CN105301261A - 一种检测糖化血红蛋白的试剂盒及其制备方法和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及糖化血红蛋白检测技术领域,具体为一种检测糖化血红蛋白的试剂盒及其制备方法和使用方法。本发明根据糖化血红蛋白结合染料硼酸结合物后在固定波长下的反射率与总的血红蛋白的反射率的比值,计算血液中糖化血红蛋白的含量,利用其高灵敏度、高特异性的特点,设计新的原料、试剂和工艺流程。本发明提供的试剂盒具有灵敏度高和特异性好及检测方法简单快捷的特点,五分钟即可完成测量报告,大大缩短了操作时间,提高了检测效率,并且性价比高,适用于临床快速检测,可广泛应用于各级医疗检验机构,尤其基层医疗机构包括乡镇卫生院均可开展。
Description
技术领域
本发明涉及糖化血红蛋白检测技术领域,尤其涉及一种检测糖化血红蛋白的试剂盒及其制备方法和使用方法。
背景技术
糖化血红蛋白(HbA1C)是血液中红细胞内血红蛋白与血糖结合的产物。血糖通过弥散方式进入细胞内,无需胰岛素参与。血糖与血红蛋白的结合过程缓慢且不可逆,在红细胞死亡前一直存在,故体内衰老红细胞比新生红细胞的糖化血红蛋白含量高出1.5倍。血红蛋白的平均寿命长达120天,且HbA1C的生成速度与过去2-3个月内血糖浓度水平成正比,毫无疑问,HbA1C水平能够更准确地反映过去2-3个月中人体内的血糖情况。糖化血红蛋白越高表示血糖与血红蛋白结合越多,糖尿病病情也越严重。检测HbA1C水平可避免每日的血糖值波动的影响,与抽血时间,是否空腹,是否使用胰岛素等因素无关。当糖尿病控制较好时HbA1C浓度在一定值范围内,糖尿病控制不住时HbA1C浓度则可高至正常值的2倍以上,因此检测HbA1C水平成为糖尿病治疗过程中疗效监测的重要手段。HbA1C检测用于常规实验室始于20世纪70年代末,且稳定发展至今,糖化血红蛋白浓度已成为了解糖尿病控制良好与否的重要指标。国外已将糖化血红蛋白浓度监测作为糖尿病疗效判定和调整治疗方案的“金标准”。
目前,临床常用的测定HbA1C的方法主要有酶联免疫法、胶乳免疫凝集法和离子树脂微柱层析法等。酶联免疫法是使用酶联免疫测定技术测定HbA1C,使用酶标仪、洗板机等,该方法操作繁琐,耗时长,受影响因素较多。胶乳免疫凝集法是利用抗原抗体反应形成复合物的自然凝集效果,以胶乳放大凝集信号,测定反应液浊度,一般使用全自动生化分析仪,目前应用比较广泛,但其受到方法及使用仪器限制,标本需集中测定。离子树脂微柱层析法是利用离子树脂的特异性吸附作用,将样本流过离子树脂层析柱,从而将HbA1C从样本中分离出来,再与总血红蛋白比较测定其含量,特异性高、精密度高、重复性好,在临床上有广泛应用,但是操作繁琐,耗时很长,受环境温度、挥发性酸碱物质影响大,如果不是熟练人员则人为误差也很大;另外,有改进自然层析为负压引流或者正压挤出的方法,这种改进方法仅是缩短了一定的操作时间,但同时带来了液体因流速过快跟树脂接触时间短而吸附不完全的弊端。
发明内容
本发明针对现有的糖化血红蛋白检测方法操作繁琐,耗时很长,人为误差大等问题,提供一种灵敏度高,特异性强,检测方便快捷的用于检测糖化血红蛋白的试剂盒,以及该试剂盒的制备方法和使用方法。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案。
一种检测糖化血红蛋白的试剂盒,包括反应液、洗涤液和反应板,所述反应板上设有滤膜;
每10mL所述反应液由以下各组分组成:12.0-16.5mg氯化锌,116.5-127.5mg氯化钠,30.0-31.0mg六水氯化镁,238.0-339.0mgHEPES,18.5-29.5mg甘氨酸,39-41mg氢氧化钠,0.1mL浓度为15%的TritonX-100,0.05mL浓度为15%的叠氮化钠,余量为水;所述反应液的pH为7.9-8.3;
