CN113984863B

CN113984863B - 一种基于核酸适配体生物传感器的糖化血红蛋白检测方法

Info

Publication number: CN113984863B
Application number: CN202111262523.XA
Authority: CN
Inventors: 冯雪晴; 居漪; 贺晓鹏; 叶邦策; 赵敏; 豆伟涛; 欧元祝; 李卿; 金中淦
Original assignee: SHANGHAI CENTER FOR CLINICAL LABORATORY
Current assignee: SHANGHAI CENTER FOR CLINICAL LABORATORY
Priority date: 2021-10-28
Filing date: 2021-10-28
Publication date: 2024-03-15
Anticipated expiration: 2041-10-28
Also published as: CN113984863A

Abstract

本发明涉及一种基于核酸适配体生物传感器的糖化血红蛋白检测方法，通过将糖化血红蛋白HbA1c的核酸适配体与血红蛋白Hb的核酸适配体分别与电信号分子二茂铁链接，再通过巯基自组装固定在丝网印刷电极上得到核酸适配体生物传感器；当适配体识别相应的目标蛋白之后，电极表面猝灭二茂铁的电流信号，电信号发生变化，采用差分脉冲伏安法(DVP)和阻抗法测试电极信号变化程度，从而达到检测糖化血红蛋白浓度的目的。本发明与现有技术的糖化血红蛋白检测方法相比较，具有特异性强，灵敏度高，快速简便，检测成本低等优点。

Description

一种基于核酸适配体生物传感器的糖化血红蛋白检测方法

技术领域

本发明属于体外诊断技术领域，特别涉及一种基于核酸适配体生物传感器的糖化血红蛋白检测方法。

背景技术

目前，糖化血红蛋白(HbA1c)检测已被多个国家纳入为糖尿病常规检测项目，2010年美国糖尿病协会(ADA)、2011年世界卫生组织(WHO)将HbA1c的血液浓度超过6.5％作为诊断糖尿病的新标准，中华医学会糖尿病学分会(CDS)发布的《中国2型糖尿病防治指南(2020年版)》在有严格质量控制的实验室，采用标准化检测方法测定的糖化血红蛋白可以作为糖尿病的补充诊断标准，诊断标准为≥6.5％。糖化血红蛋白也是监测血糖中、长期控制情况的金标准，因此精准检测糖化血红蛋白，对糖尿病的筛查、早期诊断、治疗和监测并发症具有重要的临床价值。目前临床常规使用的糖化血红蛋白检测方法达30多种。根据国家卫健委临床检验中心和上海市临床检验中心室间质评结果来看，我国的糖化血红蛋白检测标准化程度逐步提高，但各地区差别和方法间差异仍较大，且目前临床实验室使用的糖化血红蛋白测定仪器主要为国外进口，价格昂贵检测成本较高。故需要一种准确快速，又经济实用的检测方法用于糖化血红蛋白的检测。

目前临床常规使用的糖化血红蛋白检测方法达30多种，主要为色谱法和免疫法，从方法学来看，基于色谱的方法，通过测量糖化血红蛋白(HbA1c)峰面积与血红蛋白(Hb)峰面积之比来确定，由于来自血液基质的各种干扰，使用这些方法可能得到假阳性或阴性结果。而糖化血红蛋白快速检测方法目前主要采用免疫法，使用针对糖化血红蛋白的特异性抗体来定量糖化血红蛋白。也有报道基于场效应晶体管的免疫法、使用硼酸修饰电极的电化学检测糖化血红蛋白，但是，硼酸盐修饰的电极易被血液中的白蛋白识别而引起干扰。另外有报道使用HbA1c抗体作为捕获探针和蛋白(聚糖)结合抗体作为捕获探针的夹心法检测，然而，由于血液样品中其他聚糖部分的干扰和高背景信号，这些方法灵敏度较低。在阵列免疫传感器的研究中，使用针对Hb的多克隆抗体作为共同的捕获探针，会结合所有形式的Hb，并且针对非糖化血红蛋白(HbA0)和HbA1c的特异性单克隆抗体用作检测探针，这种免疫传感器已经消除了聚糖结合分子的使用，因此较好的降低了背景干扰，实现了高灵敏度。然而，免疫测定易受自身抗体、嗜异性抗体等干扰，且抗体稳定性问题，批间差异，特别是POCT需要即时反应，这些因素导致精准性不好，限制了其应用。前面所述的检测方法虽然能够对糖化血红蛋白进行准确检测，但是设备昂贵，需要人员经过培训后才能操作，操作耗时，检测费用较高，无法现场、在线进行实时监测等不足。

