CN109142483A - 一种用于检测无机三价砷的电化学生物传感器及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测无机三价砷的电化学生物传感器及检测方法，生物传感器包括测定电极，测定电极的表面经核酸适配体修饰，核酸适配体的序列为5'‑SH‑ACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTC‑Fc‑3'；检测方法包括以下步骤：1)采用电化学分析方法，绘制标准曲线；2)对待测溶液进行测定，比照标准曲线即可测得待测溶液中的无机三价砷浓度。与现有技术相比，本发明对测定电极表面进行DNA核酸适配体修饰，利用电化学工作站构建As(Ⅲ)的检测体系，并基于电化学信号的变化，通过确定峰电流实现As(Ⅲ)的定量检测，操作简单、成本低廉、抗干扰能力强、检测灵敏度高、特异性强，可以实现对As(Ⅲ)的高效检测。

Description

一种用于检测无机三价砷的电化学生物传感器及检测方法
技术领域
本发明属于元素检测技术领域，涉及一种用于检测无机三价砷的电化学生物传感器及检测方法。
背景技术
如今，工业化进程日益加快，由此造成的一系列的重金属污染日趋严重，尤其是在水体中，中国约有90％的地下水遭受不同程度的污染，其中60％污染严重，而无机三价砷则是严重污染水资源的一种物质，并且受砷污染的水体常被用于灌溉农作物，导致土壤和农作物受到砷污染，因而对环境与人类健康有着严重的威胁。原子态砷基本无毒，但其氧化物及砷酸盐毒性较大，且三价砷的毒性比五价砷强。砷化合物可经呼吸道、皮肤和消化道吸收，在体内大量蓄积，对呼吸、消化、造血、神经和生殖系统造成不同程度的损伤，常有发生急、慢性砷中毒的可能。砷急性中毒的表现症状为恶心、呕吐、口中金属味、腹剧痛、米汤样粪便等，较重者尿量减少、头晕、腓肠肌痉挛、发绀以至休克，严重者出现中枢神经麻痹症状、四肢疼痛性痉挛、意识消失等。因此，对于砷离子的快速与准确检测是避免此类危害的有效手段之一。
传统的检测方法如原子吸收分光光度法、原子荧光光谱法、等离子体光谱分析法、X-射线光谱法等，虽然其操作成熟，灵敏度较高，但是样品前处理通常比较复杂，往往需要浓缩、萃取和抑制其他离子干扰。此外，所用的仪器设备体积大且昂贵，需要专业的人员来操作，操作时间也较长，还有些重金属离子在检测中会受其它金属离子的干扰而无法测定。
与传统的检测方法相比，电化学分析法具有选择性好、操作简便、测量范围宽等优点，在重金属的存在下，电流、电化学阻抗和电容能发生改变，这些参数变化均可实现对重金属的检测。电化学测量系统一般包括三个方面：工作电极、参比电极和对电极。由于固体电极的表面积小，且对金属离子的吸附能力有限，并且电极表面易吸附杂质、受到污染，因此电极需要被修饰，被修饰后的电极提高了电化学性能，增加了用于电化学信号转移的有效电极表面，具有高灵敏度和良好的特异性。
核酸适配体是一类新的具有高选择性的功能识别分子，它通常是一段经过体外筛选技术——指数富集配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment，SELEX)得到的寡核苷酸单链DNA或RNA片段。核酸适配体的人工合成工艺成熟、制备快速、经济成本低、通用性强，能与生物小分子、蛋白质、多肽、有机物及金属离子等多种靶标分子进行特异性结合。目前，研究者已经对Hg2+、AsO2 -、Pb2+等重金属筛选出了相关适配体。基于核酸适配体的检测技术也已经成功的应用于很多物质的定性分析与定量检测中，但是检测砷离子的运用还比较少。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种用于检测无机三价砷的电化学生物传感器及检测方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种用于检测无机三价砷的电化学生物传感器，该生物传感器包括测定电极，所述的测定电极的表面经核酸适配体修饰，所述的核酸适配体的序列为5'-SH-ACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTC-Fc-3'。
进一步地，所述的测定电极为金电极。
进一步地，所述的测定电极的修饰方法包括以下步骤：
1)对预处理后的测定电极进行活化；
2)将活化后的测定电极浸入至含有核酸适配体的缓冲溶液中反应18-30h，之后对测定电极进行洗涤、干燥；