每5mL所述洗涤液由以下各组分组成:0.09-0.15mL的甲酰胺,0.54mL浓度为3.15g/L的XC-DAPOL-CPBA溶液,余量为水。
优选的,每10mL所述反应液由以下各组分组成:14.4mg氯化锌,118.9mg氯化钠,30.5mg六水氯化镁,298.3mgHEPES,28.8mg甘氨酸,40mg氢氧化钠,0.1mL浓度为15%的TritonX-100,0.05mL浓度为15%的叠氮化钠,余量为水;所述反应液的pH为8.1。
优选的,每5mL所述洗涤液由以下各组分组成:0.12mL的甲酰胺,0.54mL浓度为3.15g/L的XC-DAPOL-CPBA溶液,余量为水。
以上所述反应液和洗涤液在2-8℃下保存。
以上所述检测糖化血红蛋白的试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
S11制备反应液:将氯化锌溶于水中,得第一溶液;将氯化钠、六水氯化镁、叠氮化钠和TritonX-100溶于水中,得第二溶液;将第一溶液与第二溶液混合均匀,得第三溶液;
将氢氧化钠溶于水中,得第四溶液;将HEPES和甘氨酸溶于第四溶液中,得第五溶液;
将第五溶液与第三溶液混合均匀,得混合液,向混合液中加入水至混合液的体积为10mL,然后将混合液的pH调至7.9-8.3,制得反应液;备用。
优选的,将氯化锌溶于2.5mL的水中,得第一溶液;将氯化钠、六水氯化镁、叠氮化钠和TritonX-100溶于2.5mL的水中,得第二溶液;将氢氧化钠溶于1.5mL的水中,得第四溶液。
S12制备洗涤液:将甲酰胺与XC-DAPOL-CPBA的甲酰胺溶液混合均匀,然后向混合液中加入水至混合液的体积为5mL,制得洗涤液;备用。
S13组合:所述的反应液、洗涤液与设有滤膜的反应板组成试剂盒。
以上所述检测糖化血红蛋白的试剂盒的使用方法,包括以下步骤:
S21反应:向反应液中加入5μL全血,充分震荡,然后静置2-3min使全血与反应液反应完全,得混悬液;震荡混悬液使混悬液均匀。
优选的,向25μL反应液中加入5μL全血。
S22沉淀和洗涤:将混悬液滴加到反应板上,静置10s以上使混悬液充分浸入滤膜内;然后向反应板中滴加洗涤液,静置10s以上使洗涤液充分浸入滤膜内。
优选的,将25μL混悬液滴加到反应板上;向反应板中滴加25μL洗涤液。
S23检测:在5min内用糖化血红蛋白检测仪检测与硼酸结合物结合的蓝色的糖化血红蛋白在波长为620nm的光下的反射率R1与红色的总体血红蛋白在波长为470nm的光下的反射率R2,计算R1与R2的比值即为检测样品中HbA1C的浓度。
本发明试剂盒的原理为:反应液中含有可裂解红细胞并使血红蛋白沉淀的物质及可与糖化血红蛋白的顺式-二醇基结合的蓝色硼酸结合物,当血液滴入反应液中时,红细胞立即被裂解,所有的血红蛋白沉淀,硼酸结合物则与糖化血红蛋白的顺式-二醇基结合。将适量的反应混合物置于反应板上,所有已沉淀的血红蛋白无论其是否被硼酸结合物所结合,都将残留在滤膜之上,然后用洗涤液洗去多余的染色缀合物。最后使用血红蛋白检测仪对蓝色(糖化血红蛋白)与红色(总体血红蛋白)分别在波长是620nm和470nm的光下的反射率进行分析,计算二者的比值,比值即为样品中HbA1C的浓度。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明根据糖化血红蛋白结合染料硼酸结合物后在固定波长下的反射率与总的血红蛋白的反射率的比值,计算血液中糖化血红蛋白的含量,利用其高灵敏度、高特异性的特点,设计新的原料、试剂和工艺流程。本发明提供的试剂盒具有灵敏度高和特异性好及检测方法简单快捷的特点,五分钟即可完成测量报告,大大缩短了操作时间,提高了检测效率,并且性价比高,适用于临床快速检测,可广泛应用于各级医疗检验机构,尤其基层医疗机构包括乡镇卫生院均可开展。
