CN102866185A - 基于g-四链体和金纳米颗粒制备生物传感器检测钾离子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于基于G-四链体和金纳米颗粒制备生物传感器检测钾离子的方法，属于生物传感器领域，所述的检测方法为利用对氨基苯硫酚（p-ATP）作为中介将金纳米颗粒修饰在金电极的表面，再通过巯基自组装作用将以二茂铁（Fc）标记的能形成G-四链体结构的DNA固定到金纳米颗粒的表面，作为适配体电化学生物传感器检测钾离子。本发明的优点在于简单快速，灵敏度高，可以对钾离子进行实时检测，对钾离子的最低检测浓度达到0.1mM，并且检测的线性范围较大。在0.1-1mM浓度范围内，方波伏安峰电流和钾离子浓度呈良好的线性关系；在1-30mM浓度范围内，方波伏安峰电流和钾离子浓度的对数呈良好的线性关系。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器领域，具体涉及一种基于G-四链体和金纳米颗粒制备生物传感器检测钾离子的方法。
背景技术
钾是人体内不可缺少的常量元素，在调节体液渗透压和酸碱平衡、维持细胞新陈代谢、保证神经肌肉的正常功能等方面发挥着重要作用。其含量是人体生理活动的重要指标，在血液和尿液中的存在水平对临床诊断尤为重要，因此钾离子含量的测定具有十分重要的意义。参考文献[1]Abd-Elgawad Radi and Ciara K.O’Sullivan.Aptamer conformational switch assensitive electrochemical biosensor for potassium ion recognition.Chem.Commun.,2006,3432–3434中记载，Abd-Elgawad Radi等人以二茂铁（Fc）标记的可以形成G-四链体结构的核苷酸链作为适配体构建电化学传感器检测钾离子。通过巯基自组装作用将二茂铁标记的K+适配体固定在金电极上，当未加入目标物质——K+时，适配体保持部分展开，二茂铁离电极距离远，电子传递能力弱，电化学信号小；当目标物质K+存在时，适配体形成G-四链体结构，发生构型转变，二茂铁离电极距离近，电子传递能力增强，电化学信号增大，从而实现对K+的测定。但是该法对K+的检测范围很窄，为0.1-1mM，远远不能满足现有技术发展的需求。
发明内容
本发明的目的是结合G-四链体和金纳米颗粒的信号放大作用，构建一种用于检测钾离子的新型电化学生物传感器。与之前基于G-四链体的电化学生物传感器相比，本发明可以达到较低的检测限（0.1mM）和更宽的检测范围（0.1-30mM）。
本发明提供的基于G-四链体和金纳米颗粒制备生物传感器检测钾离子的方法，包括如下步骤：
第一步，金电极的预处理；
第二步：对氨基苯硫酚p-ATP的配制：以无水乙醇为溶剂，向溶剂中加入p-ATP，得到p-ATP的乙醇溶液；
第三步：在金电极上修饰p-ATP：将第一步处理好的金电极在室温下浸泡于p-ATP乙醇溶液中；然后用乙醇和去离子水冲洗，氮气吹干；
第四步：在修饰了p-ATP的金电极上修饰金纳米颗粒；
第五步：DNA适配体的配制与准备；
第六步：在修饰了金纳米颗粒的金电极上修饰DNA适配体；
第七步：除去散乱修饰到金电极表面的DNA适配体；
第八步：进行钾离子的检测。
本发明的优点在于简单快速，灵敏度高，具体为：
（1）本发明提供的检测方法对于钾离子的最低检测浓度可以达到0.1mM，并且线性范围较大。在0.1-1mM浓度范围内，方波伏安峰电流和钾离子浓度呈良好的线性关系；在1-30mM浓度范围内，方波伏安峰电流和钾离子浓度的对数呈良好的线性关系；
（2）检测速度快，能实现对钾离子的实时检测，而且峰电流值稳定。