3)将测定电极浸入至封闭液中，后经洗涤、干燥，即完成对测定电极的修饰。修饰后的测定电极保存在4℃冰箱中，其活性能维持一周以上。
进一步地，步骤1)中，所述的预处理过程为：将测定电极用Al2O3粉抛光后，进行超声清洗，之后将测定电极浸入至H2SO4与H2O2的混合溶液中5-15min，再进行洗涤、干燥。
作为优选的技术方案，依次用粒径为0.3μm、0.05μm的Al2O3粉对测定电极进行抛光，抛光时间为5min。超声清洗过程为：先用无水乙醇清洗，再用超纯水超声清洗5min。H2SO4与H2O2的混合溶液中，H2O2为30wt％H2O2，H2SO4与H2O2的体积比为3:1。干燥采用氮气流下吹干。
进一步地，步骤1)中，所述的活化过程为：采用循环伏安法，用H2SO4对测定电极进行活化，电位设置为-0.2-1.6V，速率为0.05V/S。
作为优选的技术方案，活化中所用的H2SO4的摩尔浓度为0.5mol/L。活化直到得到稳定的循环伏安图为止。
进一步地，步骤2)中，所述的缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液，该缓冲溶液的pH值为7-8。缓冲溶液中，核酸适配体的摩尔浓度为10μmol/L。该反应过程中，测定电极表面形成硫醇化寡核苷酸的自组装单层(SAM)，之后用HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲溶液彻底清洗电极，并在氮气流下吹干。
进一步地，步骤3)中，所述的封闭液为MCH水溶液。MCH水溶液的摩尔浓度为1mmol/L，利用封闭液除去非特异性吸附位点，之后用HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲溶液彻底清洗电极，并在氮气流下吹干。
Tris为三羟甲基氨基甲烷，MCH为6-巯基己醇。
进一步地，该生物传感器包括工作电极、对电极及参比电极，所述的工作电极为测定电极，所述的对电极为铂电极，所述的参比电极为Ag/AgCl电极。
一种基于生物传感器的无机三价砷检测方法，该方法包括以下步骤：
1)采用电化学分析方法，绘制标准曲线；
2)对待测溶液进行测定，比照标准曲线即可测得待测溶液中的无机三价砷浓度。
无机三价砷检测方法具体为：
1)采用电化学分析方法，将生物传感器浸入至一系列不同浓度的亚砷酸盐标准溶液中，测定不同浓度亚砷酸盐标准溶液的峰电流变化值，并绘制标准曲线；
2)将生物传感器浸入至待测溶液中，并测定待测溶液的峰电流变化值，比照标准曲线即可测得待测溶液中的无机三价砷浓度。
进一步地，所述的电化学分析方法包括循环伏安法、电化学阻抗法或差示脉冲伏安法中的一种。为了检测亚砷酸盐或其他金属离子，将生物传感器浸入至一系列不同浓度的亚砷酸盐标准溶液中反应1h，在室温下用电化学工作站进行电化学分析测量，包括循环伏安法(CV)、电化学阻抗法(EIS)或差示脉冲伏安法(DPV)。
本发明以电化学工作站为检测系统，以金电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极。首先将5’端标有-SH、3’端标记二茂铁(Fc)的核酸适配体通过Au-S键固定在金电极上，此时的二茂铁远离电极表面，因此氧化还原电流比较弱。在MCH阻断非特异性吸附位点后，此DNA能特异性结合亚砷酸盐。当亚砷酸盐的存在时，亚砷酸盐介导DNA发生折叠使得二茂铁被拉近靠近电极表面，得到强氧化还原电流。基于存在亚砷酸盐和不存在亚砷酸盐氧化还原电流的变化，可利用该传感器灵敏地检测亚砷酸盐。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
1)本发明对测定电极表面进行DNA核酸适配体修饰，利用电化学工作站构建As(Ⅲ)的检测体系，并基于电化学信号的变化，通过确定峰电流实现As(Ⅲ)的定量检测，操作简单、成本低廉、抗干扰能力强、检测灵敏度高、特异性强，可以实现对As(Ⅲ)的高效检测；
2)本发明中生物传感器能够用来测定水体中的三价砷离子，测定的浓度范围为0-80nmol/L，最低检测限为8pmol/L。
附图说明
图1为实施例1中生物传感器进行无机三价砷检测的原理示意图；
图2为实施例1中不同浓度的As(Ⅲ)引起的电流变化标准曲线图；
图3为实施例1中生物传感器对不同元素进行选择性测定的结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
生物传感器及用该生物传感器进行无机三价砷检测的方法如图1所示，具体如下：
