
<400> 14
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 血紅素專一性適合體之正向引子
<400> 15
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 血紅素專一性適合體之正向引子
<400> 16

Claims (12)

  1. 一種專一性地結合糖化血紅素的適合體，其中該適合體係一核酸分子且至少包含SEQ ID NO：1之核酸序列或其互補之核酸序列，其中該互補之核酸序列係為SEQ ID NO：2。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之適合體，其中當該適合體包含SEQ ID NO：1之核酸序列時，該適合體進一步包含正向引子SEQ ID NO：9之核酸序列及反向引子SEQ ID NO：10之核酸序列。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之適合體，其中當該適合體包含SEQ ID NO：2之核酸序列時，該適合體進一步包含正向引子SEQ ID NO：11之核酸序列及反向引子SEQ ID NO：12之核酸序列。
  4. 一種專一性地結合血紅素的適合體，其中該適合體係一核酸分子且至少包含SEQ ID NO：5之核酸序列或其互補之核酸序列，其中該互補之核酸序列係為SEQ ID NO：6。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之適合體，其中當該適合體包含SEQ ID NO：5之核酸序列時，該適合體進一步包含正向引子SEQ ID NO：13之核酸序列及反向引子SEQ ID NO：14之核酸序列。
  6. 如申請專利範圍第4項所述之適合體，其中當該適合體包含SEQ ID NO：6之核酸序列時，該適合體進一步包含正向引子SEQ ID NO：15之核酸序列及反向引子SEQ ID NO：16之核酸序列。
  7. 如申請專利範圍第2、3、5或6所述之適合體，其中該適合體具有主幹與環之二級結構。
  8. 一種用於偵測血液中糖化血紅素及/或血紅素存在之微流體晶片，係包 含如申請專利範圍第1項及/或申請專利範圍第6項所述之適合體。
  9. 一種偵測檢體中糖化血紅素及/或血紅素存在之方法，其步驟包含：(a)提供至少一種如申請專利範圍第1項及/或申請範圍第4項所述之適合體；(b)將該適合體與一檢體接觸，使該檢體中的糖化血紅素及/或血紅素與該適合體結合；以及(c)偵測與該適合體結合之糖化血紅素及/或血紅素，以判定該檢體中糖化血紅素及/或血紅素存在與否；其中，若步驟(c)係判定該檢體中糖化血紅素之存在與否，則選擇SEQ ID NO：3之適合體，其係包含SEQ ID NO：1之專一性結合糖化血紅素之核酸序列，或選擇SEQ ID NO：4之適合體，其係包含SEQ ID NO：2之專一性結合糖化血紅素之核酸序列；若步驟(c)係判定該檢體中血紅素之存在與否，則選擇SEQ ID NO：7之適合體，其係包含SEQ ID NO：5之專一性結合血紅素之核酸序列，或選擇SEQ ID NO：8之適合體，其係包含SEQ ID NO：6之專一性結合血紅素之核酸序列。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該檢體係為血液。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中步驟(c)中之該與適合體結合之糖化血紅素及/或血紅素進一步與一顯光劑結合。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該顯光劑係發出冷光、螢光、可見光或紫外光。
TW102137946A 2013-10-21 2013-10-21 針對糖化血紅素及血紅素具有高專一性的適合體及其應用 TWI482857B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW102137946A TWI482857B (zh) 2013-10-21 2013-10-21 針對糖化血紅素及血紅素具有高專一性的適合體及其應用
US14/225,081 US9086406B2 (en) 2013-10-21 2014-03-25 Hemoglobin A1c-specific aptamer, hemoglobin-specific aptamer, and applications thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW102137946A TWI482857B (zh) 2013-10-21 2013-10-21 針對糖化血紅素及血紅素具有高專一性的適合體及其應用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TWI482857B true TWI482857B (zh) 2015-05-01
TW201516145A TW201516145A (zh) 2015-05-01

Family

ID=52826509

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW102137946A TWI482857B (zh) 2013-10-21 2013-10-21 針對糖化血紅素及血紅素具有高專一性的適合體及其應用

Country Status (2)

Country Link
US (1) US9086406B2 (zh)
TW (1) TWI482857B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI638161B (zh) * 2017-01-23 2018-10-11 聯華生技股份有限公司 Glycated hemoglobin detector and detection method capable of eliminating individual differences