附图说明
图1为分别使用实施例中所述试剂盒和美国Bio-Rad公司生产的糖化血红蛋白检测试剂盒检测相同样本的检测结果对比图。
具体实施方式
为了更充分理解本发明的技术内容,下面结合具体实验对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。下述实验中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例
本实施例提供一种检测糖化血红蛋白的试剂盒,以及该试剂盒的制备方法和使用方法。该试剂盒由反应液、洗涤液和反应板组成,所述反应板上设有滤膜,用于沉淀血红蛋白。
所述反应液的体积为10mL,反应液由以下各组分组成:14.4mg氯化锌,118.9mg氯化钠,30.5mg六水氯化镁,298.3mgHEPES,28.8mg甘氨酸,40mg氢氧化钠,0.1mL浓度为15%的TritonX-100,0.05mL浓度为15%的叠氮化钠,余量为水;反应液的pH为8.1。反应液在2-8℃下保存,备用。
所述洗涤液的体积为5mL,洗涤液由以下各组分组成:0.12mL的甲酰胺,0.54mL浓度为3.15g/L的XC-DAPOL-CPBA甲酰胺溶液,余量为水。洗涤液在2-8℃下保存,备用。
本实施例的试剂盒的制备方法如下:
(11)制备反应液
将氯化锌溶于2.5mL的水中,得第一溶液;将氯化钠、六水氯化镁、叠氮化钠和TritonX-100溶于2.5mL的水中,得第二溶液;将第一溶液与第二溶液混合均匀,得第三溶液。
将0.2mL5M的氢氧化钠溶于1.5mL的水中,得第四溶液;将HEPES和甘氨酸溶于第四溶液中,得第五溶液。
将第五溶液与第三溶液混合均匀,得混合液,向混合液中加入水至混合液的体积为10mL,然后将混合液的pH调至8.1,制得反应液。
反应液在2-8℃下保存,备用。
(12)制备洗涤液
将甲酰胺与XC-DAPOL-CPBA的甲酰胺溶液混合均匀,然后向混合液中加入水至混合液的体积为5mL,制得洗涤液。
洗涤液在2-8℃下保存,备用。
(13)组合
上述的反应液、洗涤液与设有滤膜的反应板组成试剂盒。
本实施例的试剂盒的使用方法如下:
(21)反应
向25μL反应液中加入5μL全血,充分震荡,然后静置2-3min使全血与反应液反应完全,得混悬液;震荡混悬液使混悬液均匀。
(22)沉淀和洗涤
将25μL混悬液滴加到反应板上,静置10s使混悬液充分浸入滤膜内;然后向反应板中滴加25μL洗涤液,静置10s以上使洗涤液充分浸入滤膜内。
(23)检测
在5min内用糖化血红蛋白检测仪检测与硼酸结合物结合的蓝色的糖化血红蛋白在波长为620nm的光下的反射率R1与红色的总体血红蛋白在波长为470nm的光下的反射率R2,计算R1与R2的比值即为检测样品中HbA1C的浓度。
在其它实施方案中,每10mL所述的反应液还可以由以下量的各组分组成:12.0-16.5mg氯化锌,116.5-127.5mg氯化钠,30.0-31.0mg六水氯化镁,238.0-339.0mgHEPES,18.5-29.5mg甘氨酸,39-41mg氢氧化钠,0.1mL浓度为15%的TritonX-100,0.05mL浓度为15%的叠氮化钠,余量为水。反应液的pH还可以在7.9-8.3的范围内。每5mL所述的洗涤液还可以由以下量的各组分组成:0.09-0.15mL的甲酰胺,0.54mL浓度为3.15g/L的XC-DAPOL-CPBA溶液,余量为水。