1)测定电极的制备：将裸金电极分别用粒径为0.3μm、0.05μm的Al2O3粉抛光5min，再依次用无水乙醇和超纯水超声清洗五分钟，浸泡在piranha(浓H2SO4与30wt％H2O2按照3:1(V/V)的比例混合均匀)溶液中10min，再次用超纯水清洗五分钟，并在氮气流下吹干。最后用0.5M H2SO4对金电极进行活化，采用循环伏安法，电位设置为-0.2～1.6V，速率0.05V/S，直到得到稳定的循环伏安图为止。
2)测定电极的修饰：将10μL 100μM DNA放入PCR仪中进行95℃退火3min，骤降至25℃，接着加入TCEP将硫醇化DNA的二硫键打开，最后将DNA稀释至10μM备用。将清洗干净的金电极浸入10μL 10μM DNA溶液中室温下反应24h，反应后用缓冲液HEPES冲洗，氮气吹干，接着将修饰了DNA的金电极浸入1mM MCH中反应1h除去非特异性吸附位点，反应后用缓冲HEPES冲洗，氮气吹干。
3)取步骤2)修饰好的金电极置于电化学工作站中，在铁氰化钾溶液中利用DPV检测其峰电流值，记做I0。
4)将步骤3)中的金电极浸入20μL已知浓度的As(Ⅲ)标准溶液，反应30min，经缓冲液HEPES冲洗、氮气吹干，利用DPV检测其峰电流值，记做I1。
5)按步骤3)和步骤4)，获得不同浓度的As(Ⅲ)溶液对应的电流变化ΔI，计算ΔI＝I1-I0，并以不同浓度的亚砷酸根离子与对应的频率变化作图，绘制标准曲线，其回归方程为：
ΔI＝-15.85493×e(-x/0.0017)-10.84401×e(-x/0.0409)-56.65216×e(-x/28.7799)+83.35112，R2＝0.99928。其中：ΔI为电流变化，单位为μA，As(Ⅲ)浓度单位为nM。得到的趋势曲线如图2所示。
如图3所示，为检测该生物传感器对As(Ⅲ)检测的特异性，分别制备浓度为500nM的As(V)、镉、汞、钙、钾、铅的离子溶液，利用该生物传感器的测试方法检测其电流变化，并与浓度为50nM的As(Ⅲ)溶液进行比较。结果表明，浓度为500nM的As(V)、镉、汞、钙、钾、铅离子对测定体系的频率变化都明显小于50nM的As(Ⅲ)溶液对测定体系的电流变化，表明本生物传感器对As(Ⅲ)具有特异性。
实施例2：
一种用于检测无机三价砷的电化学生物传感器，该生物传感器包括工作电极、对电极及参比电极，工作电极为测定电极，对电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl电极。测定电极为金电极，测定电极的表面经核酸适配体修饰，核酸适配体的序列为5'-SH-ACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTC-Fc-3'。
测定电极的修饰方法包括以下步骤：
1)将测定电极用Al2O3粉抛光后，进行超声清洗，之后将测定电极浸入至H2SO4与H2O2的混合溶液中5min，再进行洗涤、干燥，进行预处理；之后采用循环伏安法，用H2SO4对测定电极进行活化，电位设置为-0.2-1.6V，速率为0.05V/S；
2)将活化后的测定电极浸入至含有核酸适配体的Tris-HCl缓冲溶液中(pH值为8)反应18h，之后对测定电极进行洗涤、干燥；
3)将测定电极浸入至MCH水溶液中，后经洗涤、干燥，即完成对测定电极的修饰。
采用循环伏安法，利用上述生物传感器对水体中的无机三价砷进行检测。
实施例3：
一种用于检测无机三价砷的电化学生物传感器，该生物传感器包括工作电极、对电极及参比电极，工作电极为测定电极，对电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl电极。测定电极为金电极，测定电极的表面经核酸适配体修饰，核酸适配体的序列为5'-SH-ACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTC-Fc-3'。
测定电极的修饰方法包括以下步骤：
1)将测定电极用Al2O3粉抛光后，进行超声清洗，之后将测定电极浸入至H2SO4与H2O2的混合溶液中15min，再进行洗涤、干燥，进行预处理；之后采用循环伏安法，用H2SO4对测定电极进行活化，电位设置为-0.2-1.6V，速率为0.05V/S；
2)将活化后的测定电极浸入至含有核酸适配体的Tris-HCl缓冲溶液中(pH值为7)反应30h，之后对测定电极进行洗涤、干燥；
3)将测定电极浸入至MCH水溶液中，后经洗涤、干燥，即完成对测定电极的修饰。