附图说明
图1：本发明中基于G-四链体和金纳米颗粒制备生物传感器检测钾离子的机理图；
图2：本发明中钾离子浓度的电化学检测图：（a）方波伏安图，检测电流与浓度之间的关系图；（b）浓度与方波峰电流的关系图；（c）浓度0.1-1mM和方波峰电流的线性关系图；（d）浓度1-30mM对数值和方波峰电流的线性关系图。
具体实施方式
下面将结合附图和实例对本发明作进一步的详细说明。
本发明提供的检测方法，是基于G-四链体和金纳米颗粒制备生物传感器检测钾离子的方法。其具体原理如下：
如图1所示，首先将金纳米颗粒修饰在金电极表面，其中对氨基苯硫酚（p-ATP）作为金电极表面与金纳米颗粒的链接中介，利用金纳米颗粒比表面积大的特点来增强电化学信号。再通过巯基自组装作用将以二茂铁（Fc）标记的能形成G-四链体结构的DNA（Fc-5'-TTTGGTTGGTGTGGTTGGTTT-3'-(CH2)6-SH）固定到纳米金颗粒的表面，作为适配体生物传感器检测钾离子。当未加入目标物质——K+时，适配体保持部分展开，二茂铁离电极距离远，电子传递能力弱，电化学信号小；当目标物质K+存在时，适配体形成G-四链体结构，发生构型转变，二茂铁离电极距离近，电子传递能力增强，电化学信号增大，从而实现对K+的测定。
基于以上原理，本发明的结合G-四链体和金纳米颗粒制备生物传感器检测钾离子的方法，具体步骤见实施例1：
第一步：金电极的预处理：
（1）在70°C条件下将金电极浸入体积比为3：1的浓H2SO4和H2O2组成的溶液（piranha）中清洗5分钟，然后用大量二次水冲洗。所述的H2O2质量分数为30%。
（2）金电极要连续的分别用1.0μm，0.3μm和0.05μm的氧化铝粉末在抛光布上抛光。
（3）将金电极在乙醇和二次水中超声清洗：乙醇中超声1分钟，在二次水中超声2分钟。
（4）金电极放在0.5mol L-1的H2SO4溶液中，在-0.2和+1.6V之间进行循环伏安扫描，直到获得典型的循环伏安谱图，这样一个干净的金电极就得到了。
第二步：对氨基苯硫酚（p-ATP）的配制：以无水乙醇为溶剂，向溶剂中加入p-ATP，得到含有10mM的p-ATP的乙醇溶液，该乙醇溶液在使用前配置，密封保存，以免液体挥发。
第三步：在金电极上修饰p-ATP：
将第一步处理好的金电极浸泡在10mM的p-ATP乙醇溶液中室温下放置24小时。然后用乙醇和去离子水冲洗，氮气吹干。
第四步：在修饰了p-ATP的电极上修饰金纳米颗粒：将制备好的15nm金纳米颗粒溶胶滴加到修饰了p-ATP的金电极表面，室温下放置24小时，直到电极表面的金纳米颗粒溶胶几乎干掉。用水冲洗，并用氮气吹干。
第五步：DNA适配体的配制与准备：将含有1mM三（2-羰基乙基）磷盐酸盐（TCEP）及1μM DNA的Tris-HCl缓冲溶液（pH 7.41）加热到90°C保持5分钟，然后逐渐冷却到室温。
第六步：在修饰了金纳米颗粒的电极上修饰DNA适配体：移取25μL DNA溶液滴加到第四步处理好的电极上，室温下在100%湿度条件下放置12小时，分别用Tris-HCl缓冲液和去离子水冲洗，氮气吹干。
第七步：除去散乱修饰到电极表面的DNA适配体：滴加25μL 1mM的6-巯基-1-己醇（MCH）到第六步处理好的电极表面，室温下在100%湿度条件下保持30分钟，然后分别用Tris-HCl缓冲液和去离子水冲洗，氮气吹干。
第八步：进行钾离子的检测：将第七步修饰好的电极放入含有不同浓度钾离子的溶液中，采用三电极体系，利用方波伏安法测量电流随电压的变化趋势。