近年来由于核酸适配体的发展及其相对于抗体的诸多优势，采用适配体为识别原件的生物传感器检测蛋白质得到了广泛的应用。核酸适配体是通过一种体外筛选技术—指数富集配体系统进化技术筛选出来的一种能与蛋白质和小分子物质特异性结合的单链DNA或RNA寡核苷酸片段，一般由25-80个碱基组成。适配体具有高特异性和亲和力，且目标分子范围广，不仅可与大分子(如核酸、蛋白质、多肽等)结合，也能与小分子(如氨基酸、金属离子等)结合。这就表明适配体为识别元件可明显地拓宽相关传感器的应用范围。适配体比抗体更容易修饰，而且可以在适配体的精确位点进行修饰，并且不影响其亲和力。适配体电化学生物传感器方法，其优势在于：(1)使用适配体可使生物传感器具有较长稳定性；(2)仅需使用几微升血液进行检测；(3)利用适配体和可抛式丝网印刷电极构建的电化学传感器使用便捷，小型化，成本较低，而核酸适配体电化学传感器方法检测成本较低、操作简单、灵敏度高、易于微型化，可对糖化血红蛋白现场、在线检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于核酸适配体生物传感器的糖化血红蛋白检测方法，该方法具有特异性强，灵敏度高，快速简便，检测成本低等优点。

本发明提供了一种基于核酸适配体生物传感器的糖化血红蛋白检测方法，包括：

(1)预先对丝网印刷电极进行预处理；

(2)分别合成糖化血红蛋白HbA1c的核酸适配体与血红蛋白Hb的核酸适配体；所述核酸适配体为单链DNA探针，在DNA核酸单链的3’端进行巯基-SH-修饰，5’端进行二茂铁基-Fc-修饰；

(3)将HbA1c核酸适配体和Hb核酸适配体稀释，然后加入二硫键还原剂，使溶液终浓度为3-5mmol/L用以还原二硫键，之后进行退火处理；取处理后的适配体溶液，滴至步骤(1)的丝网印刷电极上，室温组装，用缓冲溶液冲洗，晾干，得到HbA1c适配体生物传感器和Hb适配体生物传感器；

(4)采用步骤(3)得到的生物传感器对HbA1c和Hb标准溶液进行检测，建立标准曲线并得到拟合方程；对样品进行差分脉冲伏安法DPV分析，通过建立的标准曲线所得的拟合方程，分别计算出对应的HbA1c和Hb的浓度，通过计算HbA1c和Hb的浓度比值，并换算为糖化血红蛋白NGSP的单位，得到糖化血红蛋白的检测结果。

所述步骤(1)中的丝网印刷电极为三电极系统，以金电极为工作电极，以铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极。

所述步骤(1)中的丝网印刷电极预处理步骤如下：

将丝网印刷电极浸入0.05mol/L NaOH溶液中用循环伏安法扫描至稳定扫描范围：-0.3V-1.3V，扫描速度0.1V/s；然后分别在100％乙醇和超纯水中在超声波清洗机中各超声3min，将超声后的电极分别在0.5mmol/L H₂SO₄溶液、0.1mmol/L KCl，0.5mmol/LH₂SO₄溶液和0.05mmol/L H₂SO₄溶液中进行扫描，最后用超纯水冲洗，用N₂吹干，备用。

所述步骤(2)中的糖化血红蛋白核酸适配体和血红蛋白核酸适配体的序列为：

HbA1c适配体：

5′-GGGGACACAGCAACACACCCACCCACCAGCCCCAGCATCATGCCCATCCGTCGTGTGTG-3′；

Hb适配体：

5′-ACGCACACCAGAGACAAGTAGCCCCCCAAACGCGGCCACGGAACGCAGCACCTCCAT GGC-3′。

所述步骤(3)中的核酸适配体稀释溶剂为5mmol/L MgCl₂、10mmol/L Tris-HCl溶液。

所述步骤(3)中的二硫键还原剂为三(2-甲酰乙基)膦盐酸。

所述步骤(3)中的缓冲溶液为：1mmol/L MgCl₂、pH＝6.5，0.1mol/L PBS缓冲溶液。

有益效果

本发明针对HbA1c和Hb设计了特异性的核酸适配体，并在适配体的3’端进行修饰巯基3’-SH和5’端二茂铁修饰即5’-Fc，从而提高了检测的灵敏度和特异性，并采用丝网印刷金电极(Au)为工作电极，利用Au与巯基(SH)能以共价键相连Au-SH键的作用实现了对适配体的一步修饰，大大简化了适配体的修饰过程。与现有技术的糖化血红蛋白检测方法相比较，本发明具有特异性强，灵敏度高，快速简便，检测成本低等优点。