采用电化学阻抗法，利用上述生物传感器对水体中的无机三价砷进行检测。
实施例4：
一种用于检测无机三价砷的电化学生物传感器，该生物传感器包括工作电极、对电极及参比电极，工作电极为测定电极，对电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl电极。测定电极为金电极，测定电极的表面经核酸适配体修饰，核酸适配体的序列为5'-SH-ACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTC-Fc-3'。
测定电极的修饰方法包括以下步骤：
1)将测定电极用Al2O3粉抛光后，进行超声清洗，之后将测定电极浸入至H2SO4与H2O2的混合溶液中10min，再进行洗涤、干燥，进行预处理；之后采用循环伏安法，用H2SO4对测定电极进行活化，电位设置为-0.2-1.6V，速率为0.05V/S；
2)将活化后的测定电极浸入至含有核酸适配体的Tris-HCl缓冲溶液中(pH值为7.5)反应24h，之后对测定电极进行洗涤、干燥；
3)将测定电极浸入至MCH水溶液中，后经洗涤、干燥，即完成对测定电极的修饰。
基于上述生物传感器的无机三价砷检测方法，包括以下步骤：
1)采用差示脉冲伏安法，将生物传感器浸入至一系列不同浓度的亚砷酸盐标准溶液中，测定不同浓度亚砷酸盐标准溶液的峰电流变化值，并绘制标准曲线；
2)将生物传感器浸入至待测溶液中，并测定待测溶液的峰电流变化值，比照标准曲线即可测得待测溶液中的无机三价砷浓度。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测无机三价砷的电化学生物传感器，其特征在于，该生物传感器包括测定电极，所述的测定电极的表面经核酸适配体修饰，所述的核酸适配体的序列为5'-SH-ACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTC-Fc-3'。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测无机三价砷的电化学生物传感器，其特征在于，所述的测定电极为金电极。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测无机三价砷的电化学生物传感器，其特征在于，所述的测定电极的修饰方法包括以下步骤：
1)对预处理后的测定电极进行活化；
2)将活化后的测定电极浸入至含有核酸适配体的缓冲溶液中反应18-30h，之后对测定电极进行洗涤、干燥；
3)将测定电极浸入至封闭液中，后经洗涤、干燥，即完成对测定电极的修饰。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测无机三价砷的电化学生物传感器，其特征在于，步骤1)中，所述的预处理过程为：将测定电极用Al2O3粉抛光后，进行超声清洗，之后将测定电极浸入至H2SO4与H2O2的混合溶液中5-15min，再进行洗涤、干燥。
5.根据权利要求3所述的一种用于检测无机三价砷的电化学生物传感器，其特征在于，步骤1)中，所述的活化过程为：采用循环伏安法，用H2SO4对测定电极进行活化，电位设置为-0.2-1.6V，速率为0.05V/S。
6.根据权利要求3所述的一种用于检测无机三价砷的电化学生物传感器，其特征在于，步骤2)中，所述的缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液，该缓冲溶液的pH值为7-8。
7.根据权利要求3所述的一种用于检测无机三价砷的电化学生物传感器，其特征在于，步骤3)中，所述的封闭液为MCH水溶液。
8.根据权利要求1所述的一种用于检测无机三价砷的电化学生物传感器，其特征在于，该生物传感器包括工作电极、对电极及参比电极，所述的工作电极为测定电极，所述的对电极为铂电极，所述的参比电极为Ag/AgCl电极。
9.一种基于如权利要求1至8任一项所述的生物传感器的无机三价砷检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)采用电化学分析方法，绘制标准曲线；
2)对待测溶液进行测定，比照标准曲线即可测得待测溶液中的无机三价砷浓度。
10.根据权利要求9所述的基于生物传感器的无机三价砷检测方法，其特征在于，所述的电化学分析方法包括循环伏安法、电化学阻抗法或差示脉冲伏安法中的一种。
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