本发明提供的检测方法对检测信号具有放大作用，通过结合G-四链体和金纳米颗粒制备生物传感器，利用方波伏安法来进行钾离子检测，以得到对钾离子的检测范围以及最低检测限。图2a和图2b出示了应用本发明的生物传感器检测钾离子的方波伏安图以及方波伏安峰电流和钾离子浓度的关系曲线。从图2a可以看出，方波伏安峰电流随着钾离子浓度的增加而增大。从图2c可看出，在0.1-1mM浓度范围内，方波伏安峰电流和钾离子浓度呈良好的线性关系，检测限为0.1mM。从图2d可看出，在1-30mM浓度范围内，方波伏安峰电流和钾离子浓度的对数呈良好的线性关系。
实施例2：
第一步：金电极的预处理：预处理过程同实施例1。
第二步：对氨基苯硫酚（p-ATP）的配制：以无水乙醇为溶剂，向溶剂中加入p-ATP，得到含有8mM的p-ATP的乙醇溶液，该乙醇溶液在使用前配置，密封保存，以免液体挥发。
第三步：在金电极上修饰p-ATP；
将第一步处理好的金电极浸泡在8mM的p-ATP乙醇溶液中室温下放置24小时。然后用乙醇和去离子水冲洗，氮气吹干。
第四步：在修饰了p-ATP的电极上修饰金纳米颗粒：将制备好的13nm金纳米颗粒溶胶滴加到修饰了p-ATP的金电极表面，室温下放置10小时，直到电极表面的金纳米颗粒溶胶几乎干掉。用水冲洗，并用氮气吹干。
第五步：DNA适配体的配制与准备：将含有1mM三（2-羰基乙基）磷盐酸盐（TCEP）及1μM DNA的Tris-HCl缓冲溶液（pH 7.41）加热到70°C保持10分钟，然后逐渐冷却到室温。
第六步：在修饰了金纳米颗粒的电极上修饰DNA适配体：移取15μL DNA溶液滴加到第四步处理好的电极上，室温下在100%湿度条件下放置12小时，分别用Tris-HCl缓冲液和去离子水冲洗，氮气吹干。
第七步：除去散乱修饰到电极表面的DNA适配体：滴加15μL 1mM的6-巯基-1-己醇（MCH）到第六步处理好的电极表面，室温下在100%湿度条件下保持30分钟，然后分别用Tris-HCl缓冲液和去离子水冲洗，氮气吹干。
第八步：进行钾离子的检测：将第七步修饰好的电极放入含有不同浓度钾离子的溶液中，采用三电极体系，利用方波伏安法测量电流随电压的变化趋势。
实验结果显示，方波伏安峰电流随着钾离子浓度的增加而增大。在0.1-1mM浓度范围内，方波伏安峰电流和钾离子浓度呈良好的线性关系，检测限为0.1mM。在1-30mM浓度范围内，方波伏安峰电流和钾离子浓度的对数呈良好的线性关系。
实施例3：
第一步：金电极的预处理：
同实施例1。
第二步：对氨基苯硫酚（p-ATP）的配制：以无水乙醇为溶剂，向溶剂中加入p-ATP，得到含有12mM的p-ATP的乙醇溶液，该乙醇溶液在使用前配置，密封保存，以免液体挥发。
第三步：在金电极上修饰p-ATP：
将第一步处理好的金电极浸泡在12mM的p-ATP乙醇溶液中室温下放置24小时。然后用乙醇和去离子水冲洗，氮气吹干。
第四步：在修饰了p-ATP的电极上修饰金纳米颗粒：将制备好的17nm金纳米颗粒溶胶滴加到修饰了p-ATP的金电极表面，室温下放置24小时，直到电极表面的金纳米颗粒溶胶几乎干掉。用水冲洗，并用氮气吹干。
第五步：DNA适配体的配制与准备：将含有1mM三（2-羰基乙基）磷盐酸盐（TCEP）及1μM DNA的Tris-HCl缓冲溶液（pH 7.41）加热到90°C保持5分钟，然后逐渐冷却到室温。
第六步：在修饰了金纳米颗粒的电极上修饰DNA适配体：移取25μLDNA溶液滴加到第四步处理好的电极上，室温下在100%湿度条件下放置12小时，分别用Tris-HCl缓冲液和去离子水冲洗，氮气吹干。
第七步：除去散乱修饰到电极表面的DNA适配体：滴加15μL 1mM的6-巯基-1-己醇（MCH）到第六步处理好的电极表面，室温下在100%湿度条件下保持30分钟，然后分别用Tris-HCl缓冲液和去离子水冲洗，氮气吹干。
第八步：进行钾离子的检测：将第七步修饰好的电极放入含有不同浓度钾离子的溶液中，采用三电极体系，利用方波伏安法测量电流随电压的变化趋势。