附图说明

图1为实施例2的HbA1c的标准曲线。

图2为实施例2的Hb的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

糖化血红蛋白和血红蛋白适配体生物传感器的制备

一、试剂与仪器

试剂：磷酸二氢钠一水合物(NaH₂P₃O₄·H₂O)，磷酸氢二钠(Na₂HP₃O₄·H₂O)，氯化镁(MgCl₂)，Tris碱，氯化钠(NaCl)，盐酸(HCl)、氢氧化钠(NaOH)、硫酸(H₂SO₄)、氯化钾(KCl)、乙醇(CH₃CH₂OH)、巯基乙醇(MEH)、铁氰化钾(K₃[Fe(CN)₆])、亚铁氰化钾三水合物(K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O)为Sigma-Aldrich公司产品。二硫键还原剂三(2-甲酰乙基)膦盐酸(TCEP)为Thermo Fisher公司产品。经巯基(SH)和二茂铁(Fc)双修饰的HbA1c适配体和Hb适配体由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，纯度>98％。HbA1c蛋白，Hb蛋白为Prospec公司产品。所有化学试剂均为分析纯。实验用水为超纯水(电阻率:18.2MΩ/cm)。

CHI660E电化学工作站(上海辰华仪器公司)，丝网印刷电极(下文简称电极)(Dropsense公司，电极型号：220AT)。丝网印刷电极为三电极系统：以金电极(Au，内径＝4mm)或修饰电极(适配体修饰的金电极)为工作电极，以铂丝电极为对电极，银/氯化银(Ag/AgCl)电极为参比电极。。

HbA1c核酸适配体和Hb核酸适配体序列为：

HbA1c适配体：

(Fc)5′-GGGGACACAGCAACACACCCACCCACCAGCCCCAGCATCATGCCCATCCGTCGTGTGTG-3′(SH)(SEQ ID NO 1)；

Hb适配体：

(Fc)5′-ACGCACACCAGAGACAAGTAGCCCCCCAAACGCGGCCACGGAACGCAGCACCTCCATGGC-3′(SH)(SEQ ID NO 2)。

该核酸适配体为单链DNA探针。在DNA核酸单链的3’端进行巯基-SH-修饰，5’端进行二茂铁基-Fc-修饰。

HbA1c和Hb核酸适配体组装液的配制：含5μmol/L适配体组装液的单链DNA适配体溶液，用5mmol/L MgCl₂，10mmol/L Tris-HCl溶液溶解配制。

二、HbA1c适配体生物传感器和Hb适配体生物传感器的构建

1.丝网印刷电极预处理

(1)电化学清洗：丝网印刷电极浸入0.05mol/L NaOH溶液中用循环伏安法(CV)扫描至稳定(清洗和活化电极表面)，丝网印刷电极以金电极为工作电极和辅助电极，银/氯化银为参比电极；设置参数：扫描范围：-0.3V-1.3V，扫描速度0.1V/s；(2)超声：然后分别在100％乙醇和超纯水中在超声波清洗机中各超声3min；(3)再次电化学清洗：将超声后的电极分别在0.5mmol/L H₂SO₄溶液、0.1mmol/L KCl，0.5mmol/LH₂SO₄溶液和0.05mmol/LH₂SO₄溶液中按照步骤(1)进行扫描，最后用超纯水冲洗，用N₂吹干，备用。

2.电极适配体修饰

采用5mmol/L MgCl₂，10mmol/L Tris-HCl溶液将HbA1c适配体和Hb适配体稀释至5μmol/L，然后加入TCEP，使溶液终浓度为3mmol/L用以还原二硫键，之后进行退火处理37℃放置20min。取3μL处理后的适配体溶液，滴至电极上，室温组装16h，之后用1mM MgCl₂，pH＝6.5，0.1mol/L PBS缓冲溶液冲洗三遍，晾干备用，得到HbA1c适配体生物传感器和Hb适配体生物传感器。