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017205267A1 (en) 2016-05-22 2017-11-30 Cornell University Multifunctional microfluidic device for capturing target cells and analyzing genomic dna isolated from the target cells while under flow conditions
KR101901025B1 (ko) * 2016-11-11 2018-09-20 충북대학교 산학협력단 당화혈색소 단백질에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도
CN106520774B (zh) * 2016-12-27 2019-05-10 三诺生物传感股份有限公司 一种糖化血红蛋白的核酸适配子及其应用和检测糖化血红蛋白的试剂盒
CN109201128A (zh) * 2017-07-05 2019-01-15 京东方科技集团股份有限公司 微流控芯片、化学发光免疫分析系统和分析方法
CN113481203B (zh) * 2021-06-08 2022-10-11 深圳市人民医院 与人FXYD2γa特异性结合的核酸适配体及其衍生物、筛选方法及应用
CN113984863B (zh) * 2021-10-28 2024-03-15 上海市临床检验中心 一种基于核酸适配体生物传感器的糖化血红蛋白检测方法
CN116794287B (zh) * 2023-06-19 2024-01-23 中国科学院大学 一种高抗垢性高准确率的粪便隐血传感器及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102965378A (zh) * 2012-11-14 2013-03-13 广西安仁欣生物科技有限公司 一种糖化血红蛋白的核酸适体及其制备方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3463098B2 (ja) * 1999-10-08 2003-11-05 独立行政法人産業技術総合研究所 モジュレートアプタマー及びこれを用いた標的タンパク質の検出方法
EP1493810A1 (en) * 2003-06-30 2005-01-05 Gentium S.p.A. DNA-based aptamers for human cathepsin G
WO2005049826A1 (ja) * 2003-11-22 2005-06-02 Ultizyme International Ltd. アプタマーを用いた標的分子の検出方法
US8569252B2 (en) 2009-04-15 2013-10-29 Postech Academy-Industry Foundation Nucleolin specific aptamer and use thereof
EP2576786B1 (en) 2010-05-27 2016-04-06 The University of Hong Kong High-affinity nucleic acid aptamers against sclerostin protein
KR101319202B1 (ko) 2011-06-07 2013-10-23 포항공과대학교 산학협력단 ｐＬＤＨ에 특이적으로 결합하는 ＤＮＡ 압타머
KR102138106B1 (ko) * 2012-01-31 2020-07-28 더유니버시티오브톨레도 피분석물을 검출 및 측정하기 위한 방법 및 장치

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102965378A (zh) * 2012-11-14 2013-03-13 广西安仁欣生物科技有限公司 一种糖化血红蛋白的核酸适体及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
2013年02月21日，Aptamer-based surface plasmon resonance sensing of glycated human blood proteins，Nathan G，http://spie.org/Publications/Proceedings/Paper/10.1117/12.2002086 2012年11月01日，A RAPID SCREENING FOR HEMOGLOBIN-SPECIFIC APTAMERS BY USING A CONTINUOUS MICROFLUIDIC SYSTE，Ching-Chu Wu，16th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences October 28 - November 1, 2012, Okinawa, Japan *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI638161B (zh) * 2017-01-23 2018-10-11 聯華生技股份有限公司 Glycated hemoglobin detector and detection method capable of eliminating individual differences

Also Published As

Publication number Publication date
US20150111306A1 (en) 2015-04-23
US9086406B2 (en) 2015-07-21
TW201516145A (zh) 2015-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI482857B (zh) 針對糖化血紅素及血紅素具有高專一性的適合體及其應用
Sinha et al. An integrated microfluidic platform to perform uninterrupted SELEX cycles to screen affinity reagents specific to cardiovascular biomarkers
Van Reenen et al. Integrated lab-on-chip biosensing systems based on magnetic particle actuation–a comprehensive review
Rusling Multiplexed electrochemical protein detection and translation to personalized cancer diagnostics
JP5925683B2 (ja) マルチサイト式バイオセンサーおよびそれに関する方法
Brody et al. High-content affinity-based proteomics: unlocking protein biomarker discovery
US10221412B2 (en) Multiplex microfluidic device for selecting nucleic acid aptamers, and high throughput selection method for nucleic acid aptamers using same
Araz et al. Microfluidic multiplexing in bioanalyses
Su et al. Microfluidic strategies for sample separation and rapid detection of food allergens
CN105378477A (zh) 用于进行多路测定法的改进方法
Ge et al. Aptamer/antibody sandwich method for digital detection of SARS-CoV2 nucleocapsid protein
Walt Protein measurements in microwells
Yin et al. Point-of-care testing for multiple cardiac markers based on a snail-shaped microfluidic chip
Wu et al. Single-molecule measurements in microwells for clinical applications
US20230021971A1 (en) Biologic Machines for the Detection of Biomolecules
Jia et al. Elimination terminal fixed region screening and high-throughput kinetic determination of aptamer for lipocalin-1 by surface plasmon resonance imaging
EP2588608B1 (en) Psa binding aptamer and method for diagnosis of prostate cancer
Ao et al. Target-triggered parallel rolling circle amplification circuits for chemiluminescent imaging assay of proteins
JP2015522823A (ja) 標的成分を持つ試料流体の処理
WO2007072444A2 (en) Biosensor device
Dominguez et al. Nanomaterial-based biosensors for food contaminant assessment
Liu et al. Fluorescence-encoded polystyrene microspheres for the application of suspension array technology
US20230264192A1 (en) Microfluidic electrochemical analyte detectors
Volpetti High-throughput microfluidic platforms applied to immunoassay-based diagnostics and environmental monitoring
Malik et al. Protein-Based Detection Methods for Genetically Modified Crops