实验结果显示，方波伏安峰电流随着钾离子浓度的增加而增大。在0.1-1mM浓度范围内，方波伏安峰电流和钾离子浓度呈良好的线性关系，检测限为0.1mM。在1-30mM浓度范围内，方波伏安峰电流和钾离子浓度的对数呈良好的线性关系。
Claims (10)
1.基于G-四链体和金纳米颗粒制备生物传感器检测钾离子的方法，其特征在于：
第一步：金电极的预处理；
第二步：对氨基苯硫酚p-ATP的配制：以无水乙醇为溶剂，向溶剂中加入p-ATP，得到p-ATP的乙醇溶液；
第三步：在金电极上修饰p-ATP：将第一步处理好的金电极在室温下浸泡于p-ATP乙醇溶液中；然后用乙醇和去离子水冲洗，氮气吹干；
第四步：在修饰了p-ATP的金电极上修饰金纳米颗粒；
第五步：DNA适配体的配制与准备；
第六步：在修饰了金纳米颗粒的金电极上修饰DNA适配体；
第七步：除去散乱修饰到金电极表面的DNA适配体；
第八步：进行钾离子的检测。
2.根据权利要求1所述的基于G-四链体和金纳米颗粒制备生物传感器检测钾离子的方法，其特征在于：所述的金电极预处理，具体为：
(a)在70°C条件下将金电极浸入体积比为3：1的浓H2SO4和质量分数为30%的H2O2组成的溶液中清洗，然后用二次水冲洗；
(b)然后，金电极要连续的分别用1.0μm，0.3μm和0.05μm的氧化铝粉末在抛光布上抛光；
(c)然后将金电极在乙醇和二次水中超声清洗；
(d)最后，金电极在0.5mol L-1的H2SO4溶液中，在-0.2和+1.6V之间进行循环伏安扫描，直到获得典型的循环伏安谱图，这样一个干净的金电极就得到了。
3.根据权利要求1所述的基于G-四链体和金纳米颗粒制备生物传感器检测钾离子的方法，其特征在于：第二步中p-ATP的乙醇溶液的浓度为8-12mM。
4.根据权利要求1所述的基于G-四链体和金纳米颗粒制备生物传感器检测钾离子的方法，其特征在于：第三步中金电极浸泡在p-ATP的乙醇溶液中的时间为24小时以上。
5.根据权利要求1所述的基于G-四链体和金纳米颗粒制备生物传感器检测钾离子的方法，其特征在于：第四步具体为：将制备好的金纳米颗粒溶胶滴加到修饰了p-ATP的金电极表面，室温下放置10小时以上，直到金电极表面的金溶胶干掉；用水冲洗，并用氮气吹干。
6.根据权利要求1所述的基于G-四链体和金纳米颗粒制备生物传感器检测钾离子的方法，其特征在于：所述的金纳米颗粒的直径为13-17nm。
7.根据权利要求1所述的基于G-四链体和金纳米颗粒制备生物传感器检测钾离子的方法，其特征在于：第五步具体为：将含有1mM三（2-羰基乙基）磷盐酸盐及1μM DNA的Tris-HCl缓冲溶液加热70-90℃，恒温保持5-10分钟，然后逐渐冷却到室温。
8.根据权利要求1所述的基于G-四链体和金纳米颗粒制备生物传感器检测钾离子的方法，其特征在于：第六步具体为：移取15-25μL DNA适配体溶液滴加到第四步处理好的金电极上，在100%湿度条件下室温放置12小时以上，分别用Tris-HCl缓冲液和去离子水冲洗，氮气吹干。
9.根据权利要求1所述的基于G-四链体和金纳米颗粒制备生物传感器检测钾离子的方法，其特征在于：第七步具体为：滴加15-25μL 1mM的MCH到第六步处理好的电极表面，在100%湿度条件下室温放置30分钟，然后分别用Tris-HCl缓冲液和去离子水冲洗，氮气吹干。
10.根据权利要求1所述的基于G-四链体和金纳米颗粒制备生物传感器检测钾离子的方法，其特征在于：第八步中利用方波伏安法对不同浓度的钾离子进行测量，扫描范围是0-0.6V。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130109 |