实验1分析灵敏度实验
试验方法:用上述实施例中所述的糖化血红蛋白检测试剂盒(微粒色谱法)分别对糖化血红蛋白含量为0,3%,6%,9%,12%,15%,18%,20%的样本进行检测,根据检测结果来分析试剂盒的灵敏度。
步骤:按照上述实施例中所述的试剂盒的实验操作流程进行试验。
(1)糖化血红蛋白样本梯度液的配制:取浓度为20%,18%,3%的质控品,浓度为18%和3%的质控品按一定比例(0:0,0:10,2:8,4:6,6:4,8:2及10:0)配制为7个浓度(0,3%,6%,9%,12%,15%,18%)。
(2)取8支分别装有25ul反应液的反应管,打开反应管瓶盖。
(3)在8支反应管内分别对应加入5uL浓度为0,3%,6%,9%,12%,15%,18%,20%的样本原液,充分震荡,静置2-3分钟,待其反应完全,得到混悬液。
(4)再次震荡,使混悬液均匀,将25ul混悬液加入反应板上。静置10秒钟,保证混悬液充分侵入滤膜内。
(5)向反应板中加入25ul洗涤液,静置10s以上使洗涤液充分浸入滤膜内。
(6)使用糖化血红蛋白检测仪,在5分钟内读取检测结果。
用三个批次的试剂盒检测,每批次试剂盒以相同的样本重复检测三次,结果记录如下表1-3所示。(下表1-3中的“N”表示“机器无法识别”。)
表1第一批次试剂盒的检测结果
表2第二批次试剂盒的检测结果
表3第三批次试剂盒的检测结果
结论:试剂盒无法判别浓度为0和20%的糖化血红蛋白样本。用试剂盒检测浓度在3%-18%范围内的糖化血红蛋白样本,检测结果具有统计学意义,试剂盒的浓度检测区间是3%-18%,证明本试剂盒的灵敏度高。
实验2分析特异性实验
试验方法:根据上述实施例所述的糖化血红蛋白检测试剂盒(微粒色谱法)对常见干扰因素(果糖胺、葡萄糖、胆红素F)的检测结果来分析试剂盒的特异性。在反应管内各添加30mg/dL的果糖胺、葡萄糖、胆红素F,HbA1c终浓度为6%、9%,12%。按照上述实施例中所述的试剂盒的实验操作流程进行试验。用三个批次的试剂盒检测,每批次试剂盒以相同的样本重复检测三次,结果记录如下表4-6所示。
表4第一批次试剂盒的检测结果
表5第二批次试剂盒的检测结果
表6第三批次试剂盒的检测结果
结论:由表4-6的试验记录,统计分析知,果糖胺、葡萄糖、胆红素F对检测结果无影响,证明本试剂盒的特异性较好。
实验3等效性实验(与金标准高效液相色谱法进行方法学比对检测)
为评估上述实施例所述的糖化血红蛋白检测试剂盒(微粒色谱法)的测定准确性,与目前糖化血红蛋白诊断采用的金标准高效液相色谱法进行方法学比对试验。
随机选取检验科正常人和糖尿病人的共300人血液,每人取二份标本,立即送检。
实验步骤:
(1)糖化血红蛋白检测试剂盒检测:按照上述实施例中所述的试剂盒的实验操作流程进行试验。
(2)高效液相色谱法:采用美国Bio-Rad公司生产的糖化血红蛋白检测试剂盒(高效液相色谱法),按照其说明书操作流程进行试验。
统计学方法:对300人的血液样本检测结果进行相关性分析,并求其相关系数。其相关性分析结果如图1所示。
结论:数据进行相关性分析,二者检测结果高度相关,其相关系数是0.999,表明上述实施例中所述的试剂盒检测结果和金标准检测结果等效。但高效液相色谱法检测成本高,稳定性差,而应用上述实施例中所述的试剂盒定量检测HbA1c,成本低廉,操作简单,快速、灵敏。
以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容,以便于读者更容易理解,但不代表本发明的实施方式仅限于此,任何依本发明所做的技术延伸或再创造,均受本发明的保护。
Claims (10)
1.一种检测糖化血红蛋白的试剂盒,包括反应液、洗涤液和反应板,其特征在于,