浓度5μmol/L的HbA1c和Hb核酸适配体溶液是3’端修饰了巯基即-3’-SH-，5’端进行二茂铁基-Fc-修饰的适配体探针溶液。

实施例2

核酸适配体传感器检测糖化血红蛋白方法的建立及样品检测

一、标准曲线的建立

分别取5个所制备的HbA1c适配体生物传感器和Hb适配体生物传感器，用2mmol/LMEH的1mM MgCl₂，pH＝6.5，0.1mol/LPBS缓冲液，室温封闭1h(防止氧气在金电极上吸附，对Fc检测造成干扰)之后，电极表面分别滴加浓度为2μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、12μg/mL、16μg/mL的HbA1c溶液及浓度为80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL、140μg/mL、160μg/mLHb溶液各3μL，室温反应1.5h，随后用1mmol/LMgCl₂，pH＝6.5，0.1mol/LPBS缓冲液洗去未特异性结合的蛋白，采用DPV在10mmol/LTris-HCl溶液中进行测试。分别记录HbA1c适配体生物传感器和Hb适配体生物传感器在各个浓度下对应的DPV图及其峰电流值Ipn，其中n＝1,2...5，计算各浓度相对初始的适配体传感器的峰电流变化值△Ip，并以△Ip为横坐标，对应的各HbA1c和Hb浓度为纵坐标作图，如图1和图2所示，建立HbA1c和Hb的标准曲线并得到拟合方程，具体见表1。

表1 HbA1c和Hb标准曲线的建立

二、样品检测

按照临床检测要求，分别配制3个不同浓度HbA1c和Hb含量的样品，对样品进行DPV分析，通过表1中的拟合方程计算出对应的HbA1c和Hb的浓度，通过计算HbA1c和Hb的浓度比值并换算为临床报告的单位，即美国国家糖化血红蛋白标准化计划(NGSP)的单位(％)，得到糖化血红蛋白的检测结果。具体结果见表2。

表2不同浓度HbA1c和Hb含量样品的糖化血红蛋白检测结果

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市临床检验中心

<120> 一种基于核酸适配体生物传感器的糖化血红蛋白检测方法

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggggacacag caacacaccc acccaccagc cccagcatca tgcccatccg tcgtgtgtg 59

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acgcacacca gagacaagta gccccccaaa cgcggccacg gaacgcagca cctccatggc 60

Claims

1.一种基于核酸适配体生物传感器的糖化血红蛋白检测方法，包括：

（1）预先对丝网印刷电极进行预处理；

（2）分别合成糖化血红蛋白HbA1c的核酸适配体与血红蛋白Hb的核酸适配体；所述核酸适配体为单链DNA探针，在DNA核酸单链的3’端进行巯基-SH-修饰，5’端进行二茂铁基-Fc-修饰；所述核酸适配体的序列为：

HbA1c适配体的序列为：

5′-GGGGACACAGCAACACACCCACCCACCAGCCCCAGCATCATGCCCATCCGTCGT GTGTG-3′；

Hb 适配体的序列为：

5′-ACGCACACCAGAGACAAGTAGCCCCCCAAACGCGGCCACGGAACGCAGCACCTCCAT GGC-3′；

（3）将HbA1c核酸适配体和Hb核酸适配体稀释，然后加入二硫键还原剂，使溶液终浓度为3-5mmol/L用以还原二硫键，之后进行退火处理；取处理后的适配体溶液，滴至步骤（1）的丝网印刷电极上，室温组装，用缓冲溶液冲洗，晾干，得到HbA1c适配体生物传感器和Hb适配体生物传感器；

（4）采用步骤（3）得到的生物传感器对HbA1c和Hb标准溶液进行检测，建立标准曲线并得到拟合方程；对样品进行差分脉冲伏安法DPV分析，通过建立的标准曲线所得的拟合方程，分别计算出对应的HbA1c和Hb的浓度，通过计算HbA1c和Hb的浓度比值，并换算为糖化血红蛋白 NGSP的单位，得到糖化血红蛋白的检测结果。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的丝网印刷电极为三电极系统，以金电极为工作电极，以铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的丝网印刷电极预处理步骤如下：

将丝网印刷电极浸入0.05mol/L NaOH溶液中用循环伏安法扫描至稳定扫描范围：-0.3V-1.3V，扫描速度0.1V/s；然后分别在100%乙醇和超纯水中在超声波清洗机中各超声3min，将超声后的电极分别在0.5mmol/L H₂SO₄溶液、0.1mmol/L KCl，0.5mmol/LH₂SO₄溶液和0.05mmol/L H₂SO₄溶液中进行扫描，最后用超纯水冲洗，用N₂吹干，备用。

4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的核酸适配体稀释溶剂为5mmol/L MgCl₂、10mmol/L Tris-HCl溶液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的二硫键还原剂为三（2-甲酰乙基）膦盐酸。

6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的缓冲溶液为：1mmol/LMgCl₂、pH=6.5，0.1mol/L PBS缓冲溶液。