每10mL所述反应液由以下各组分组成:12.0-16.5mg氯化锌,116.5-127.5mg氯化钠,30.0-31.0mg六水氯化镁,238.0-339.0mgHEPES,18.5-29.5mg甘氨酸,39-41mg氢氧化钠,0.1mL浓度为15%的TritonX-100,0.05mL浓度为15%的叠氮化钠,余量为水;所述反应液的pH为7.9-8.3;
每5mL所述洗涤液由以下各组分组成:0.09-0.15mL的甲酰胺,0.54mL浓度为3.15g/L的XC-DAPOL-CPBA溶液,余量为水;
所述反应板上设有滤膜。
2.根据权利要求1所述一种检测糖化血红蛋白的试剂盒,其特征在于,每10mL所述反应液由以下各组分组成:14.4mg氯化锌,118.9mg氯化钠,30.5mg六水氯化镁,298.3mgHEPES,28.8mg甘氨酸,40mg氢氧化钠,0.1mL浓度为15%的TritonX-100,0.05mL浓度为15%的叠氮化钠,余量为水;所述反应液的pH为8.1。
3.根据权利要求1所述一种检测糖化血红蛋白的试剂盒,其特征在于,每5mL所述洗涤液由以下各组分组成:0.12mL的甲酰胺,0.54mL浓度为3.15g/L的XC-DAPOL-CPBA溶液,余量为水。
4.根据权利要求1-3任一项所述一种检测糖化血红蛋白的试剂盒,其特征在于,所述反应液和洗涤液在2-8℃下保存。
5.一种如权利要求1所述检测糖化血红蛋白的试剂盒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S11制备反应液:将氯化锌溶于水中,得第一溶液;将氯化钠、六水氯化镁、叠氮化钠和TritonX-100溶于水中,得第二溶液;将第一溶液与第二溶液混合均匀,得第三溶液;
将氢氧化钠溶于水中,得第四溶液;将HEPES和甘氨酸溶于第四溶液中,得第五溶液;
将第五溶液与第三溶液混合均匀,得混合液,向混合液中加入水至混合液的体积为10mL,然后将混合液的pH调至7.9-8.3,制得反应液;备用;
S12制备洗涤液:将甲酰胺与XC-DAPOL-CPBA的甲酰胺溶液混合均匀,然后向混合液中加入水至混合液的体积为5mL,制得洗涤液;备用;
S13组合:所述的反应液、洗涤液与设有滤膜的反应板组成试剂盒。
6.根据权利要求5所述一种检测糖化血红蛋白的试剂盒的制备方法,其特征在于,所述步骤S11中,将氯化锌溶于2.5mL的水中,得第一溶液;将氯化钠、六水氯化镁、叠氮化钠和TritonX-100溶于2.5mL的水中,得第二溶液;将氢氧化钠溶于1.5mL的水中,得第四溶液。
7.一种如权利要求1所述检测糖化血红蛋白的试剂盒的使用方法,其特征在于,包括以下步骤:
S21反应:向反应液中加入5μL全血,充分震荡,然后静置2-3min使全血与反应液反应完全,得混悬液;震荡混悬液使混悬液均匀;
S22沉淀和洗涤:将混悬液滴加到反应板上,静置10s以上使混悬液充分浸入滤膜内;然后向反应板中滴加洗涤液,静置10s以上使洗涤液充分浸入滤膜内;
S23检测:用糖化血红蛋白检测仪对蓝色的糖化血红蛋白与红色的总体血红蛋白的光的反射率进行分析,计算二者的比值,比值即为检测样品中HbA1C的浓度。
8.根据权利要求7所述一种检测糖化血红蛋白的试剂盒的使用方法,其特征在于,步骤S21中,向25μL反应液中加入5μL全血。
9.根据权利要求8所述一种检测糖化血红蛋白的试剂盒的使用方法,步骤S22中,将25μL混悬液滴加到反应板上。
10.根据权利要求9所述一种检测糖化血红蛋白的试剂盒的使用方法,步骤S22中,向反应板中滴加25μL洗涤液。
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